CC BY
11
УДК 636.52/612:015.31:015.32
Бугай А.О., к. вет. н., докторант ([email protected]) ® Нацюнальний утверситет бюресурав та природокористування Украти, м. Кигв
ТРАНСПОРТ ГЛЮКОЗИ ТА АКТИВН1СТЬ ЙОННИХ ПОМП БАЗОЛАТЕРАЛЬНИХ МЕМБРАН АБСОРБЦ1ЙНИХ ЕНТЕРОЦИТ1В КУРЧАТ-БРОЙЛЕР1В ЗА ДП Л1КОПЕНУ
Дослгджено ¡нтенсивтсть транспорту глюкози через базолатеральш мембрани абсорбцшних клтин та активтсть йонних помп, асоцшованих з цим макродоменом абсорбцшних клтин курчат-бройлер1в. Встановлено зростання активност1 транспортних АТФаз та поглинання глюкози везикульованими препаратами базолатеральних мембран ентероцит1в порожньо! кишки курчат-бройлер1в за дИ лшопену.
Ключовi слова: курчата-бройлери, абсорбцшш ентероцити, плазмолема, транспортш властивост1.
Вступ. Транспорт низькомолекулярних речовин у внутршне середовище оргашзму е одним з найважливших етатв травлення в порожнш кишщ. Лiмiтуючим фактором у цих процесах е функщональна здатшсть базолатеральних мембран (БМ) абсорбцшних ентероциив [10, 11], оскшьки щшьшсть розташування та активнiсть ензимiв i транспортерiв цього макродомену плазмолеми зумовлюють величину потоку нутрiентiв.
У той же час, проведен нами рашше дослiдження показали пiдвищення активност глiкозидаз аmкально! мембрани (АМ) [1, 7] та штенсивност залежного транспорту глюкози через бiшар АМ [6] ентероциив порожньо! кишки курчат-бройлерiв за ди лiкопену, що потребуе вивчення фармакодинамжи цiеl сполуки на рiвнi ензимiв та транспортерiв БМ абсорбцшних кл^ин.
Мета роботи. Дослщити активнiсть Na+,K+- АТФази, Сa2+,Mg2+- АТФази та поглинання глюкози везикульованими препаратами БМ абсорбцшних ентероциив порожньо! кишки курчат-бройлерiв за впливу лжопену.
Матер1али 1 методи дослщження. Дослiдження проводились на кафедрi терапи i клмчно! дiагностики Нацiонального унiверситету бiоресурсiв i природокористування Украши.
Об'ектом дослiдження були курчата-бройлери кросу "Конкурент-3" 14-42-добового вжу, що утримувались у клiтках з 1-добового вiку на збалансованому за поживними речовинами ращош, який змшювався згiдно технологiчного графiку. Курчатам дослщно! групи, починаючи з 5-добового вжу, щодоби перорально вводили розчин лжопену в соняшниковiй оли (вiд 0,1 до 0,5 мл) у встановленш оптимальнш дозi. Курчатам контрольно! групи аналопчним шляхом вводили соняшникову олш.
Для дослiджень проводили забiй курчат у вщ 14, 21, 28, 35 та 42 дiб. Евтаназш курчат проводили шляхом декапiтацi!, вранщ, без попереднього
Науковий консультант - д.б.н., професор, академж НААН Украши М.1. Цвшховський ® Бугай А.О., 2011
голодування. Отримання абсорбцшних ентероциив порожньо! кишки проводили хiмiчним (ЕГТА/цитрат) методом, БМ - Mg2+-прециmтацiею тсля попереднього видiлення АМ [3]. Мембранш фракци ресуспендували в розчиш такого складу (мМ): 300 маншт, 20 HEPES-трiс, 0,1 MgSO4, рН = 7,4.
