CC BY
85
противоопухолевые свойства Композиционного препарата фактора некроза опухоли альфа с производными гематопорфирина
г.м.Сысоева, Е.д. даниленко, С.г гамалей, А.Б. Батенева, в.п. романов, в.и. масычева
Институт медицинской биотехнологии (ИМБТ) фГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, г. Бердск, Новосибирская область 633010, Новосибирская область, г. Бердск, а/я 112, e-mail: sysoeva50@mail.ru
На экспериментальных моделях опухолей аденокарциномы Кребс-2, Эрлиха и карциномы легких Люис проведено исследование противоопухолевой активности композиционного препарата, содержащего в своем составе ФНО-а и фотосенсибилизатор - производные гематопорфирина (ПГП). Полученные данные свидетельствуют о том, что композиционный препарат отличался повышенной противоопухолевой активностью, по сравнению с его компонентами, в отношении ингибирования как первичного опухолевого узла, так и процесса метастазирования опухолевых клеток. Повышение уровня накопления ПГП в ткани опухоли после введения композиции позволяет предполагать, что наблюдаемое усиление эффекта ФНО-а связано с повышением селективности накопления ПГП в опухоли и его модулирующим действием. Комплексный препарат ПГП-ФНО-альфа отличается более низким уровнем токсичности, по сравнению с препаратом ФНО-альфа.
Ключевые слова: ФНО-а, производные гематопорфирина, композиционный препарат, экспериментальные опухоли, токсичность.
ANTI-TUMOR ACTIVITY OF COMPOSITE AGENT COMPRISING TUMOR NECTOSIS FACTOR ALPHA WITH
HEMATOPORPHYRIN DERIVATES G.M. Sysoeva, E.D. Danilenko, S.G. Gamalei, A.V. Bateneva, V.P. Romanov, V.I. Masycheva Institute of Medical Biotechnology, State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector», Berdsk,
Novosibirsk region
Post-office box 112, 633010-Berdsk, Novosibirsk region, e-mail: sysoeva50@mail.ru
Anti-tumor activity of composite agent comprising tumor necrosis factor-alpha (TNF-а) and photosensitizer (hematoporphyrin derivative) was studied using experimental tumor models of Krebs-2, Ehrlich’s adenocarcinomas and Lewis’s lung carcinoma. The data obtained showed that the composite agent demonstrated more anti-tumor activity compared to its components with respect to both inhibition of the primary tumor node and the process of tumor cell metastasis. Increase in the level of hematoporphyrin derivate uptake in the tumor tissue after injection of composition allows one to suppose that the observed effect of increase in TNF-а activity is related to the increase in selectivity of hematoporphyrin derivate uptake in the tumor and its modulated action. The complex agent hematoporphyrin derivate - TNF-а has lower toxicity level than TNF- а agent.
Key words: TNF-а, hematoporphyrin derivate, composite agent, experimental tumors, toxicity.
К числу перспективных противоопухолевых препаратов относятся представители семейства факторов некроза опухоли, в частности фактор некроза опухоли альфа (ФНО-а), который является противоопухолевым агентом, подавляя рост злокачественных новообразований и вызывая геморрагический некроз опухолей [5, 15]. В то же время результаты клинических испытаний препаратов рекомбинантного ФНО-а человека свидетельствуют о широком спектре его побочных эффектов. Этот факт, а также незна-
чительная величина терапевтического индекса ФНО -а являются основным препятствием для его широкого применения в медицине [8, 15, 18]. В связи с этим предпринимались многочисленные попытки снижения системной токсичности ФНО-а. В результате разработан ряд методических подходов к решению этой задачи, к ним можно отнести: создание мутантных форм ФНО-а; разработку его инкапсулированных форм; модификацию молекул ФНО-а путем конъюгирования с полимерами; использование
з?
ФНО-а в комплексной терапии с цитокинами и другими модификаторами биологических реакций либо создание композиционных препаратов на основе этих биологически активных веществ, снижающих побочные эффекты и повышающих противоопухолевую активность ФНО-а [5, 7-11, 14, 16-19].
