CC BY
58
УДК 612.083.084+615.03
С.Г. Гамалей, Е.Д. Даниленко, А.В. Батенева, Л.Р. Лебедев, В.И. Масычева
E-mail: gamalei@mail.ru
ФАРМАКОКИНЕТИКА МОЛЕКУЛЯРНОЙ КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ ДЕПОНИРОВАНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВКИ К КЛЕТКАМ-МИШЕНЯМ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
Институт медицинской биотехнологии ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, г Бердск Новосибирской области
ВВЕДЕНИЕ
Создание разнообразных вариантов молекулярных конструкций в виде наночастиц для адресной доставки терапевтических препаратов является интенсивным направлением, нацеленным на конструирование форм препаратов нового поколения. Применение таких молекулярных конструкций в виде наночастиц как средств доставки лекарственных препаратов позволяет использовать значительно меньшие количества активного вещества для получения специфического эффекта и/или получить многократно увеличенный эффект; уменьшить токсический эффект препаратов; изменить фармакокинетику и распределение веществ в клетках организма; защитить биологически активное вещество от биодеградации
[1-4].
Особое значение эти исследования имеют для онкологии. Как известно, одной из проблем современной онкологии является низкая селективность накопления противоопухолевых средств тканью опухоли, что обусловливает необходимость введения препаратов в высоких дозах и, как следствие, приводит к развитию широкого спектра токсических эффектов [5]. В связи с этим, разработка средств доставки веществ, обладающих противоопухолевой активностью, чрезвычайно актуальна.
Для оценки пригодности наноконструкций как инструмента доставки фармакологического препарата важную информацию могут дать фармакокинетические исследования, поскольку они позволяют выявить тропность к органам и тканям, динамику накопления и скорость элиминации наночастицы из организма.
Ранее во ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» была получена молекулярная конструкция, в центре которой находится нуклеотидный материал (двуспиральные РНК), покрытый оболочкой из спермидина и поли-глюкина. Данные частицы в физиологических усло-
виях имеют сферическую вирусоподобную форму в связи с чем, получили название «вирусоподобная частица» (ВПЧ).
На основе этой конструкции и антигенов инфекционных агентов были получены экспериментальные образцы кандидатных вакцин против ВИЧ, туберкулеза, клещевого энцефалита, показана их высокая эффективность при иммунизации лабораторных животных [6, 7]. Успешные результаты, полученные в процессе разработки вакцин, явились основанием для исследования данной молекулярной конструкции как средства доставки терапевтических препаратов.
Как указывалось выше, особенностью этой конструкции является наличие в ее центральной части дсРНК, которая является индуктором интерферона, стимулятором неспецифической резистентности, обладает свойствами усиливать противоопухолевые, иммунотропные свойства фармакологических препаратов. Поэтому выяснение распределения и выведения дсРНК в составе наноконструкции имеет важное значение для создания средств противоопухолевого и иммуностимулирующего действия.
Целью данной работы являлась оценка фармакокинетических свойств препарата ВПЧ на мышах-опухоленосителях для заключения о пригодности наноконструкции данного типа как средства адресной доставки препаратов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В исследованиях использовали препарат ВПЧ, содержащий в центральной части радиоактивно меченый препарат дсРНК. Введение радиоактивной метки [гамма-32Р] по 5'-концу дсРНК проводили с использованием полинуклеотидкиназы и [гам-ма-32Р] ATФ согласно процедуре, описанной Ос-терманом Л.А. [8]. Меченую дсРНК очищали двукратным переосаждением этиловым спиртом [8]. Удельная радиоактивность дсРНК, меченой фосфором, составляла 7,3*108 имп/мин/мг. Препарат вирусоподобной частицы был получен методом, описанным ранее Сизовым А.А. с соавт. [9]. В качестве препарата сравнения использовали радиоактивно меченый препарат дсРНК.
