CC BY
21
УДК 615.277.3.012.1:616-006-092
И.Д. Трещалин, Э.Р. Переверзева, Е.Б. Исакова, М.И. Трещалин, Е.В. Возняковская, Т.Б. Переверзева, С.Н. Лавренов
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ЛХТА-1975 НА ОСНОВЕ ХЛОРИД ТРИС (1-ПЕНТИЛ-1Н-ИНДОЛ-3-ИЛ) МЕТИЛИЯ - НОВЫЙ ЭФФЕКТИВНЫЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ ПРЕПАРАТ
ФГБНУ «НИИНА им. Г.Ф. Гаузе», Москва
Контактная информация
Иван Дмитриевич Трещалин, канд. мед. наук, зав. лабораторией фармакологии и химиотерапии адрес: 119021 Москва, улица Б. Пироговская, д. 11, стр. 1; тел.+7(499)255-23-92 e-mail: idtivan@yandex.ru
Статья поступила 16.10.2015, принята к печати 27.11.2015.
Резюме
Исследована противоопухолевая активность и проведено доклиническое токсикологическое изучение фармацевтической композиции ЛХТА-1975, содержащей в качестве основного действующего компонента хлорид трис (1-пентил-1Н-индол-3-ил) метилия. Достоверный ростингибирующий эффект показан на мышах с лимфолейкозом Р-388, аденокарциномой молочной железы АК-755 и меланомой В-16. По данным токсикологических исследований препарат имеет значительный интервал между лечебными и токсическими дозами, что потенциально делает его интересным для дальнейшего изучения. При применении в дозах, в 5-10 раз превышающих терапевтические, композиция не вызывала токсических изменений в органах и тканях.
Ключевые слова: хлорид трис(1-пентил-1Н-индол-3-ил)метилия, трииндолилметан, перевиваемые опухоли, токсикологическое исследование, фармацевтическая композиция.
I.D. Treshalin, E.R. Pereverzeva, E.B. Isakova, M.I. Treshalin, E. V. Voznyakovskaya, T3. Pereverzeva, S.N. Lavrenov COMPOSITION OF LHTA-1975, BASED ON TRIS
(1-PENTYL-1H-INDOL-3-YL)METHILIUM CHLORIDE - NEW EFFECTIVE ANTITUMOR DRUG
FSBSI Gause Institute of New Antibiotics, Moscow
Abstract
The antitumor activity and pre-clinical toxicology of pharmaceutical composition of LHTA-1975, containing as the main active component tris(1-pentyl-1H-indol-3-yl)methilium chloride were studied. Significant growth inhibitory effect was shown on mouse lymphocytic leukemia P-388, breast adenocarcinoma AK-755, and melanoma B-16. According to toxicological studies, the drug has a significant interval between therapeutic and toxic doses, which potentially makes it interesting for further study. When used in doses 5-10 times higher than therapeutic, the composition did not cause toxic changes in organs and tissues.
Key words: tris(1-pentyl-1H-indol-3-yl)methilium chloride, triindolylmethanes, transplantable tumors, toxicology study, pharmaceutical composition.
Введение
Разработка новых высокоэффективных малотоксичных мишень-направленных химиопрепаратов для лечения онкологических больных является весьма актуальной задачей.
В ФГБНУ «НИИНА» разработан мишень-направленный препарат ЛХТА-1975 из класса производных трииндолилметана (рис. 1), который индуцирует апоптоз опухолевых клеток и влияет на ядерный фактор ОТкВ [1; 3-6; 9].
Для повышения растворимости соединения разработана фармацевтическая композиция ЛХТА-1975, содержащая в качестве основного действующего компонента хлорид трис(1-пентил-1Н-индол-
3-ил)метилия (10 % масс.) и вспомогательное вещество Твин-80 (90 % масс.).
В статье приводятся основные результаты предклинического исследования композиции ЛХТА 1975, включающие следующие аспекты:
• характеристику противоопухолевых свойств;
• острую токсичность на мышах и крысах;
• хроническую токсичность на крысах.
Материалы и методы
Экспериментальные модели
Работа выполнена в соответствии с этическими нормами обращения с животными, приня-
46 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ...
