CC BY
35
УДК 615.033/034:615.277.3 ШИФР СПЕЦИАЛЬНОСТЬ
https://doi.org/10.30895/2221-996X-2019-19-3-169-177 14.03.09 Клиническая иммунология, аллергология
14.03.06 Фармакология, клиническая фармакология
Фармакокинетика рекомбинантного человеческого фактора некроза опухоли альфа в составе средства доставки
А. В. Батенева*, О. В. Симакова, С. Г Гамалей, Е. А. Волосникова, Л. Р Лебедев, Е. Д. Даниленко
Институт медицинской биотехнологии Федерального бюджетного учреждения науки
«Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
ул. Химзаводская, д. 9, Бердск, Новосибирская область, 633010, Российская Федерация
Основными проблемами использования фактора некроза опухоли альфа (ФНО-альфа) в противоопухолевой терапии являются его быстрая деградация в кровеносном русле и ограниченная селективность накопления в ткани опухоли. В ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора создана биодеградируемая молекулярная конструкция, обеспечивающая защиту от протеаз и адресную доставку белков в ткань опухоли. На основе этой конструкции разработан противоопухолевый препарат, содержащий рекомбинантный ФНО-альфа человека (рчФНО-альфа). Цель работы: изучить фармакокинетику рчФНО-альфа в средстве доставки при его однократном введении. Материалы и методы: препарат рчФНО-альфа в средстве доставки вводили самкам аутбредных мышей ICR (CD-1) однократно внутривенно в двух эффективных противоопухолевых дозах 2,55 мкг и 5,1 мкг на 20 г массы тела. Концентрацию ФНО-альфа в сыворотке крови и супернатантах гомогенатов органов, взятых в разные сроки после введения, определяли имму-ноферментным методом. Результаты: полученные кривые изменения содержания в крови ФНО-альфа удовлетворительно описывались уравнением для двухчастевой модели без всасывания. Быстрая фаза процесса выведения из крови приходилась на период 0-4 ч, медленная — 4-24 ч. Наиболее высоким удельное содержание белка было в ткани кожи, селезенке и почках. Расчет фармакокинетических параметров указал на то, что наиболее высокие значения тканевой доступности fT были установлены для почек и кожи; более длительно (в соответствии с данными MRT) препарат удерживался в почках, печени и коже. Процесс элиминации препарата в основном завершался к концу первых суток после введения. Выводы: рчФНО-альфа в средстве доставки при однократном внутривенном введении мышам в диапазоне эффективных доз быстро элиминировался из крови и распределялся по тканям внутренних органов. Основными органами распределения препарата являлись кожа, почки и селезенка. Процесс элиминации препарата из крови носил двухфазный характер и в основном завершался к концу первых суток. Ключевые слова: фармакокинетика; фактор некроза опухоли альфа; молекулярная конструкция; аут-бредные мыши; средства доставки
Для цитирования: Батенева АВ, Симакова ОВ, Гамалей СГ, Волосникова ЕА, Лебедев ЛР, Даниленко ЕД. Фармакокинетика рекомбинантного человеческого фактора некроза опухоли альфа в составе средства доставки. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2019;19(3):169-177. https://doi. org/10.30895/2221-996X-2019-19-3-169-177
*Контактное лицо: Батенева Алена Владимировна; [email protected]
Pharmacokinetics of Recombinant Human Tumor Necrosis Factor Alpha in the Delivery System
A. V. Bateneva*, O. V. Simakova, S. G. Gamaley, E. A. Volosnikova, L. R. Lebedev, E. D. Danilenko
Institute of Medical Biotechnology of the Federal Budgetary Research Institution «State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector», 9 Khimzavodskaya St., Berdsk, Novosibirsk oblast 633010, Russian Federation
The main problems of using TNF-alpha in antitumor therapy are its rapid degradation in the bloodstream and the limited selectivity of accumulation in the tumor tissue. The SRC VB «Vector» developed a biodegradable molecular construct that provides protection against proteases and ensures targeted delivery of proteins to the tumor tissue. This construct was used to create an antitumor drug containing recombinant human TNF-alpha (rhTNF-alpha). The aim of the study was to analyse rhTNF-alpha pharmacokinetics in the delivery system after a single administration. Materials and methods: the rhTNF-alpha drug carried by the delivery system was intravenously administered to female outbred ICR (CD-1) mice only once at two effective antitumor doses, 2.55 ^g and 5.1 ^g / 20 g of body weight. The concentration of TNF-alpha in the serum and supernatants of organ homoge-nates, obtained at different time points after administration, was analysed by immunoenzyme assay. Results: the obtained curves of TNF-alpha concentration in the blood were satisfactorily described by the equation for the two-compartment model without absorption. The rapid phase of elimination from the blood took 0-4 h, the slow one — 4-24 h. The highest specific content of protein was observed in the skin, spleen, and kidneys tissue. The calcula-
(CC) ]
tion of pharmacokinetic parameters demonstrated that the highest values of tissue availability fT were obtained for the kidneys and skin; the drug was retained for longer periods of time in the kidneys, liver and skin (according to the MRT data). As a rule, complete elimination of the drug was observed by the end of the first day after administration. Conclusions: rhTNF-alpha carried by the delivery system was quickly eliminated from the blood and distributed in the internal organ tissues after a single intravenous administration to mice in the effective doses range. The main organs in which rhTNF-alpha was distributed were skin, kidneys, and spleen. The elimination of the drug from the blood was a two-phase process which was generally over by the end of the first day. Key words: pharmacokinetics; tumor necrosis factor alpha; molecular construct; outbred mice; delivery system