Исследования проводили на мышах-опухоле-носителях с солидной формой перевивной карциномы Эрлиха. Опухолевые клетки, полученные от мышей-доноров на 6-е сутки после трансплантации, перевивали мышам внутримышечно в дозе 105 клеток на животное в объеме 0,1 мл в правую заднюю лапу. На 6-е сутки после перевивки опухоли животные были разделены на 3 экспериментальные группы, по 24 особи в каждой. Мышам первой, опытной, группы вводили смесь немеченого и меченого препарата ВПЧ в дозе 0,01 мг дсРНК/мышь и 0,7 млн. имп/мин/мышь соответственно. Использованная доза препарата составляла 0,5 мг дсРНК/кг массы тела и относилась к диапазону эффективных доз дсРНК. Препарат вводили однократно внутри-
венно в хвостовую вену мышей в объёме 0,1 мл на животное.
Мыши второй группы получали инъекции смеси меченой и немеченой дсРНК в той же дозе и объеме, как препарат ВПЧ.
Данные экспериментов обрабатывали методами вариационной статистики с помощью пакета программ «Statgraphics, Vers. 5.0» (Statistical Graphics Corp., USA). Статистическую значимость обнаруженных различий оценивали по t-критерию Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Динамика выведения меченых препаратов ВПЧ и дсРНК из сыворотки крови мышей представлена на рис. 1. Видно, что максимальное содержание радиоактивной метки в сыворотке крови наблюдалось через 5 мин (0,08 ч) после введения. Кривая элиминации препарата ВПЧ во все сроки наблюдения не отличалась от кривой выведения дсРНК. Через 48 ч после введения препаратов в сыворотке крови оставалось 0,12% от введенного радиоактивного препарата.
Анализ показал, что значения удельной радиоактивности всех внутренних органов уже через 4 ч после введения меченого препарата ВПЧ превышали ее содержание в крови (таблица). Это свидетельствует
о том, что препарат ВПЧ так же, как препарат сравнения дсРНК, быстро выводится из крови и накапливается в ткани органов.
Анализ динамики накопления радиоактивности в органах мышей контрольной группы показал, что
Таблица
Удельная радиоактивность органов и сыворотки крови мышей после введения препаратов, меченых [гамма-32Р], *103 имп/мин/г массы ткани
Орган/ биологическая жидкость Препарат Время после введения, ч
0,08 0,5 1 4 24 48
Сыворотка крови ВПЧ дсРНК 56,8±2,9 47,5±6,7 13,4±1,2 14,3±0,6 8,59±0,50 7,71±1,76 4,95±0,22 4,98±0,30 2,78±0,22 3,11±0,23 1,63±0,21 2,10±0,21
Печень ВПЧ дсРНК 15,0±1,4 9,88±3,01 22,4±3,5 20,1±0,2 22,0±0,9 19,1±0,7 18,6±0,8 19,6±0,7 6,73±0,17 7,83±0,32 4,94±0,37 6,35±0,48
Почки ВПЧ дсРНК 89,5±8,0 60,8±14,3 44,3±6,3 45,8±2,1 31,4±1,9 33,0±1,9 28,5±1,6 30,6±2,1 14,1±0,4 15,4±1,0 10,2±0,8 * 13,7±1,3
Кишечник ВПЧ дсРНК 17,1±,1 15,5±3,8 32,8±3,2 33,2±2,7 37,6±3,8 34,7±4,9 32,8±4,0 35,6±4,3 27,8±2,2 31,8±0,7 19,7±1,4 * 27,5±3,1
Опухоль ВПЧ дсРНК 16,0±1,1 * 10,3±2,2 11,4±1,3 12,5±2,4 10,2±0,3 10,3±0,2 15,3±1,0 14,4±0,7 11,5±0,8 13,1±1,7 11,3±1,7 9,27±0,2
Мышца ВПЧ дсРНК 15,3±1,4 12,2±2,6 19,5±1,8 22,0±3,5 20,8±2,0 21,4±1,2 29,1±2,6 30,2±2,8 16,9±0,9 * 22,0±0,9 13,9±1,4 * 18,7±1,2
Кожа ВПЧ дсРНК 35,9±4,8 23,6±4,3 16,7±1,2 19,3±1,5 14,1±0,2 15,2±0,4 17,8±1,5 16,1±2,0 13,3±1,7 15,8±1,5 11,5±0,8 11,5±1,3
Селезенка ВПЧ дсРНК 17,6±1,3 18,3±5,6 35,0±1,6 * 48,8±5,7 38,4±2,4 33,9±1,8 32,8±2,6 38,5±2,4 26,1±1,0 * 31,1±0,3 13,7±1,2 * 19,2±1,8
Различия статистически значимы: * - по отношению к показателям мышей после введения дсРНК, р<0,05.