В мембранних препаратах визначали вмiст загального бiлку за методом Лоур1 Ферментативну активнiсть Ш+,К+-АТФази (КФ 3.6.3.9), Сa2+,Mg2+- АТФази (КФ 3.6.3.8) та Mg2+-АТФази (КФ 3.6.3.1) визначали за рекомендащями Болдирева в авторськш модифжаци. Принцип И полягае у вимiрюваннi в забуференому середовищi вмiсту вивiльненого неорганiчного фосфату при гiдролiзi АТФ за методом Ратбуна-Бетлах, що дозволяе уникнути несправжньо завищеного результату завдяки попередженню кислотного гiдролiзу лабiльних фосфатних естерiв.
Поглинання глюкози везикульованими препаратами БМ абсорбцiйних ентероциив дослiджували методом швидко! фшьтраци [4, 9] в авторськш модифжаци. II суть полягае в глюкозооксидазнш детекци вмiсту глюкози завдяки багаторазовому збшьшенню концентраци мембранних препаратiв та реагенив дослiдних середовищ.
Статистичну обробку результат дослiджень проводили з використанням паке™ програм Ехсе1-97 i Statistica 6.0.
Результати дослщжень. Проведенi нами дослiдження передбачають iнтенсифiкацiю транспортних процесiв через плазмолему абсорбцшних ентероциив курчат-бройлерiв i пiдвищення !х енергетичного статусу за дп лiкопену.
Вiдомо, що основна функцiя №+,К+-АТФази полягае у вщкачуванш йонiв Na+ з цитозолю ентероциив, якi поступають туди при функцюнуванш ко-траспортних переносникiв низькомолекулярних сполук (глюкоза, амшокислоти, тощо), через БМ у мiжклiтинну рiдину. При цьому витрачаеться енергiя гiдролiзу АТФ. Тому ферментативна актившсть Na+,K+-АТФази в БМ абсорбцшних ентероциив характеризуе як енергетичний статус цих кл^ин, так i iнтенсивнiсть №-залежних транспортних механiзмiв через АМ.
Вжова динамiка активностi №+,К+-АТФази БМ абсорбцiйних ентероцитiв порожньо! кишки курчат-бройлерiв характеризуеться зниженням вiд 14-1 до 42-1 дiб !х вирощування в 1,34 раза (Р<0,05) (рис. 1). При цьому вiдмiчаеться перюд пiдвищення ферментативно! активностi Na+,K+-АТФази з 14-1 до 28-1 дiб в 1,5 раза, (Р<0,05) i перюд зниження цього показника - з 28-1 до 42-1 дiб в 2,1 рази, (Р<0,05). Це може бути основною причиною зниження функцюнального стану оргашзму курчат-бройлерiв пiсля 28 дiб !х вирощування, що було встановлено в наших попередшх дослщженнях [1, 3, 7].
За дп лiкопену встановлено пiдвищення порiвняно з контролем активностi Na+,K+-АТФази БМ абсорбцшних ентероциив 14-добових курчат-бройлерiв у 2,2 раза (Р<0,05). Вiкова динамiка ферментативно! активност Na+,K+-АТФази БМ абсорбцiйних ентероциив курчат-бройлерiв, як i в контроле характеризуеться зниженням в 1,9 раза (Р<0,05). При цьому також встановлений перюд тдвищення активностi Na+,K+-АТФази з 14-1 до 28-1 дiб вирощування курчат-бройлерiв в 1,7 раза, (Р<0,05) i перiод II зниження з 28-1 до 42-1 дiб вирощування в 2,8 рази, (Р<0,05).
14,00
I
| 12,00
ю
2 10,00
X
и
к/
V 8,00
л
ч
2 6,00 (С
ё 4,00 "¡5
и
2,00
0,00
Рис. 1. Активн1сть ^+,К+-АТФази БМ абсорбцшних ентероцит1в порожньо1 кишки курчат-бройлер1в впродовж 1\ вирощування за дй' л1копену.
Примiтка: - Р < 0,05 - даш вiрогiднi мiж показниками контрольно! i дослщно! груп курчат-бройлерiв одного вжу.