For citation: Bateneva AV, Simakova OV, Gamaley SG, Volosnikova EA, Lebedev LR, Danilenko ED. Pharmacokinetics of recombinant human tumor necrosis factor alpha in the delivery system. BIOpreparaty. Profilaktika, diagnostika, lechenie = BIOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2019; 19(3): 169-177. https://doi. org/10.30895/2221-996X-2019-19-3-169-177
Corresponding author: Alena V. Bateneva; [email protected]
Поиск эффективных средств и способов лечения онкологических заболеваний является одной из актуальных задач современной медицины. Иммунотерапия, в частности цитокино-терапия, приобретает все большую значимость среди методов лечения злокачественных новообразований. Среди цитокинов можно выделить фактор некроза опухоли альфа (ФНО-альфа), интерес к которому связан с наличием выраженных противоопухолевых свойств — способностью оказывать цитотоксиче-ское действие на опухолевые клетки, повреждать опухолевые сосуды, вызывать геморрагический некроз широкого спектра опухолей, активировать иммунный противоопухолевый ответ [1-3]. Однако быстрая деградация белка в кровеносном русле, а также ограниченная селективность накопления белка в ткани опухоли обусловливают необходимость его многократных инъекций для поддержания эффективной дозы. При этом системное введение ФНО-альфа в высоких дозах сопровождается разнообразными токсическими эффектами (гипотензия, почечная недостаточность, повышение свертываемости крови и т. д.) [4, 5], что ограничивает использование препарата в клинической практике. Одним из возможных способов решения данной проблемы является создание транспортных форм для адресной доставки ФНО-альфа к клеткам-мишеням. Использование этих систем позволяет повысить стабильность молекулы белка в кровеносном русле, усилить противоопухолевую активность за счет уменьшения деградации и более интенсивного накопления в ткани опухоли, снизить системную токсичность за счет введения более низких доз по сравнению со свободным белком [6-11].
В качестве средства для транспортировки белков группой ученых ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребназдора была разработана и исследована двухслойная молекулярная конструкция. В центральной части конструкции, ядре, содержится полину-клеотидный материал, представленный двуспиральной РНК из дрожжей БассЬаготусвз cerevisiae и покрытый оболочкой из конъюгата спермидин-полиглюкин (декстран) [12, 13]. Все компоненты данной конструкции обладают способностью к биодеградации, биологической активностью и низкой токсичностью. Самосборка конструкции осуществляется за счет разнополярного ионного взаимодействия между ее компонентами. В дальнейшем разработанный метод был использован
для получения частицы, несущей на своей поверхности реком-бинантный человеческий ФНО-альфа (рчФНО-альфа) [14-16]. В экспериментах на мышах было показано, что рчФНО-альфа в составе частицы был менее токсичным, чем свободный белок. В ходе изучения противоопухолевой активности было показано торможение роста опухоли у мышей в дозах в 10100 раз меньших, чем после инъекций ФНО-альфа. Эффект был обусловлен более длительной циркуляцией препарата в крови и более интенсивным его накоплением в ткани опухоли в ранние сроки после введения [17-19].
Цель работы — изучить фармакокинетику лекарственной формы рекомбинантного человеческого ФНО-альфа в составе средства доставки при однократном внутривенном введении мышам в диапазоне эффективных противоопухолевых доз.
Материалы и методы
Для изучения фармакокинетики использовали препарат готовой лекарственной формы рчФНО-альфа в средстве доставки, лиофилизат для приготовления раствора для внутривенного введения производства Института медицинской биотехнологии (ИМБТ) ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Содержание ФНО-альфа в препарате составило 0,16 мг/мл, дсРНК — 0,09 мг/мл, специфическая (цитолитическая) активность — 3,1106 МЕ/мл, в качестве наполнителя использовали D-маннит в концентрации 47,4 мг/мл. Серия препарата была аттестована в лаборатории контроля качества ИМБТ ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора на соответствие проекту нормативной документации.
В основу дизайна исследования были положены методические рекомендации по проведению фармакокинетики лекарственных средств1. Исследование проводили на здоровых самках белых аутбредных мышей ICR (CD-1) с массой тела 18-22 г. Животные были получены из питомника ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора и прошли период адаптационного карантина. До начала и в ходе эксперимента мыши содержались в стандартных условиях вивария при естественном освещении на сбалансированном пищевом рационе со свободным доступом к корму и воде. Условия содержания и ухода за животными соответствовали действующим нормативным документам2. Все манипуляции с животными проводили согласно Протоко-
1 Методические рекомендации по проведению доклинических исследований фармакокинетики лекарственных средств. В кн.: Миронов АН, ред. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч. 1. М.: Гриф и К; 2012. С. 845-55.
Оценка фармакокинетики и проявлений токсических эффектов. В кн.: Миронов АН, ред. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч. 2. М.: Гриф и К; 2012. С. 252-3.
2 СП 2.2.1.3218-14 от 29 августа 2014 г. № 51 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)».
ГОСТ 33215-2014 Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур.
ГОСТ 33216-2014 Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами.
800000
5 ui ,-J 700000
с
: I
■e- ÎXi 600000
О
6 г: 500000
a С
e (J
S 400000
§ я a
300000
= "я
S
g é 200000
M
100000
МЛ*
* **
4=ш
o.o:
o.os
0,5
Время после введения, ч Tiiue after administration, Ii
Рис. 1. Динамика изменения концентрации ФНО-альфа в сыворотке крови мышей в течение 1 ч после однократного внутривенного введения препарата рчФНО-альфа. □ — минимальная эффективная доза (ЭДтп); ■ — максимальная эффективная доза (ЭДтах).
* статистически значимое отличие от контроля; ** статистически значимое отличие от группы ЭДтп, р < 0,05.