Среди соединений, которые можно было бы рассматривать как вещества-синергисты ФНО-а, следует выделить препарат производных гема-топорфирина (ПГП), хорошо известный фотосенсибилизатор, используемый при проведении фотодинамической терапии онкологических заболеваний [4, 13]. Обращает на себя внимание сходство механизмов противоопухолевого действия ФНО-а и ПГП в сочетании с облучением. В обоих случаях основным патогенетическим фактором является цитотоксическое действие, нарушение кровоснабжения опухоли, приводящее к геморрагическому некрозу [1]. Учитывая это, можно было бы предположить, что препараты ФНО-а и ПГП в составе композиции способны усиливать эффект друг друга, результатом чего будет снижение эффективной дозы и, как следствие, выраженности токсических эффектов ФНО-а.
Целью исследования являлось изучение противоопухолевой активности композиционного препарата, содержащего в своем составе ФНО-а и фотосенсибилизатор ПГП, на экспериментальных моделях опухолей.
Материалы и методы
В экспериментах использовали препарат рекомбинантного ФНО-а человека, полученный по технологии, разработанной в ИМБТ, с удельной цитолитической активностью 3*107 Е/мг белка. Препарат производных гематопорфирина получали из гемина, выделенного из донорской крови человека. Диацетат гематопорфирина из гемина получали обработкой 50 % раствором бромистого водорода в уксусной кислоте. Полученный продукт обрабатывали раствором щелочи. Для освобождения от солей к раствору добавляли уксусную кислоту до рН 4,5; образовавшийся осадок тщательно промывали дистиллированной водой и нейтрализовали раствором щелочи. Полученный раствор ПГП замораживали и сушили в сублимационной
сушилке. Все процедуры проводили в темноте для предотвращения фотоинактивации препарата. Композиционный препарат, содержащий ФНО-а и производные гематопорфирина (ПГП-ФНО-а), получали смешиванием равных весовых количеств ПГП и ФНО-а в фосфатносолевом буферном растворе при нейтральном значении рН.
Уровень токсичности композиционного препарата в сравнении с его компонентами определяли в экспериментах на половозрелых белых беспородных мышах-самцах ICR массой 20-22 г. Оценку противоопухолевой активности проводили на белых беспородных мышах-самцах ICR с массой тела 22-28 г и мышах-самках линии C57Bl/6 с массой тела 20-25 г. Животные получены из питомника ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Эксперименты поставлены с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных МЗ РФ. Содержание животных осуществляли в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей. Параметры летальных доз и максимально переносимую дозу препаратов рассчитывали экспресс-методом по В.Б. Прозоровскому [3].
В качестве экспериментальных моделей для изучения антионкогенного действия препаратов были использованы аденокарцинома Кребс-2, аденокарцинома Эрлиха и карцинома легких Льюис. Клетки опухолей перевивали подкожно в дозе 105 клеток на животное. Противоопухолевое и антиметастатическое действие препаратов оценивали, сравнивая массу первичного опухолевого узла, количество метастазов в легких животных опытных и контрольных групп; рассчитывали процент торможения опухолевого роста и ингибирования метастазирования.
Массу опухолевого узла мышей с аденокарциномой Кребса-2 и Эрлиха оценивали на 12-е сут после перевивки опухолевых клеток, c аденокарциномой легких Льюис - на 15-е сутки. Процент торможения роста опухоли (ТРО) рассчитывали по формуле: ТРО (%) = (Вк-Во )/ Вкх100, где Вк- средний показатель массы опухоли в контрольной группе; Во- средний показатель опытной группы.
Подсчет числа метастазов в легких проводили на 19-е сут после перевивки карциномы легких Льюис. Индекс ингибирования мета-стазирования (ИИМ) вычисляли по формуле: ИИМ=[(А хВ ) - (А хВ )]/ А хВ х100, где А ,
к к 4 о о'л к к , к
Ао - частота метастазирования в контроле и опыте соответственно; В , В - количество мета-
ко
стазов на 1 животное в контрольной и опытной группах.