Слщ зазначити, що актившсть №+,К+-АТФази БМ абсорбцшних ентероциив курчат-бройлер!в дослщно! групи перевищувала цей показник пор1вняно з контролем з 14-! до 28-! д1б вирощування в середньому в 2,1 раза (Р<0,05), а на 35-у i 42-у доби вирощування - в середньому в 1,6 раза (Р<0,05). Отримаш даш вказують на певну вщмшшсть у ди лжопену на експресш №+,К+-АТФази БМ абсорбцшних ентероциив курчат-бройлер1в або опосередкований його вплив через змшу лшщного складу мембранного бшару [5, 8]. Також ми не виключаемо наявшсть в БМ абсорбцшних ентероцит1в курчат-бройлер1в ряду 1зофермент1в №+,К+-АТФази [5], яю вщповщають потребам регуляци водно-електрол1тного балансу ентероциив.
1нша йонна помпа - Са2+^2+-АТФаза виконуе функци тдтримання стало! внутршньокл^инно! концентраци Са2+ шляхом його екструзи з ентероциту [8, 10, 11]. Динамжа активност Са2+^2+-АТФази в БМ абсорбцшних ентероциив курчат-бройлер1в характеризуеться зниженням вщ 14-! до 42-! д1б вирощування птищ у 2 рази (Р<0,05) (табл. 1).
При цьому не встановлено в1рогщно! р1знищ м1ж показниками активносп Са2+^2+-АТФази в БМ абсорбцшних ентероциив курчат-бройлер1в у вщ 14-и i 21-! д1б. Загалом, для Сa2+,Mg2+-АТФази нами встановлена та ж вжова тенденщя, яка властива Na+,K+-АТФазi БМ абсорбцшних ентероцит1в, що вказуе на зниження енергозабезпечення цих клiтин i зменшення iнтенсивностi виведення цитозольного кальцiю. Зважаючи на важливу роль йонiв Са2+ в процесах апоптозу i некрозу кл^ин, ми передбачаемо зменшення порогу чутливост абсорбцiйних ентероцитiв
14 21 28 35 42
Вк, дiб
порожньо1 кишки курчат-бройлерiв до ди негативних факторiв, яю призводять до 1х загибелi. Тобто, це е ще одним доказом зниження штенсивност процесiв мембранного травлення в курей iз збiльшенням 1х вiку.
Табл. 1.
Активн1сть Сa2+,Mg2+-АТФази плазмолеми абсорбцшних ентероцит1в порожньо1 кишки курчат-бройлер1в впродовж 1х вирощування за дй' лжопену, __нмольх(хвхмг бшка)"1. _ (М±т, п=4)._
В1к, д1б Контрольна група Дослщна група
14 24,83±1,22 28,60±1,03*
21 23,65±1,04 28,05±0,83*
28 17,75±0,46 26,45±0,40*
35 14,25±0,34 22,55±0,43*
42 12,00±0,16 17,33±0,30*
Примггка: - даш в1ропдш (Р<0,05) мгж показниками контрольно! 1 дослщно! груп курчат-бройлер1в одного в1ку.
За ди лiкопену встановлено пiдвищення активност Сa2+,Mg2+-АТФази в БМ абсорбцiйних ентероциив 14-добових курчат-бройлерiв у 1,15 раза (Р<0,05) порiвняно з контролем. Динамжа цього показника за впливу лжопену характеризуеться поступовим невiрогiдним зниженням з 14-! до 28-! дiб вирощування курчат-бройлерiв та вираженим зниженням (в 1,5 раза, Р<0,05) - з 28-1 до 42-1 дiб. При цьому актившсть Сa2+,Mg2+-АТФази БМ абсорбцшних ентероцитiв курчат-бройлерiв дослщно1 групи впродовж всього перюду вирощування була вищою за контроль: на 14-у i 21-у доби вирощування 1,15 раза (Р<0,05) i в 1,19 раза (Р<0,05), вiдповiдно, а на 28-, 35- та 42-у доби - в 1,5 раза (Р<0,05), 1,6 раза (Р<0,05) i 1,4 раза (Р<0,05), вiдповiдно. Не виключено, що лiкопен може збiльшувати експресiю кальмодулшу, який е фiзiологiчним активатором Сa2+,Mg2+-АТФази БМ ентероциив [9, 11]. Тобто, за ди лiкопену вiдбуваеться бiльш штенсивне виведення кальцiю у мiжклiтинну рщину, що вказуе як на кращий функцiональний стан абсорбцiйних ентероцитiв, так i на краще забезпечення потреб оргашзму курчат-бройлерiв кальцiем.