Fig. 1. Dynamic pattern of TNF-alpha concentration in the serum of mice within 1 h after a single intravenous administration of the rhTNF-alpha drug. □ — minimum effective dose (EDmin); ■ — maximum effective dose (EDmax).
* statistically significant difference from control; ** statistically significant difference from group EDmin, p < 0.05.
лу-заявке № 62 от 12.09.2016 на работу с лабораторными животными, утвержденному Биоэтической комиссией ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Исследование было выполнено согласно основным регулирующим стандартам в области надлежащей лабораторной практики3.
Самки мышей были разделены на группы: 2 опытные (по 30 особей в каждой группе) и 2 контрольные (по 5 особей); по критерию массы тела, разброс показателя которой внутри группы не должен был превышать 10 %. Препарат вводили животным однократно внутривенно (в хвостовую вену). Дозы препарата были выбраны из диапазона эффективных доз, установленных при изучении противоопухолевой активности. Мышам первой опытной группы вводили препарат в минимальной эффективной дозе (ЭДт|п) — 2,55 мкг белка (5-10 4 МЕ) на 20 г веса мыши. Мышам второй опытной группы вводили максимальную эффективную дозу (ЭДтах) — 5,1 мкг белка (1-10 5 МЕ) на 20 г веса мыши. Контрольные животные получали внутривенные инъекции физиологического раствора.
Через 0,02 (1 мин), 0,08 (5 мин), 0,5 (30 мин), 1, 4 и 24 ч после внутривенного введения препарата рчФНО-альфа (опытные группы) и через 4 ч после введения физиологического раствора (группа контроля) у мышей забирали на анализ образцы крови, внутренних органов (печень, почки, селезенка), ткань мышцы и кожи. Органы и ткани взвешивали. Образцы забирали у 5 животных в группе на каждый срок исследования. Выбор периферических тканей осуществляли таким образом, чтобы среди объектов были ткани, отличающиеся по степени васкуляризации. Из образцов крови получали сыворотку путем центрифугирования при 3000 об/мин, 4 °С в течение 15 мин. Сыворотку крови и органы замораживали и хранили при температуре минус 20-25 °С.
Перед анализом образцы органов и тканей размораживали и готовили 10 % гомогенаты в охлажденном физиологическом растворе с помощью системы для гомогенизации <^^-Со1»
(США). Гомогенаты центрифугировали при 10 000 об/мин, 4 °C в течение 20 мин и отбирали супернатанты для анализа. Концентрацию ФНО-альфа в образцах сыворотки крови и супернатантах гомогенатов определяли твердофазным им-муноферментным методом с помощью коммерческих наборов реагентов «альфа-ФНО-ИФА-БЕСТ» (АО «Вектор-Бест», р. п. Кольцово, Новосибирская область) согласно инструкции по применению.
Полученные результаты обрабатывали с помощью пакета программ «Statgraphics, Vers. 5.0» (Statistical Graphics Corp., США). Рассчитывали следующие параметры описательной статистики: среднюю арифметическую величину, дисперсию, стандартное отклонение, минимальное и максимальное значения, размах, коэффициенты асимметрии (Skewness) и эксцесса (Kurtosis), медиану, стандартную ошибку. В связи с малыми объемами выборок для оценки значимости межгрупповых различий применяли непараметрический Н-критерий Краскела-Уоллиса. При обнаружении статистически значимых различий проводили сравнения с помощью двухвыборочного U-критерия Манна-Уитни. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез (р) принимали равным 0,05. Экспериментальные данные представлены в виде средней арифметической величины и стандартной ошибки.
На основании полученных результатов количественного определения ФНО-альфа проводили проверку гипотезы линейности путем регрессионного анализа и расчет фармако-кинетических параметров с использованием метода частевых моделей [17]. Характеристику распределения ФНО-альфа по органам описывали согласно рекомендациям по анализу данных фармакокинетики4 путем расчета следующих параметров: AUC0-24 — площадь под кривой «концентрация-время» в интервале 0-24 ч методом наименьших квадратов; MRT — среднее время удержания препарата в организме; fT — тканевая доступность.
3 Приказ Минздрава России от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики». ГОСТ 33044-2014 Принципы надлежащей лабораторной практики.
4 Методические рекомендации по проведению доклинических исследований фармакокинетики лекарственных средств. В кн.: Миронов АН, ред.
Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч. 1. М.: Гриф и К; 2012. С. 845-55.
Таблица 1. Содержание ФНО-альфа в сыворотке крови мышей после однократного внутривенного введения препарата рчФНО-альфа
Table 1. TNF-alpha concentration in the serum of mice after a single intravenous administration of the rhTNF-alpha drug
Время после инъекции, ч Time after injection, h Содержание ФНО-альфа TNF-alpha concentration
ЭД "min EDmin ЭД "max EDmax
Концентрация, пг/мл Concentration, pg/mL % от введенной дозы % of administered dose Концентрация, пг/мл Concentration, pg/mL % от введенной дозы % of administered dose
0,02 314 586 ± 30 088a 12,3 309369 ±12152a 6,1
0,08 269 889 ± 8233a 10,6 699 648 ± 46 714ab 13,7
0,5 152 197 ± 8884a 6,0 360 258 ± 75 371ab 7,1
1 100 801 ± 14 422a 4,0 180 406 ± 9936ab 3,5
4 166 ± 19a 0,007 1015 ± 181ab 0,020
24 3,48 ± 1,59 0,0001 6,09 ± 2,74 0,0001
Примечание. ЭДт|п — минимальная эффективная доза; ЭДтах — максимальная эффективная доза. a Статистически значимое отличие от контроля; b статистически значимое отличие от группы ЭДт|п, р < 0,05. Note. ED — minimum effective dose; ED — maximum effective dose.
min ' max
a Statistically significant difference from control; b statistically significant difference from group EDmin, р < 0.05.