Композиционный препарат ПГП-ФНО-а вводили подкожно, 3-кратно, с интервалом в 24 ч, начиная с 4-7-х сут после трансплантации опухолевых клеток. В качестве препаратов сравнения использовали ФНО-а и ПГП в эквивалентных дозах. Композиционный препарат ПГП-ФНО-а, содержащий 3-300 нг ФНО-а и 3-300 нг ПГП, вводили в диапазоне доз от 6 до 600 нг/20 г массы тела животных. Препарат ФНО-а вводили в дозах от 3 до 300 нг/20 г массы тела; препарат производных гематопорфири-нов - в дозах от 3 нг до 300 нг/20 г массы тела. Контрольные животные получали инъекции растворителя (физиологического раствора).
Исследование уровня накопления композиционного препарата в ткани опухоли проводили на белых беспородных мышах ICR с трансплантированной опухолью Эрлиха. Препарат ПГП-ФНО-а вводили в дозе 3 мкг/20 г массы тела животных подкожно, в область опухолевого узла. В качестве групп сравнения использовали мышей, которым вводили ПГП в дозе, эквивалентной используемой в составе композиции. Через 0,5 и 3 ч после инъекции забирали на анализ кровь, образцы опухолевой ткани, бедренной мышцы, кожи, печени. Определение содержания производных гематопорфирина в ткани внутренних органов и сыворотке крови проводили по методу, описанному МХ. Pantilides et а1. [17]. Органы гомогенизировали в буфере, содержащем 0,1М HEPES и 0,01М СТАВ (pH = 7,0). Экстракцию гема-топорфиринов проводили смесью этилацетат-ледяная уксусная кислота (4:1) с последующим гидролизом 1М раствором соляной кислоты и нагреванием до флуоресцирующих мономеров. Интенсивность флюоресценции измеряли при длине возбуждения/поглощения 404/494 нм. Калибровочные кривые строили для каждого органа, добавляя препарат ПГП в концентрациях
0,05-1,0 мкг к гомогенатам тканей органов либо крови, после чего полученные образцы проводили через те же стадии выделения и очистки, что и опытные образцы.
Данные экспериментов обрабатывали методами вариационной статистики с помощью пакета программ «Statgraphics, Version 5.0» (Statistical Graphics Corp., USA). Достоверность обнаруженных различий оценивали по t-критерию Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Исследование токсических свойств препаратов показало, что ПГП-ФНО-а отличался более низким уровнем токсичности по сравнению с ФНО-а. Уровень среднесмертельной дозы композиционного препарата в 2,5 раза превышал его значения, полученные для ФНО-а. Значение LD50 для препарата ПГП-ФНО-а было равно 28,2 мг/кг, максимально переносимая доза - 20 мг/кг веса тела, тогда как для ФНО-а эти показатели составляли 11,2 и 6,0 мг/кг соответственно.
Сравнительная оценка чувствительности трех штаммов опухолей к воздействию ФНО-а показала, что наиболее выраженным эффект препарата был в отношении клеток аденокарциномы Кребс-2 (таблица). Процент торможения роста опухоли при введении ФНО-а в дозах 30 и 300 нг/20 г массы тела составлял 63,3 % и 73,3 % соответственно. Эффект препарата на мышах с подкожно трансплантированной аденокарциномой Эрлиха при использовании тех же доз был выражен слабее - 22,2 % и 59,7% соответственно. Клетки карциномы легких Льюис оказались наименее чувствительными к воздействию ФНО -а в использованных дозах. Процент торможения роста опухоли при введении препарата в дозе 3 нг не превышал 23,0 %, причем не обнаружено усиления эффекта препарата при увеличении его дозы. Введение ФНО -а в состав композиции не приводило к изменению селективности его воздействия на разные штаммы опухолевых клеток.