тыми Европейской Конвенцией по защите позво- Токсикологические исследования ночных животных, используемых для исследова- Острая токсичность тельских и иных научных целей [7]. Токсикологические исследования проводили Исследование проведено на мышах BDFj в соответствии с «Руководством по проведению массой 20-22 г и крысах Wistar массой 120-140 г, доклинических исследований лекарственных самцах и самках (питомник «Андреевка» РАН). средств» под ред. А.Н. Миронова [2]. Животные содержались в виварии ФГБНУ Острую токсичность препарата на мышах «НИИНА» в специальных пластиковых клетках на BDF1 и крысах Wistar самцах исследовали по мето-рационе брикетированных экструзированных кор- ду Литчфилда и Уилкоксона при однократном мов со свободным доступом к питьевой воле. внутривенном введении. Экспериментальными моделями опухолей Фармацевтическую композицию вводили мышей служили лимфолейкоз Р-388 и солидные: однократно внутривенно мышам в диапазоне доз от аденокарцинома молочной железы мышей АК-755 5 до 10 мг/кг, а крысам - в диапазоне доз от 3 до 7 и меланома В-16. мг/кг. Скорость введения составляла не более 0,5 Лимфолейкоз Р-388 перевивали внутрибрю- мл в 1 минуту. Дозы рассчитывали в миллиграммах шинно; аденокарциному молочной железы мышей действующего вещества на килограмм массы тела АК-755 и меланому В-16 перевивали под кожу бока животных. Наблюдение за состоянием и поведени-по 1х106 клеток на мышь в соответствии с обще- ем животных производили в течение 3 часов после принятыми стандартными методами [2]. введения препаратов и далее ежедневно в течение одного месяца. Отмечали количество павших жи-Расчет доз вотных и сроки их гибели. Расчет доз, характери-вводимоой фармацевтической композиции. зующих токсичность, проводили при помощи ком-Вводимые дозы фармацевтической компози- пьютерной программы «StatPlus-2006». ции при изучении токсичности и противоопухолевой активности рассчитывали по количеству дейст- Хроническая токсичность вующего вещества, т.е. 1 г композиции с содержа- Испытуемую фармацевтическую вводили нием (хлорида трис(1-пентил-1Н-индол-3- крысам Wistar внутрибрюшинно ежедневно в тече-ил)метилия) 10 % масс. рассматривался как 100 мг ние 15 дней в дозах 0,2 и 0,4 мг/кг, что, соответст-действующего вещества. венно, суммарно составляет МПД и ЛД50 для крыс при однократном внутривенном введении. В каче-Дозы и режим введения стве контроля использовали 0,25 %-ный р-р при изучении противоопухолевой активности Твин/80 в 0,9 %-ном р-ре натрия хлорида. Фармацевтическую композицию ЛХТА-1975 растворяли в изотоническом растворе хлорида на- Параметры исследования трия и в 0,025 %-ной концентрации вводили мы- Ежедневно следили за состоянием и поведе-шам при помощи шприца однократно внутривенно нием животных, 1 раз в неделю определяли массу в дозах 2,5; 5,0 и 7,0 мг/кг, многократно - ежеднев- тела, при помощи автоматического гематологиче-но с 1 по 5 сутки, начиная через 24 часа после пере- ского анализатора «Abacus Junior Vet» (Австрия) вивки опухоли. При многократном применении производили клинический анализ крови. Биохими-препарат вводили внутрибрюшинно. При лечении ческое исследование сыворотки крови производили мышей с лимфолейкозом Р-388 использовали разо- при помощи автоматического анализатора «Chem вые дозы 0,5; 1,0 и 1,5 мг/кг. В опытах на мышах с Well» (США). Исследование суточного диуреза и солидными опухолями (аденокарциномой молоч- клинического анализа мочи проводили при помощи ной железы АК-755 и меланомой В-16) использова- автоматического анализатора «Laura Smart» (Че-ли наименьшую дозу, проявившую достоверную хия). На 1 и 30 сутки после курса введений препа-активность в отношении лимфолейкоза Р-388, ко- рата животных забивали, производили вскрытие, торая составляла 0,5 мг/кг. определяли массовые коэффициенты внутренних органов, кусочки органов фиксировали в 10 %-ном Противоопухолевая