Результаты и обсуждение
Динамика изменения концентрации ФНО-альфа в сыворотке крови мышей после однократного внутривенного введения препарата рчФНО-альфа в средстве доставки представлена на рисунке 1 и в таблице 1.
Анализ полученных данных показал, что в первой точке (через 1 мин после введения) содержание ФНО-альфа в крови мышей, получавших ЭДт|п препарата, было максимальным из зарегистрированных в этой группе. Концентрация белка была равна 314 586 пг/мл и составляла 12,3 % от величины введенной дозы (рис. 1, табл. 1). В дальнейшем наблюдалось снижение уровня ФНО-альфа в крови: в период 0,08-1 ч в 1,2-3,1 раза, через 4 ч — в 1895 раз, а через 24 ч показатель снижался до значения контрольной группы (в контроле — 4,66 ± 0,39 пг/мл).
Несколько иной была динамика показателя в группе мышей после введения препарата в ЭД. Концентрация белка
в крови, взятой через 1 мин после введения препарата, была равна 309 369 пг/мл, что составило 6,1 %% от введенной дозы препарата. Максимальное из зарегистрированных значение содержания белка в крови мышей данной группы наблюдалось через 5 мин и составляло 699 648 пг/мл (13,7 % от введенного). Такая динамика, на наш взгляд, свидетельствует о возможности быстрого проникновения и распределения препарата рчФНО-альфа в органах и тканях в первые минуты после введения с последующим обратным выходом в кровеносное русло. В последующие сроки, через 0,5 и 1 ч после введения, происходило снижение показателя в 1,9 и 3,9 раза соответственно относительно максимального значения. К концу четырехчасового периода наблюдения концентрация ФНО-альфа в сыворотке крови мышей второй опытной группы составляла 1015 пг/мл белка, к концу первых суток статистически не отличалась от контроля 4,66 ± 0,39 пг/мл.
Тот факт, что повышенный уровень ФНО-альфа в крови животных сохраняется в течение по меньшей мере 4 ч после
Время после введения, Ч
Time after administration. Il
Рис. 2. Зависимость концентрации ФНО-альфа в сыворотке крови мышей от времени после однократного внутривенного введения препарата рчФНО-альфа (в полулогарифмических координатах). 1 — минимальная эффективная доза (ЭДт|1); 2 — максимальная эффективная доза (ЭДтзх).
Fig. 2. TNF-alpha concentration in the serum of mice as a function of time after a single intravenous administration of rhTNF-alpha (in semi-logarithmic coordinates). 1 — minimum effective dose (EDmin); 2 — maximum effective dose (EDmax).
введения препарата рчФНО-альфа, согласуется с результатами, полученными нами ранее [17]. Согласно этим данным, внутривенное введение мышам ФНО-альфа в составе средства доставки приводило к повышению его уровня и удлинению периода циркуляции в кровеносном русле по сравнению со свободным ФНО-альфа. На наш взгляд, одним из возможных объяснений является то, что ФНО-альфа в средстве доставки является более устойчивым к протеазам крови.
Полученные данные зависимости концентрации ФНО-альфа в крови мышей от времени не удалось линеаризовать в полулогарифмических координатах (рис. 2). Однако экспериментальные точки удовлетворительно аппроксимировались уравнением, описывающим двухчастевую линейную модель без всасывания:
ОД = А1 е-а< + А2е-в', (1)
где ОД — концентрация ФНО-альфа в сыворотке крови мышей в момент времени ?, пг/мл;
А1 и А2 — количество ФНО-альфа, которое выводится из 1 мл сыворотки крови, соответственно, в первой и второй фазах процесса элиминации, пг/мл;
а и р — комплексные параметры, пропорциональные константе скорости выведения препарата в первой и второй стадиях процесса;
е — основание натурального логарифма (2,71828).
Анализ экспериментальных данных показал, что кинетика процесса выведения препарата из кровеносного русла характеризуется наличием быстрой (0-4 ч) и медленной (4-24 ч) фаз (рис. 2). Основная часть препарата элиминировалась в течение первых 4 ч после введения — 99,99 и 99,98 % при введении ЭДт|п и ЭДтах соответственно. Формы фармакокинетических кривых после введения обеих доз существенно не отличались друг от друга.
Фармакокинетические параметры, рассчитанные с помощью уравнения (1), приведены в таблице 2.
Расчеты показали, что количество препарата, которое выводилось из крови в быстрой фазе процесса (А1), различалось для ЭДт|п и ЭДтах в 2 раза. В медленной фазе (А2) процесса количество выводимого препарата в группе при введении ЭДтах было в 7,8 раза больше.