0.08 0.5 1 4 24 48
Время пос.if введении препарат, ч
Рис. 1. Динамика изменения содержания меченой дсРНК в сыворотке крови мышей после однократного внутривенного введения беспородным мышам препаратов ВПЧ и дсРНК (в процентах от введенного)
в ранние сроки после введения препарата дсРНК (0,08 ч) значения удельной радиоактивности были наиболее высокими в почках, сыворотке крови и коже мышей (таблица). Значения показателя остальных исследуемых органов в этот срок колебались в диапазоне (9,88-18,3)*103 имп/мин/г.
Через 0,5 часа после введения дсРНК уровень радиоактивности в почках контрольных мышей снижался в 1,3 раза, через 48 часов - в 4,4 раза. В коже контрольных животных было отмечено постепенное снижение показателя к концу периода наблюдения (в 2 раза ниже, чем в начальной точке). Значение показателя в печени мышей повышалось через 0,5 ч после введения дсРНК, затем оставалось неизмен-
ным в течение четырех часов наблюдения и снижалось лишь к концу первых суток. Уровень радиоактивности опухоли контрольных животных повышался через 4 ч после введения препарата и оставался неизменным до конца первых суток, после чего снижался до значения, которое было зарегистрировано в начальный период после введения.
В ткани селезенки и кишечника было отмечено нарастание содержания меченого препарата через
0,5 ч после введения, сохранявшееся в течение суток. Через 48 ч после введения дсРНК значение ра-диоактивости ткани селезенки снижалось до уровня, зарегистрированного в начальный период наблюдения, а значение показателя в ткани кишечника оставалось повышенным и через двое суток. Повышение показателей радиоактивности в скелетной мышце наблюдали за период от 0,5 до 4 ч после введения препарата, с последующим снижением, которое все еще было выше исходного показателя на 53%.
Через 5 мин после введения меченого препарата ВПЧ наибольшую удельную радиоактивность наблюдали в ткани почек, сыворотке крови и коже (таблица). Содержание меченого препарата в тканях печени, кишечника, мышцы, кожи и селезенки в этот срок колебалось в пределах (15-17,6)*103 имп/мин/г. Значения радиоактивности почек, печени и кожи мышей, которым вводили ВПЧ, в этот период были в 1,5 раза выше соответствующих показателей животных, получавших инъекции дсРНК.
В последующие сроки наблюдения в группе мышей, которым вводили препарат ВПЧ, наблюдали изменения радиоактивности органов, аналогичные изменениям, зарегистрированным для контрольного препарата. Через 0,5 ч после введения уровни радиоактивности почек, сыворотки и кожи снижались в 2, 4,2 и 2,2 раза соответственно по отношению к уровню, зарегистрированному через 5 мин. после введения, и продолжали уменьшаться до конца эксперимента. Однако различий между данными, полученными у двух групп животных, не обнаружено.
Через 0,5 ч после введения ВПЧ удельное содержание меченой дсРНК в тканях кишечника и селезенки возрастало в 2 раза, сохранялось в течение 4 ч и в дальнейшем снижалось. Следует отметить, что через 24 и 48 ч удельная активность меченого препарата в селезенке опытной группы была ниже, чем в контроле (Р<0,05).
Умеренно повышенное содержание меченого препарата в печени отмечалось в течение четырех часов и снижалось только через сутки после введения ВПЧ.
Незначительное увеличение уровня радиоактивности ткани мышцы наблюдали через 4 ч после введения препарата ВПЧ с последующим статистически значимым снижением показателя через 24 и 48 ч, по сравнению с показателем контрольной группы.