активность р-ре нейтрального формалина. Срезы окрашивали Показателями противоопухолевого эффекта гематоксилин-эозином и подвергали световой мик-служили: увеличение средней продолжительности роскопии. жизни (УПЖ, %) леченых животных по сравнению с контролем, торможение роста опухоли (ТРО, %) у Статистическая обработка леченых животных по сравнению с контролем. полученных результатов ТРО% определяется по формуле: Для выполнения экспериментов составляли группы численностью, достаточной для проведения (Т — С) статистического анализа и расчета показателей ТрО,% — хШ0^ где достоверности. Для всех количественных данных С вычислены групповое среднее арифметическое (М) и стандартная ошибка среднего (SEM). Различия Т - средний °бъём опухоли у легсшых потных; между контрольными и экспериментальными груп-С - среднии объём опухоли в контроле. пап/ пами считаются достоверными при 95 %-ном уров-
№ 4/том 14/2015 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
не значимости (р<=0,05) Статистическая обработка данных выполнена с помощью программы Statistica for Windows 5.5.
Результаты и обсуждение
Противоопухолевая активность
При однократном внутрибрюшинном применении мышам с внутрибрюшинно перевитым лимфолейкозом Р-388 препарат противоопухолевой активности не проявляет при применении во всём изученном диапазоне доз (2,5; 5,0 и 7,0 мг/кг).
При курсовом пятидневном внутрибрюшин-ном введении в разовых дозах 0,5; 1 и 1,5 мг/кг (курсовые дозы 2,5; 5,0 и 7,0 мг/кг) препарат вызывает увеличение средней продолжительности жизни животных с лимфолейкозом Р-388 на 46; 49 и 59%, соответственно (рис. 2).
Препарат, применённый мышам с аденокар-циномой молочной железы АК-755 в дозе 0,5 мг/кг ежедневно в течение 5 дней (суммарная доза составила 1/4 от МПД), проявляет выраженную достоверную противоопухолевую активность, которая сохраняется в течение 15 суток после перевивки опухоли (ТРО на 11 сутки составляло 81 %; на 15 сутки - 71 %; рис. 3).
При применении в той же дозе и режиме мышам с меланомой В-16 препарат проявляет выраженную противоопухолевую активность (ТРО =97-79 %), которая сохранялась до 18 суток после перевивки опухоли (ТРО составляло 64 %; рис. 4).
Доклинические
токсикологические испытания
фармацевтической композиции ЛХТА 1975
Острая токсичность
Данные, полученные при изучении острой токсичности LXTA-1975 как на мышах (табл. 1), так и на крысах (табл. 2), показали, что препарат, введенный внутривенно в летальных дозах, вызывает гибель животных в сроки от нескольких минут до 1 ч после введения. При вскрытии павших животных обнаружено полнокровие органов брюшной полости и легких. Сердце в систоле. Полученные данные позволяют предположить, что причиной смерти животных является сердечно-сосудистая недостаточность, вызванная нейротоксическим действием, и возникшая на этом фоне тканевая гипоксия.
Расчётные дозы, характеризующие острую токсичность фармацевтической композиции ЛХТА-1975 представлены в табл. 3.
Хроническая токсичность
Результаты исследования хронической токсичности показали, что препарат хорошо переносится животными, не влияет на общее количество лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, гематокрит и содержание гемоглобина, а также морфологический состав периферической крови крыс. Препарат примененный в дозах, суммарно составляющих расчётные МПД (ЛД10) и ЛД50 для крыс, не оказывал влияния на биохимические показатели сыворотки крови
животных, функции почек и сердечно-сосудистой системы. Важно отметить, что испытанные в хроническом эксперименте разовые дозы в 2-4 раза превышают расчётные терапевтические дозы для крыс [8]. При вскрытии животных как на 1, так и 15 сутки после окончания курса введений макроскопических патологических изменений внутренних органов не обнаружено. Массовые коэффициенты внутренних органов подопытных животных не отличались от таковых группы контроля.