Время полураспределения Р в обеих группах было меньше времени полувыведения Р из крови, т. е. препарат довольно
Таблица 2. Расчетные фармакокинетические параметры препарата рчФНО-альфа Table 2. Calculated pharmacokinetic parameters of the rhTNF-alpha drug
Исследуемый параметр, размерность Tested parameter, units Краткое обозначение Symbol Расчетная величина Calculated value
ЭД "mm EDmin ЭД "max EDmax
Площадь под кривой «концентрация-время», пг-ч/мл Area under the curve, pgh/mL auc0_24 351213 724453
Количество препарата, которое выводится в быстрой фазе (а-фаза), пг/мл Amount of drug eliminated during the rapid phase (а-phase), pg/mL А 994031 1 990673
Количество препарата, которое выводится в медленной фазе (р-фаза), пг/мл Amount of drug eliminated during the slow phase (p-phase), pg/mL А2 360 2824
Комплексный параметр, пропорциональный константе скорости элиминации в быстрой фазе, ч-1 Complex parameter proportional to the elimination rate constant in the rapid phase, h-1 a 3,77 4,09
Комплексный параметр, пропорциональный константе скорости элиминации в медленной фазе, ч-1 Complex parameter proportional to the elimination rate constant in the slow phase, h-1 в 0,193 0,256
Время полураспределения препарата, ч Drug distribution half-life, h t a 1 1/2 0,184 0,169
Время полувыведения препарата, ч Drug elimination half-life, h t в 1/2 3,59 2,71
Константа скорости выведения из центральной камеры (1) в камеру (2), ч-1 Elimination rate constant from central compartment (1) to compartment (2), h-1 к 12 0,024 0,080
Константа скорости выведения из периферической камеры (2) в камеру (1), ч-1 Elimination rate constant from peripheral compartment (2) to compartment (1), h-1 k21 0,194 0,261
Константа скорости элиминации препарата, ч-1 Elimination rate constant, h-1 kel 3,75 4,01
Стационарный объем распределения, мл Steady-state volume of distribution, mL ^ss 2,88 3,34
Общий клиренс, мл/ч Total body clearance, mL/h c/T 9,6 10,3
Примечание. ЭДт|п — минимальная эффективная доза; ЭДтах — максимальная эффективная доза. Note. ED — minimum effective dose; ED — maximum effective dose.
min ' тяу
быстро выводился из крови в а-фазе процесса и медленно покидал русло крови в р-фазе. Время полураспределения Ра1/2 при введении обеих доз препарата было практически одинаковым, в то время как время полувыведения ?в1/2 при введении дозы ЭДт|п было большим (на 0,88 ч, или 52 мин) по сравнению с показателем в группе с введением ЭДтах.
Значения стационарного объема распределения препарата не превышали объем внеклеточной жидкости животного (около 20 % массы тела), а константы скорости проникновения препарата из крови и высоковаскуляризированных тканей (условно отнесенных к «центральной камере») в периферические ткани («периферическая камера») к12 были в несколько раз ниже константы скорости обратного выведения к21 Эти данные свидетельствует о слабом накоплении препарата в периферических тканях.
Константы скорости элиминации ке| значительно превосходили константы скорости выведения из центральной камеры к12, что позволяет сделать заключение о преобладании процесса элиминации из организма над проникновением препарата в периферические ткани.
Полученные данные свидетельствуют о том, что дозы введенного препарата мало влияли на характер выведения препарата из организма мышей, что подтверждают фармакокине-тические кривые (рис. 2).
В результате проверки гипотезы линейности было установлено, что свободный член уравнения линейной регрессии площади под кривой «концентрация-время» незначимо отличается от нуля (р = 0,0112), что позволяет сделать вывод о линейности фармакокинетики препарата в диапазоне использованных доз (рис. 3).
Данные распределения ФНО-альфа по органам и тканям представлены в таблице 3.
Анализ результатов показал, что удельное содержание ФНО-альфа в органах зависело от его дозы: уровень показателя в группе мышей, получавших большую дозу препарата, в основном был выше (табл. 3). Лишь в ткани мышцы значения показателя статистически не отличались от уровня фона на протяжении всего периода наблюдения, что свидетельствует об отсутствии у препарата способности к накоплению в скелетных мышцах после однократного внутривенного введения (данные не приведены).
Максимальное содержание ФНО-альфа после введения препарата в обеих дозах было обнаружено в исследуемых органах в основном в период с 0,08 до 0,5 ч. В последующие
сроки значение показателя постепенно снижалось и к концу наблюдения приближалось к контрольному (фоновый уровень). Исключением были почки и печень, где концентрация белка в конечной точке наблюдения после введения ЭДтах все еще превышала контрольное значение в 5,4 и 2,7 раза соответственно.
Динамика распределения ФНО-альфа в органах имела некоторые особенности в зависимости от дозы препарата. Так, в ткани почек животных группы ЭДт|п величина показателя колебалась в пределах 169-302 пг/г ткани в течение 4 ч после введения. В группе животных, получавших ЭДтах, в этот же период содержание ФНО-альфа в почках было примерно в два раза выше (267-680 пг/г ткани). Максимальные уровни ФНО-альфа в ткани кожи мышей второй опытной группы были отмечены в течение первого часа после введения (1793-2672 пг/г ткани) и превышали показатели первой группы в 8,6-14,6 раза. Удельное содержание белка в селезенке в течение первого часа наблюдения в группе ЭДтах было выше, чем после введения ЭДтП в 2,0-2,3 раза. В печени мышей первой опытной группы в период с 0,08 до 1 ч были обнаружены незначительные количества введенного ФНО-альфа, в то время как у животных второй группы уровень показателя в этот срок статистически значимо отличался от контроля.
Таким образом, анализ динамики распределения ФНО-альфа по тканям внутренних органов после введения препарата рчФНО-альфа показал, что наиболее высоким был уровень его накопления тканями селезенки, почек и кожи в течение первого часа после введения.
Это заключение было подтверждено рассчитанными фар-макокинетическими параметрами, отражающими суммарную концентрацию, интенсивность проникновения и длительность удержания препарата периферическими тканями (табл. 4).
При сравнительном анализе оказалось, что показатель суммарной концентрации AUC0 24 в органах в целом отражает прямую зависимость от дозы введенного препарата, хотя в ткани почек при введении большей дозы уровень параметра на 16 % ниже, что отразилось и на показателе тканевой доступности fT.