Основним шляхом переносу глюкози та iнших моносахаридiв через БМ абсорбцiйного ентероциту в мiжклiтинний простiр е полегшена дифузiя, яка опосередкована транспортером GLUT-2 [4, 6, 10]. Цей транспортер транслокуе моносахариди з високою штенсившстю та низькою аффiннiстю i вважаеться головним регуляторним елементом всього процесу травлення вуглеводiв [10, 11].
Онтогенетична динамжа поглинання глюкози БМ абсорбцшних ентероциив курчат-бройлерiв, аналопчно цьому показнику для АМ, характеризуеться зменшенням вiд 14-1 до 42-1 дiб вирощування в 1,4 раза (Р<0,05) (табл. 2). При цьому, максимальне зниження штенсивност поглинання глюкози препаратами БМ встановлено в 21- та 28- добових курчат-бройлерiв - у 1,19 раза (Р<0,05) та 1,12 раза (Р<0,05), вщповщно. Таким чином, пiсля 21-1 доби онтогенезу курчат-бройлерiв встановлено значне зниження штенсивност надходження моносахаридiв з порожнини кишкового каналу у внутршне середовище птицi, на що вказують показники трансмембранного переносу глюкози як через АМ, так i через БМ абсорбцшних ентероциив.
Онтогенетична динамжа константи дифузи глюкози через БМ, аналопчно АМ, характеризуемся тдвищенням вiд 14-1 до 42-1 дiб вирощування курчат-бройлерiв у 1,33 раза (Р<0,05) (див. табл. 2). Слiд зазначити, що цi змiни не були вiрогiдними в жодний перiод спостереження. Ми вважаемо, що збшьшення пасивного потоку глюкози через мембранний бшар БМ абсорбцшних ентероцитiв компенсуе онтогенетичне зниження штенсивност полегшено! дифузи. Ймовiрно, важливу роль у цьому явищi може вiдiгравати фосфолiпiдна композицiя БМ абсорбцшних ентероципв.
Застосування лiкопену курчатам-бройлерам призводить до тдвищення iнтенсивностi полегшено! дифузи глюкози у везикульоваш препарати БМ абсорбцшних ентероциив 14-добово! птищ в 1,6 раза (Р<0,05) (див. табл. 2). Цей феномен може бути зумовлений зростанням експреси GLUT-2 за впливу лжопену.
Табл. 2.
¡нтенсившсть транспорту глюкози (пМ/мг х с) та константи дифузй (нЛ/мг х с) у везнкулярнi препарати БМ абсорбцшних ентероциив курчат-бройлерiв _ впродовж i*x вирощування за дй* лiкопену, (M±m, n=4)_
BiR, д1б Транспорт глюкози Kd
контрольна дослщна контрольна дослщна
група група група група
14 1708,00±49,70 2686,00±38,40 26,40±2,38 23,10±2,12
21 1376,00±32,70 2521,00±36,40 28,11±2,70 25,54±2,43
28 1214,00±27,50 2512,00±33,10 31,74±2,97 27,16±2,69
35 1127,00±26,80 2120,00±29,50 34,81±3,10 30,22±2,98
42 1097,00±27,60 1978,00±28,30 35,10±3,12 34,82±3,22
Примггка: - даш в1ропдш (Р<0,05) мгж показниками контрольно! i дослвдно!" груп курчат-бройлер1в одного вiку.
Онтогенетична динашка iнтенсивностi поглинання глюкози везикульованими препаратами БМ абсорбцшних ентероциив курчат-бройлерiв за дй лшопену, аналогiчно контролю, характеризуеться зниженням вщ 14-! до 42-! дiб вирощування птицi в 1,26 раза (Р<0,05) (див. табл. 2). Слщ зазначити, що впродовж всього перюду дослiдження iнтенсивнiсть поглинання глюкози препаратами БМ абсорбцшних ентероциив курчат-бройлерiв за дй лiкопену була вищою за контроль у 1,8-2,0 рази (Р<0,05).