При патоморфологическом исследовании на 1 сутки после курса введения фармацевтической композиции (доза 0,4 мг/кг в течение 15 дней) в печени крыс выявлены возникновение умеренного отека вокруг центральных вен и жировая дистрофия гепато-цитов (рис. 5, А-Б). Введение препарата в разовой дозе 0,2 мг/кг вызывало умеренную жировую дистрофию гепатоцитов вокруг некоторых триад на 1 сутки после окончания 15-дневного курса.
На 30 сутки наблюдения изменения в ткани печени в обеих подопытных группах не отличались от таковых контроля.
Композиция, применённая в дозе 0,4 мг/кг, на 1 сутки после курса введений вызывала сильный периваскулярный отек, утолщение париетального листка капсулы некоторых клубочков, расположенных в зоне отека, появление мелких очагов деструкции эпителия извитых канальцев (рис. 6, А-Б).
На 30 сутки эксперимента у некоторых животных сохранялись единичные очаги деструкции извитых канальцев почек с признаками организации. Введение препарата в дозе, суммарно составляющей МПД, не оказывало влияния на структуру органа.
Применение композиции в обеих изученных дозах приводило к активации клеток Панета в подвздошной кишке, которая выражалась в увеличении их числа в криптах желез и резком увеличении количества и интенсивности окраски эозинофильных гранул в цитоплазме (рис. 7, А-Б). Активация носила стойкий характер и сохранялась в течение месяца.
Выводы
Фармацевтическая композиция ЛХТА-1975 проявляет значимую достоверную противоопухолевую активность в отношении перевиваемых опухолей мышей Р-388, АК-755 и В-16. Максимальные результаты были получены на меланоме В-16.
На мышах с лимфоцитарной лейкемией Р-388 при однократном применении даже в дозе 7 мг/кг, близкой к МПД, фармацевтическая композиция ЛХТА-1975 противоопухолевой активности не проявляет. При курсовом введении эффективной суммарной дозой при лечении Р-388 является 2,5 мг/кг, что составляет 1/4 от МПД.
Фармацевтическая композиция обладает малой токсичностью. Даже при применении в суммарной дозе, равной однократной ЛД50, фармацевтическая композиция ЛХТА-1975 не влияет на показатели периферической крови, биохимический состав сыворотки крови животных, функцию почек и сердечно-сосудистой системы животных.
Таблица 1
Зависимость токсического эффекта от дозы ЛХТА-1975 для мышей
Группа № Доза (мг/кг) % павших мышей Срок гибели
1 5 0 -
2 8 16,6 1 час
3 8,5 50 3-8 мин
4 9 66,6 1-3 мин
5 9,5 83,3 1-3 мин
4 10 100 «На игле»
Таблица 2
Зависимость токсического эффекта от дозы ЛХТА-1975 для крыс
Группа № Доза (мг/кг) % павших крыс Срок гибели
1 3 0 -
2 4 33,3 1 час
3 5 50 5-15 мин
4 6 83,3 3-7 мин
5 7 100 «на игле»
4 9 100 «на игле»
Таблица 3
Расчётные дозы, характеризующие острую токсичность фармацевтической композиции ЛХТА-1975
Дозы, характеризующие токсичность Мыши Крысы
Дозы, мг/кг
ЛД50 9,2 (8,2-10,2) 4,7 (3,8-5,7)
МПД (ЛДю) 7,3(6,6-8,0) 2,98(2,66-3,1)
ЛД16 7,8 3,3
ЛД84 10,7 6,1
ЛД100 11,4 6,8
Рис. 1. Структурная формула препарата ЛХТА-1975, хлорида трис (1-пентил-Ш-индол-3-ил) метилия.
Рис. 2. Противоопухолевая активность препарата ЛХТА1975 на мышах с лимфолейкозом Р-388 при пятидневном введении.
90
Сутки после перевивки опухоли
Рис. 3. Противоопухолевая активность фармацевтической композиции ЛХТА-1975 в дозе 0,5 мг/кг*5/24 на мышах с АК-755.