Среднее время удержания препарата в крови MRT оказалось невысоким и составило 0,64 ч (38 мин) для обеих доз. В селезенке и коже этот показатель снижался при увеличении дозы рчФНО-альфа в 2 и 1,4 раза соответственно. Длительность удержания препарата почками составила 6-9 ч, тканью кожи — 2,5-3,6 ч. Наименьшее и наибольшее время присут-
Доза рчФНО-альфа, мкг/20 г rhTNF-alpha dose, mg/20 g
Рис. 3. Зависимость AUC0-24 от дозы рчФНО-альфа в средстве доставки. AUC — площадь под кривой «концентрация-время». Fig. 3. AUC0-24 as a function of rhTNF-alpha dose in the delivery system. AUC — area under the curve.
Таблица 3. Удельное содержание ФНО-альфа (пг/г ткани) в органах и тканях мышей в разные сроки после однократного внутривенного введения препарата рчФНО-альфа
Table 3. Specific content of TNF-alpha (pg/g of tissue) in organs and tissues of mice at different time points after a single intravenous administration of the rhTNF-alpha drug
Орган/ Ткань Organ/ Tissue Содержание ФНО-альфа (пг/г ткани) в органах и тканях мышей контрольных групп TNF-alpha content (pg/g of tissue) in organs and tissues of mice from the control groups Доза препарата Drug dose Содержание ФНО-альфа (пг/г ткани) в органах и тканях мышей опытных групп через ... ч TNF-alpha content (pg/g of tissue) in organs and tissues of mice from the treatment groups after . h
0,02 0,08 0,5 1 4 24
Селезенка Spleen 2,00 ± 1,23 ЭД "min EDm,n 127 ± 17a 660 ± 75a 373 ± 33a 191 ± 12a 28,1 ± 2,6a 10,6 ± 5,2
5,06 ± 3,49 ЭД "max EDmin 168 ± 59a 1306 ± 23a 822 ± 163a 447 ± 28a 22,2 ± 6,7a 3,8 ± 2,8
Печень Liver 19,6 ± 15,9 ЭД "min EDm|n 0 114 ± 36 62,6 ± 33,5 0 7,6 ± 7,1 5,0 ± 5,0
26,7 ± 13,0 ЭД "max EDmin 73,1 ± 29,4 319 ± 50a 213 ± 37a 117 ± 37a 56,7 ± 23,1 71,4 ± 19,2
Почки Kidneys 22,4 ± 13,6 ЭД "min EDmin 269 ± 23a 169 ± 27a 302 ± 23a 195±21a 242 ± 36a 52,6 ± 30,4
18,4 ± 11,4 ЭД "max EDmin 267 ± 37a 680 ± 96a 539 ± 38a 446 ± 24a 86,2 ± 20,5a 99,4 ± 16,6a
Кожа Skin 7,96 ± 3,88 ЭД "min EDmin 165 ± 10a 312 ± 71a 231 ± 49a 123 ± 16a 134 ± 42a 0
20,8 ± 10,7 ЭД "max EDmin 336 ± 32a 2672 ± 206a 2604 ± 311a 1793 ± 336a 263±121 15,8 ± 15,8
a Статистически значимые отличия от контроля по U-критерию Манна-Уитни, р < 0,05. a Statistically significant difference from control according to the Mann-Whitney U-test, р < 0.05.
Таблица 4. Фармакокинетические параметры распределения препарата рчФНО-альфа в крови и тканях внутренних органов мышей
Table 4. Pharmacokinetic parameters of rhTNF-alpha distribution in the blood and internal organ tissues of mice
Орган/Ткань Organ/Tissue AUC, пг-ч/мл или пг-ч/г AUC, pg h/mL or pg-h/g MRT, ч MRT, h fT, %
ЭД "min ED . mm ЭД "max ED max ЭД "min ED . min ЭД "max ED max ЭД "min ED . min ЭД "max ED max
Кровь (сыворотка) Blood (serum) 351213 724453 0,64 0,64 100 100
Селезенка Spleen 1053 1752 2,8 1,4 0,30 0,50
Печень Liver 44 1675 0,2 11,4 0,013 0,52
Почки Kidneys 3779 3179 6,0 9,0 1,08 0,91
Кожа Skin 3092 11139 3,6 2,5 0,88 3,17
Примечание. AUG — площадь под кривой «концентрация-время»; MRT — среднее время удержания препарата в крови; fT — тканевая доступность; ЭДт|п — минимальная эффективная доза; эДшх — максимальная эффективная доза.
Note. AUG—area under the curve; MRT — mean residenme time; f — tissue availability; ED — minimum effective dose; ED — maximum effective dose.
T -" mm max
ствия препарата среди всех исследованных органов было зарегистрировано в печени (0,2 ч для ЭДт|п и 11,4 ч для ЭДтах соответственно).
Расчетные показатели тканевой доступности fT свидетельствуют о том, что наиболее высокие значения данного параметра были установлены для почек и кожи. Препарат не только сильнее в них накапливался, но и дольше удерживался, о чем свидетельствуют более высокие значения времени удержания MRT. Наименее проницаемой для рчФНО-альфа была ткань печени, при этом значение MRT при введении препарата в ЭДтах оказалось наибольшим.
Следует отметить, что процесс элиминации препарата рчФНО-альфа после его однократного введения в исследованных дозах в основном завершался к концу первых суток. Рекомендуемый интервал времени введения препарата, основанный на результатах противоопухолевых исследований, составляет двое суток, что позволяет говорить о низкой вероятности кумуляции препарата в этих условиях. Однако окончательный вывод может быть сделан на основании сопоставления фармако-кинетических данных, полученных при одно- и многократном введении препарата, а также результатов токсикологических экспериментов.