Висновки. Вiкова динамiка штенсивносп транспорту йонiв (натрiю, калiю, кальцш та магнiю) та глюкози через бшар базолатеральних мембран ентероцитiв порожньо! кишки курчат-бройлерiв характеризуеться зменшенням, що зумовлено зниженням активност вiдповiдних ферменив та транспортерiв.
Застосування лiкопену призводить до зростання штенсивносп транспортних процеЫв за участi вказаних катiонiв та глюкози, що передбачае вищу функцюнальну здатнiсть базолатеральних мембран абсорбцiйних ентероциив курчат-бройлерiв та бiльш ефективнi процеси травлення.
Л^ература
1.Бугай, А. Вплив лжопену на активнiсть глiкозидаз аткально! мембрани абсорбцiйних ентероцитiв курчат-бройлерiв в онтогенезi // А. Бугай // Науковi доповiдi НУБiП Укра!ни, 2011-3 (25) http: //www.nbuv.gov.ua/ e-journals/Nd/2011 3/11bao.pdf.
2.Бугай, А. Вплив лжопену на 6ioxiMi4Hi показники KpoBi та picT курчат-бpойлеpiв / А. Бугай // Науковий вкник ЛНАВМтБТ îm. С.З. Гжицького. - 2008. -Т. 10, 3 (38), Ч. 2. - С. 14-19.
3.Бугай, А. Фосфолшщний склад базолатеральних мембран абсорбцшних ентеpоцитiв куpчат-бpойлеpiв за впливу лiкопену / А. Бугай // Ветеринарна бютехнолопя. - 2011. - № 18. - С. 18-26.
4.Barfull, А. Ontogenetic expression and regulation of Na+-D-glucose cotransporter in jejunum of domestic chicken / А. Barfull, С. Garriga, М. Mitjans // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. - 2002. - V. 282 (3). - P. 559-564.
5.Blanco, G. Isozymes of the Na-K-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in function / G. Blanco, R. Mercer // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. -1998. - V. 275. -P. 633-650
6.Bugay, A. Rate of D-glucose Na+-depend uptake by brush-border vesicles of chicken jejunal absorptive cells under action of lycopene / А. Bugay, М. Tsvilikhovskii // Украшський бiохiмiчний журнал. - 2010. - Т. 82, № 4 (додаток 1). - С. 53.
7.Bugay, A. Developmental aspects of lycopene action to disaccharidases kinetic parameters of chicken jejunal brush border / А. Bugay, М. Tsvilikhovskii // FASEB Journal. - 2010. - P. 539.13.
8.Gal-Garber, O. Nutrient transport in the small intestine: Na,K-ATPase expression and activity in the small intestine of the chicken as influenced by dietary sodium / O. Gal-Garber, S. Mabjeesh, D. Sklan et al. // Poultry Science. - 2003. - V. 82. - P. 1127-1133.
9.Garriga, C. Heat stress increases apical glucose transport in the chicken jejunum / C. Garriga, R. Hunter, C. Amat et al. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. - 2006. - V. 290. - P. 195-201.
10. Karasov, W. Adaptive regulation of sugar and amino acid transport by vertebrate intestine / W. Karasov, J. Diamond // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. - 1983. - V. 245. - P. 443-462.
11. Stevens, В. Vertebrate intestine apical membrane mechanisms of organic nutrient transport / B. Stevens // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. - 1992. -V. 263. - P. 458-463.
Summary Bugay A.O.
National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine, Kyiv GLUCOSE TRANSPORT AND ION PUMP ACTIVITY OF BASOLATERAL MEMBRANE OF BROILER CHICKEN ABSORPTIVE CELLS UNDER
ACTION OF LYCOPENE
Intensity of glucose transport and ions pumps activity of basolateral membrane of broiler chicken jejunal absortive enterocytes was researched. Increasing of these processes under action of lycopene was stated.
Key words: broiler chicken, absorptive enterocytes, plasma membrane, transport features.
Рецензент - к.б.н., проф. Галяс В.Л.