Результаты исследования композиционного препарата ПГП-ФНО-а, в сравнении с препаратом ФНО-а, на мышах с трансплантированной аденокарциномой Кребса представлены на рис. 1. Введение ФНО-а в
ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ СВОЙСТВА КОМПОЗИЦИОННОГО ПРЕПАРАТА ФАКТОРА НЕКРОЗА ...
---------------------------------------------------------------------------------- 39
Таблица
Чувствительность разных штаммов опухолевых клеток к антибластоидному действию
фно-а
Доза ФНО-а Торможение роста опухолевого узла у мышей с перевиваемой опухолью
Аденокарцинома Кребса Аденокарцинома Эрлиха Карцинома легких Льюис
102 Е/20 г 13,0 % 22,2 % 23,0 %
103 Е/20 г 63,3 %* 22,2 % НИ
104 Е/20 г 73,3 %* 59,7 %* 3,3 %
Примечания: НИ - не исследовалось; * - различия статистически значимые по сравнению с контролем (физиологический раствор), р<0,05.
дозах 30 и 300 нг/20 г веса тела вызывало торможение роста опухоли на 63,3 % и 73,3 % соответственно. Снижение дозы ФНО-а до 3 нг приводило к резкому ослаблению противоопухолевого эффекта препарата. Ингибирование опухолевого процесса при введении композиционного препарата было максимально выражено при низких концентрациях составляющих его компонентов. Так, препарат ФНО-а с ПГП, содержащий в своем составе 3 нг ФНО-а и 3 нг ПГП, вызывал торможение роста опухоли на 63,3 %, что в 4,8 раза превышало соответствующий показатель при введении ФНО-а в той же дозе и соответствовало уровню, достигаемому при введении цитокина в дозах 30 и 300 нг/20г веса тела животного. Увеличение дозы композиции не приводило к дальнейшему повышению противоопухолевой активности.
Трехкратное введение препарата ПГП-ФНО-а в дозе 30 нг мышам с трансплантиро-
ванной опухолью Эрлиха вызывало достоверное торможение роста опухоли (р<0,05). Если средняя масса опухолевого узла в контрольной группе животных составляла 6,9 ± 0,5 г, то в опытной группе мышей значение данного показателя было равно 5,0 ± 0,8 г. Торможение роста опухоли в этой экспериментальной группе составляло 28,0 %. Следует отметить, что противоопухолевый эффект ФНО-а и ПГП в составе композиции зависел от дозировки компонентов и сводился к минимуму при повышении их концентрации (рис. 2).
Как было показано ранее, клетки карциномы легких Льюис отличались слабой чувствительностью к воздействию препарата ФНО-а в диапазоне доз от 3 до 300 нг/20 г веса тела. Введение ФНО-а в состав композиции не приводило к повышению чувствительности первичной опухоли данного штамма к воздействию цитокина. Однако исследование влияния
Рис. 1. Влияние препарата ФНО-а и его композиции с ПГП на рост перевиваемой аденокарциномы Кребс-2. Примечание: * - различия, статистически значимые по сравнению с показателями мышей в группе сравнения (ФНО-а)
Рис. 2. Влияние препаратов ФНО-а, ПГП и композиционного препарата ПГП-ФНО-а на рост аденокарциномы Эрлиха. Примечание: * - различия, статистически значимые по сравнению с показателями мышей в группе сравнения (ФНО-а)
Рис. 3. Влияние препаратов ФНО-а, ПГП и композиционного препарата ПГП-ФНО-а на метастазирование карциномы легких Льюис.
Дозы препаратов: ПГП - 30 нг, ФНО-а - 30 нг (103 Е), ПГП-ФНО-а: 30 нг ПГП и 30 нг (103 Е) ФНО-а.
Примечание: * - различия, статистически значимые по сравнению с группой-контролем (физиологический раствор); ** - по сравнению с показателями мышей в группах сравнения (ФНО-а, ПГП), р<0,05
композиционного препарата на интенсивность процесса метастазирования, проведенное на той же модели, показало, что среднее число метастазов, в пересчете на мышь, в группе животных, которым вводили ПГП-ФНО-а, было почти в 15 раз ниже по сравнению с показателем контроля, в 5 и 2 раза - с группами мышей, которым вводили ФНО-а или ПГП (рис. 3). В опытных группах ИИМ составлял 93, 83 и 68 % соответственно.