Заключение
На основании полученных результатов можно заключить, что препарат рчФНО-альфа в средстве доставки при однократном внутривенном введении в диапазоне эффективных противоопухолевых доз быстро элиминировался из кровеносного русла и распределялся по тканям внутренних органов мышей. Процесс элиминации препарата из крови носит двухфазный характер, при этом формы фармакокинетических кривых при введении двух уровней доз существенно не отличались друг от друга. Основными органами распределения препарата являлись кожа, почки и селезенка. Процесс элиминации препарата после его введения в исследованных дозах в основном завершался к концу первых суток после введения.
Благодарности. Исследование проводилось при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках Федеральной целевой программы «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу», Государственный контракт № 14.N08.12.0089 от 29.08.2016.
Acknowledgments. The study was carried out with the financial support of the Ministry of Education and Science of the Russian Federation within the framework of the Federal Target Programme «Development of pharmaceutical and medical industry of the Russian Federation for the period up to 2020 and beyond», State Contract No. 14.N08.12.0089 of August 29, 2016.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.
Conflict of interests. Authors declare no conflict of interest requiring disclosure in this article.
Литература/References
1. Чубенко ВА. Иммунотерапия на основе цитокинов (ИЛ-1. ИЛ-2. ТНФ. КСФ. Интерфероны). Практическая онкология. 2016;17(2):99-109. [Chubenko VA. Immunotherapy is based on cytokines (IL-1, IL-2, FNO, CSF, IFN). Praktiches-kaya onkologiya = Practical oncology. 2016;17(2):99-109 (In Russ.)]
2. Kalliolias GD, Ivashkiv LB. TNF biology, pathogenic mechanisms and emerging therapeutic strategies. Nat Rev Rheumatol. 2016;12(1):49-62. https://doi.org/10.1038/ nrrheum.2015.169
3. Roberts NJ, Zhou S, Diaz LA Jr, Holdhoff M. Systemic use of tumor necrosis factor alpha as an anticancer agent. On-cotarget. 2011;2(10):739-51. https://doi.org/10.18632/onco-target.344
4. Tracey KJ, Beutler B, Lowry SF, Merryweather J, Wolpe S, Milsark IW, et al. Shock and tissue injury induced by recombinant human cachectin. Science. 1986;234(4775):470-4. https://doi.org/10.1126/science.3764421
5. Beutler B, Milsark IW, Cerami AC. Passive immunization against cachectin/tumor necrosis factor protects mice from lethal effect of endotoxin. Science. 1985;229(4716):869-71. https://doi.org/10.1126/science.3895437
6. Сысоева ГМ, Даниленко ЕД, Гамалей СГ, Батенева АВ, Романов ВП, Масычева ВИ. Противоопухолевые свойства композиционного препарата фактора некроза опухоли альфа с производными гематопорфирина. Сибирский онкологический журнал. 2010;6(42):36-41. [Sysoeva GM, Danilenko ED, Gamalei SG, Bateneva AV, Romanov VP, Masycheva VI. Anti-tumor activity of composite agent comprising tumor necrosis factor alpha with hematoporphyrin derivates. Sibirskii onkologicheskii zhur-nal = Siberian Journal of Oncology. 2010;6(42):36-41 (In Russ.)]
7. Лебедев ЛР, Даниленко ЕД, Телегина ЮВ, Зайцев БН. Противоопухолевое средство на основе фактора некроза опухоли с тропностью к костной ткани. Биомедицинская химия. 2015;61(5):652-6. [Lebedev LR, Danilenko ED, Telegina YuV, Zaitsev BN. An antitumor osteotropic agent based on tumor necrosis factor. Biomeditsinskaya khimiya = Biomedical Chemistry. 2015;61(5):652-6 (In Russ.)] https:// doi.org/10.18097/PBMC20156105652
8. Сысоева ГМ, Батенева АВ, Лебедев ЛР, Волосникова ЕА, Иванова ОС, Левагина ГМ и др. Исследование цитотоксической активности рекомбинантного фактора некроза опухоли альфа в средствах адресной доставки и модулирующего эффекта интерферона гамма на клетках меланомы B16-F10. Биофармацевтический журнал. 2016;8(5):9-14. [Sysoeva GM, Bateneva AV, Lebedev LR, Volosnikova EA, Ivanova OS, Levagina GM, et al. Evaluation of cytotoxic activity of recombinant tumor necrosis factor alpha in targeted delivery devices and modulating effect of interferon gamma in B16-F10 melanoma cells. Biofarmat-sevticheskii zhurnal = Russian Journal of Biopharmaceuti-cals. 2016;8(5):9-14 (In Russ.)]
9. Li M, Qin X, Xue X, Zhang C, Yan Z, Han W, et al. Safety evaluation and pharmacokinetics of a novel human tumor necrosis factor-alpha exhibited a higher antitumor activity and a lower systemic toxicity. Anticancer Drugs. 2010;21(3):243-51. https://doi.org/10.1097/CAD.0b013e328333d5ce
10. Gong J, Tan G, Sheng N, You W, Wang Z. Targeted treatment of liver metastasis from gastric cancer using specific binding peptide. Am J Transl Res. 2016;8(5):1945-56.
11. Xu G, Gu H, Hu B, Tong F, Liu D, Yu X, et al. PEG-b-(PELG-g-PLL) nanoparticles as TNF-a nanocarriers: potential cerebral ischemia/reperfusion injury therapeutic applications. Int J Nanomedicine. 2017;12:2243-54. https://doi.org/10.2147/ IJN.S130842
12. Karpenko LI, Lebedev LR, Ignatyev GM, Agafonov AP, Po-ryvaeva VA, Pronyaeva TR, et al. Construction of artificial virus-like particles exposing HIV epitopes, and the study of their immunogenic properties. Vaccine. 2003;21(5-6):386-92. https://doi.org/10.1016/S0264-410X(02)00406-1
13. Лебедев ЛР, Азаев МШ, Туманов ЮВ, Сизов АА, Ильичев АА, Татьков СИ. Искусственные микобактериаль-ные частицы для иммунизации против туберкулеза. Доклады Академии наук. 2002;387(2):272-5. [Lebedev LR, Azaev MSh, Tumanov YuV, Sizov AA, Il'ichev AA, Tat'kov SI. Artificial mycobacterial particles for immunization against tuberculosis. Doklady Akademii Nauk = Reports of the Academy of Sciences. 2002;387(2):272-5 (In Russ.)]