120
11 15 18
Сутки после перевивка опухоли
Рис. 4. Противоопухолевая активность фармацевтической композиции ЛХТА1975 с меланомой В-16.
А
Рис. 5. Печень крысы, х40:
А - интактный контроль;
Б - композиция 0,4 мг/кг х 15/24, 1-е сутки после курса: жировая дистрофия гепатоцитов вокруг триады.
Б
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ. 51
■ Шк " . • - ■ - >1№яВШЖ .г- - "• < • * ' * ' \ ■ • ' г .«. ••• .......•:■-••.-. " ■ - - г« , - ; , , • ^ '- -.л* чЯм • .....$1 - ? .>ч -лгуч» • ;н г* 4* ж* «- • ТпГтаМгИт А ■ ^ , ЯНВЙИ - Ч; ■ ^ ' ......_ • - ■ : " 1 V*. у, ' . ■;. 1 . .'•с?- » , у. , ■ лл^л'^^^ш^К 1' ? С Ф- ^Ш» Б Рис. 6. Почка крысы. *20: А - интактный контроль; Б - композиция 0,4 мг/кг х 15/24, 1-е сутки после курса: корковая зона; сильн^1й периваскулярн^1й отек; капсула клубочка утолщена, очаги деструкции эпителия извитых канальцев.
№ 4/том 14/2015 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
Б
Рис. 7. Подвздошная кишка крысы, х40: А - интактный контроль;
Б - композиция 0,2 мг/кг х 15, 1-е сутки после курса: активация клеток Панета.
Фармацевтическая композиция, примененная в дозе, суммарно составляющей ЛД50, вызывает обратимые повреждения тканей печени и почки. При введении композиции в дозе, суммарно составляющей МПД, умеренные обратимые изменения возникают только в печени.
В остальных органах и тканях патологических изменений не найдено.
Особенностью фармацевтической композиции ЛХТА-1975 является её способность активировать клетки Панета в подвздошной кишке.
Литература
1. Исакова Е.Б., Трещалин И.Д., Бодягин Д.А., Лавренов С.Н., Преображенская М.Н., Переверзева Э.Р. Новое соединение из класса трииндолилметанов, обладающее противоопухолевой активностью // Российский биотерапевтический журнал. - 2012. - Т. 11, № 2. - С. 22.
2. Миронов А.Н., Бунатян Н.Д., Васильев А.Н. и др. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. - М.: Гриф и К, 2012. - Ч. 1. - 944 с.
3. Мирчинк E.П., Тренин, A£., Галатенко О.А. и др. Соли трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия — новый класс противоопухолевых соединений // Известия Академии наук. Серия химическая. - 2010. - № 12. - С. 2203.
4. Соломко Э.Ш., Лавренов С.Н., Иншаков А.Н и др. Хлорид трис(1-пентил-1Н-индол-3-ил)метилия вызывает гибель клеток меланомы in vitro по типу аутофагии // Саркомы костей, мягких тканей и опухоли кожи. - 2012. - № 3. - С. 48-53.
5. Тренин А.С., Цвигун Е.А., Бычкова О.П., Лавренов С.Н. Микробная модель Halobacterium Salinarum в отборе синтетических аналогов антибиотика турбомицина А, обладающих противоопухолевым действием // Антибиотики и химиотерапия. - 2013. - Т. 58, № 9-10. - С. 3-7.
6. Трещалина Е.М. Противоопухолевая активность веществ природного происхождения. - М.: Практическая медицина, 2005. - 272 с.
7. European Convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes. Council of Europe, 1986. ETS No. 123.
8. Freireich E.J., Gehan E.A., Rail D.P. et al. Quantitative comparison of toxicity of anticancer agents in mouse, rat, dog, monkey and man // Cancer Chemother. Repts. - 1966. - 50(4). - P. 219-44.
9. Lavrenov S.N., Luzikov Y.N., Bykov E.E. et al. Synthesis and cytotoxic potency of novel tris(1-alkylindol-3-yl)methylium salts: Role of N-alkyl substituents // Bioorganic and Medicinal Chemistry. - 2010. - № 18. - Р. 6905-13.