Таким образом, на опухолевых моделях, различающихся по чувствительности к ФНО-а, было показано, что ФНО-а и ПГП в составе композиционного препарата оказывают ингибирующий эффект как на развитие первичного опухолевого узла, так и на процесс гематогенного метастазирования опухоли в легкие. Эффективная доза ФНО-а в композиции была в 10-100 раз ниже установленной для ФНО-а при монотерапии. Как и в случае свободного ФНО -а, максимальный процент торможения роста опухоли был отмечен на мышах с перевивной опухолью Кребса.
Повышение противоопухолевого потенциала композиции ПГП-ФНО-а, по сравнению с его компонентом ФНО-а, может быть связано с модулирующим эффектом ПГП. Как было показано ранее [2], препарат ПГП обладает самостоятельной противоопухолевой активностью, которая
Рис. 4. Содержание производных гематопорфирина в ткани аденокарциномы Эрлиха в первые часы после введения препаратов ПГП-ФНО-а и ПГП мышам-опухоленосителям. Примечание: ** - различия, статистически значимые по сравнению с показателями мышей в группе сравнения (ПГП), р<0,05
проявляется и в отсутствие облучения.
Данные, полученные в эксперименте по оценке накопления препарата ПГП в ткани опухоли, свидетельствуют о значительном повышении содержания ПГП в опухоли животных, которым вводили композиционный препарат, по сравнению с его концентрацией в образцах, взятых у мышей после введения только ПГП (рис. 4). Через 30 мин после инъекции композиции концентрация флуоресцирующих производных гематопорфирина в опухоли была в 2,4 раза выше, чем при введении препарата ПГП. Высокий уровень данного показателя сохранялся, по меньшей мере, в течение 3 ч, чего не наблюдалось у животных группы сравнения. При этом уровень ПГП в коже, мышце, сыворотке крови и печени животных через 30 мин после инъекции препаратов не превышал фонового уровня эндогенных гематопорфиринов.
Данные о повышении уровня ПГП в ткани опухоли при введении его в составе композиции позволяют предполагать, что повышенная противоопухолевая активность препарата ПГП-ФНО -а является результатом усиления под действием ФНО-а тропности ПГП к клеткам опухоли и как следствие реализации модулирующего действия ПГП на противоопухолевый эффект, вызванный ФНО-а. Рядом исследователей показана возможность усиления противоопухо-
левой эффективности химиотерапевтических средств при проведении комплексной терапии с ФНО -а в результате повышения селективности доставки химиопрепаратов в опухоль [5, 11]. Эти эффекты ФНО-а, по-видимому, связаны с его способностью вызывать уменьшение давления в сосудах опухоли, что способствует усилению проникновения лекарственных препаратов в область опухоли [11].
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что композиционный препарат, содержащий в своем составе ФНО-а и ПГП, отличается повышенной противоопухолевой активностью, по сравнению с составляющими его компонентами, при ингибировании как первичного опухолевого узла, так и процесса метастазирования опухолевых клеток. Противоопухолевый эффект ФНО-а в составе композиции достигался введением значительно меньших доз цитокина, что важно с точки зрения снижения его токсичности. Введение препарата ПГП-ФНО-а приводило к повышению уровня накопления ПГП в ткани опухоли, что, вероятно, свидетельствует о возможности усиления эффекта ФНО-а в результате повышения селективности накопления фотосенсибилизатора в опухоли и его модулирующего действия.
ЛИТЕРАТУРА
1. Васильев Н.Е., Сысоева Г.М., Даниленко Е.Д. Иммунологические аспекты фотодинамической терапии // Медицинская иммунология. 2003. Т. 5, № 5-6. С. 507-518.
2. Масычева В.И., Даниленко Е.Д., Гамалей С.Г. и др. Исследование особенностей фармакокинетики и противоопухолевой активности производных гематопорфирина у мышей-опухоленосителей // Лазерная медицина. 1999. Т. 3-4. С. 12-16.