14. Масычева ВИ, Лебедев ЛР, Даниленко ЕД, Сысоева ГМ, Гамалей СГ. Противоопухолевое средство на основе наночастиц, несущих рекомбинантный фактор некроза опухоли альфа человека. Патент Российской Федерации № 2386447; 2008. [Masycheva VI, Lebedev LR, Danilenko ED, Sysoeva GM, Gamaley SG. Anticancer drug based on nanoparticles bearing recombinant human tumor necrosis factor alpha. Patent of the Russian Federation No. 2386447; 2008 (In Russ.)]
15. Масычева ВИ, Даниленко ЕД, Сысоева ГМ, Батенева АВ, Устименко СЮ, Акулова НИ и др. Конструирование нанобиопрепарата, содержащего фактор некроза опухоли альфа человека. В кн.: Материалы Пятого международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». М.; 2009. Ч. 1. С. 456. [Masy-cheva VI, Danilenko ED, Sysoeva GM, Ustimenko SYu, Aku-lova NI, et al. Construction of the nanobiopreparation containing human tumor necrosis factor alpha. In: Materials of the fifth International Congress « Biotechnology: State of the Art and prospects of development«. Moscow; 2009. Part 1. P. 456 (In Russ.)]
16. Даниленко ЕД, Левагина ГМ, Волосникова ЕА, Лебедев ЛР, Сысоева ГМ, Вязовая ЕА. Противоопухолевое средство на основе биодеградируемых наночастиц, не-
сущих рекомбинантный фактор некроза опухоли альфа человека. Патент Российской Федерации № 2691938; 2018. [Danilenko ED, Levagina GM, Volosnikova EA, Lebedev LR, Sysoeva GM, Vyazovaya EA. Antitumour agent based on biodegradable nanoparticles carrying a recombinant human tumor necrosis factor alpha. Patent of the Russian Federation No. 2691938; 2018 (In Russ.)]
17. Гамалей СГ, Батенева АВ, Сысоева ГМ, Даниленко ЕД, Лебедев ЛР, Масычева ВИ. Фармакокинетика и противоопухолевые свойства препарата, содержащего ФНО-а в составе наночастиц. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010;149(3):296-9. [Gamaley SG, Bateneva AV, Sysoeva GM, Danilenko ED, Lebedev LR, Masycheva VI. Pharmacokinetics and antitumor effects of the drug containing TNF-a in nanoparticles. Byulleten' eksperimental'noy biologii i meditsiny = Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2010;149(3):296-9 (In Russ.)]. https://doi.org/10.1007/s10517-010-0937-9
18. Сысоева ГМ, Гамалей СГ, Лебедев ЛР, Нуштаева АА, Даниленко ЕД, Левагина ГМ. Исследование противоопу-
холевой активности молекулярной конструкции фактора некроза опухоли in vitro и in vivo. Медицинская иммунология. 2015;17(S):425. [Sysoeva GM, Gamaley SG, Lebedev LR, Nushtaeva AA, Danilenko ED, Levagina GM. Study on the antitumor activity of the molecular construct of tumor necrosis factor in vitro and in vivo. Meditsinskaya immu-nologiya = Medical Immunology (Russia). 2015;17(S):425 (In Russ.)]
19. Сысоева ГМ, Зуева ЕП, Попова НА, Каледин ВИ, Симакова ОВ, Гамалей СГ и др. Противоопухолевая эффективность рекомбинантного фактора некроза опухоли альфа человека в системе доставки. Acta Naturae. 2017;спецвыпуск:165. [Sysoeva GM, Zueva EP, Popo-va NA, Kaledin VI, Simakova OV, Gamaley SG, et al. Antitumor efficacy of recombinant human tumor necrosis factor alpha within the delivery system. Acta Naturae. 2017;special issue:165 (In Russ.)]
20. Соловьев ВН, Фирсов АA, Филов ВА, ред. Фармакокинетика. М.: Медицина; 1980. [Soloviev VN, Firsov Aa, Filov VA, eds. Pharmacokinetics. Moscow: Meditsina; 1980 (In Russ.)]
Об авторах / Authors
Батенева Алена Владимировна. Alena V. Bateneva. ResearcherID: A-8050-2014
Симакова Ольга Владимировна. Olga V. Simakova. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-1222-7574
Гэмалей Светлана Георгиевна. Svetlana G. Gamaley. ResearcherID: В-7418-2014
Волосникова Екатерина Александровна, канд. биол. наук. Ekaterina A. Volosnikova, Cand. Sci. (Biol.). ORCID: https://orcid. org/0000-0001-5028-5647
Лебедев Леонид Рудольфович, д-р мед. наук. Leonid R. Lebedev, Dr. Sci. (Med.). ResearcherID: C-8596-2014 Даниленко Елена Дмитриевна, канд. биол. наук. Elena D. Danilenko, Cand. Sci. (Biol.). ORCID: https://orcid.org/0000-0001-5026-1602
Поступила 01.07.2019 Received 1 July 2019
После доработки 02.08.2019 Revised 2 August 2019
Принята к публикации 26.08.2019 Accepted 26 August 2019