3. Прозоровский В.Б., Прозоровская Н.П., Демченков В.И. // Фармакология и токсикология. 1978. № 4. С. 497-501.
4. BonettR. Photosensitizers of the porphyrins and phtalocyanine series for photodynamic therapy // Chem. Soc. Rev. 1995. Vol. 24. P. 19-33.
5. Corti A. Strategies for improving the anti-neoplastic activity
of TNF by tumor targeting // Methods Mol. Med. 2004. Vol. 98. P. 247-264.
6. Corti A., Ponzoni M. Tumor vascular targeting with tumor necrosis factor and chemotherapeutic drugs // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2008. Vol. 1028. P. 104-112.
7. Curnis F, Sacchi A., Borgna L. et at. Enhancement of tumor necrosis factor antitumor immunotherapeutic properties by targeted delivery to aminopeptidase N (CD13) // Nat. Biotechnol. 2000. Vol. 18. P. 1185-1190.
8. Daniel D., Wilson N.S. Tumor necrosis factor: renaissance as a cancer therapeutic // Curr. Cancer Drug Targets. 2008. Vol. 2. P 124-131.
9. Balza E., Mortara L., Sassi F. et al. Targeted delivery of tumor necrosis factor-alpha to tumor vessels induces a therapeutic T cell-mediated immune response that protects the host against syngeneic tumors of different histologic origin // Clin. Cancer Res. 2008. Vol. 12. P. 2575-2582.
10. Curnis F., Gasparri A., Sacchi A. Coupling tumor necrosis factor with V integrin ligands improves its antineoplastic activity // Cancer Res. 2004. Vol. 64. P. 565-571.
11. Fukushima T., Yamamoto M., Oshiro S. et al. Recombinant mutant human tumor necrosis factor-alpha (TNF-SAM2) immunotherapy with ranimustine chemotherapy and concurrent radiation therapy for malignant astrocytomas // Anticancer Res. 2003. Vol. 23 (6a). P. 4473-4481.
12. ten Hagen T.L., Eggermont AM. Solid tumor therapy: manipulation of the vasculature with TNF // Technol. Cancer Res. Treat.
2003. Vol. 3. P. 195-203.
13. Murakami H., Kohno E., Kohmura Y. et al. Antitumor effect of photodynamic therapy in mice using direct application of Photofrin dissolved in lidocaine jelly // Photodermatol. Photoimmunol. Photo-med. 2009. Vol. 5. P. 259-263.
14. Kuroda K., Miyata K., Fujita F. et al. Human tumor necrosis factor-alpha mutant RGD-V29 (F4614) shows potent antitumor activity and reduced toxicity against human tumor xenografted nude mice // Cancer Lett. 2000. Vol. 159 (1). P. 33^1.
15. Lejeune F.J., Ruegg C. Recombinant human tumor necrosis factor: an efficient agent for cancer treatment // Bull. Cancer. 2006. Vol. 93 (8). P. 90-100.
16. Liu X., Zhang X.F., Zheng Z.W. et al. The administration of rm-hTNF injection in combination with general chemotherapy is an effective and secure means in treating advanced malignant tumor // J. Transl. Med.
2004. Vol. 14, № 2 (1). P. 33.
17. PantelidesM.L., Moore J.V., BlackNJ. A comparison of serum kinetics and tissue distribution of photophrin II following intravenous and intraperitoneal injection in mice // Photochem. Photobiol. 1989. Vol. 49. P. 67-70.
18. Pilati P., Rossi C.R., Mocellin S. Strategies to enhance the anticancer potential of TNF // Front Biosci. 2008. Vol. 13. P 3181-3193.
19. VisariaR.K., GriffinR.J., WilliamsB.W. et al. Enhancement of tumor thermal therapy using gold nanoparticle-assisted tumor necrosis factor-delivery // Mol. Cancer Ther. 2006. Vol. 5. P. 1014-1020.
Поступила 20.07.10