В ткани опухоли во все сроки наблюдали умеренное по величине накопление меченого препарата. Следует отметить, что через 5 мин после введения
0.08 0.5 1 4 24 48
Время после введения препарата,*!
Рис. 2. Уровень удельной радиоактивности в опухоли после введения препаратов ВПЧ и дсРНК, меченых [гамма-32Р].
* - различия статистически значимы по отношению к дсРНК, р<0,05
препарата ВПЧ уровень радиоактивности в ткани опухоли опытных животных был статистически значимо выше показателя животных, которым вводили дсРНК (рис. 2).
Расчет уровня остаточной радиоактивности в сыворотке крови и органах мышей показал, что значения показателя через 48 ч после введения в большинстве органов составляли 0,1-0,4% от введенной дозы, за исключением печени, где значения показателя были несколько выше (0,60-0,80% от величины введенной дозы). На основании этих данных можно заключить, что препарат ВПЧ, в основном, выводился из организма мышей так же, как препарат сравнения дсРНК, в течение двух суток после введения.
Таким образом, показано, что препарат ВПЧ при внутривенном введении быстро элиминировался из кровеносного русла и распределялся по периферическим органам и тканям. Наиболее высоким содержание препарата было в почках, селезенке, кишечнике. Основным путем выведения препарата ВПЧ, так же, как препарата сравнения дсРНК, являлись почки, о чем свидетельствует высокий уровень радиоактивности данного органа. Препарат ВПЧ более интенсивно накапливался в ткани опухоли по сравнению с препаратом дсРНК. Процесс элиминации препарата ВПЧ из организма лабораторных животных, в основном, завершался к концу вторых суток после введения.
Полученные результаты свидетельствуют о пригодности данной наноконструкции, включающей дсРНК, как средства доставки препаратов противоопухолевого действия.
Данная работа была выполнена при финансовой поддержке Федеральной Целевой Научно-технической Программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2007-2012 годы», госконтракт №02.513.11.3372 «Конструирование нанобиочастиц - носителей терапевтических средств для доставки к клеткам-мишеням - и оценка их безопасности».
ЛИТЕРАТУРА
1. Sahoo S.K., Labhasetwar V. Nanotech approaches to drug delivery and imaging // Drug Discov. Today. - 2003. - Vol. 8, No. 24. - P. 1112-1120.
2. Heffernan M.J., Murthy N. Polyketal nanoparticles: a new pH-sensitive biodegradable drug delivery vehicle.// Bioconjug Chem. - 2005. - Vol. 16, № 6. - P. 1340-1342.
3. Tomalia D.A., Reyna L.A., Svenson S. Dendrimers as multi-purpose nanodevices for oncology drug delivery and diagnostic imaging.// Biochem Soc. Trans. - 2007. - Vol. 35, Pt 1. - P. 61-67.
4. Nie S., Xing Y, Kim G.J., Simons J.W. Nanotechnology applications in cancer.// Annu Rev Biomed Eng. 2007. - Vol. 9. - P. 257-88.
5. Cauwels A, Van Molle W, Janssen B, Everaerdt B, Huang P, Fiers W, Brouckaert P. Protection against TNF-induced lethal shock by soluble guanylate cyclase inhibition requires functional inducible nitric oxide synthase// Immunity. -2000. - Vol. 13, № 2. - P. 223-231.
6. Karpenko L.I., Ilyichev A.A., Eroshikin A.M. et al. Combined virus-like particle-based polyepitope DNA/protein HIV-1 vaccine. Design, immunogenicity and toxicity studies// Vaccine. - 2007. - Vol. 25. - P. 4312-4323.
7. Лебедев Л.Р., Гончарова Е.П., Сизов А.А., Булычев Л.Е., Одегов А.М., Рыжиков А.Б. Экспериментальный молекулярный дизайн рекомбинантных вакцин// Молекулярная биология. - 2003. - Т. 37, № 3. - С. 544-549.
8. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоактивными методами. - М: Наука, 1983.
9. Патент № 2190018 Молекулярный вектор для доставки генов в клетки-мишени (Сизов А.А., Лебедев Л.Р., Ма-сычева В.И., Даниленко Е.Д.).
©
PHARMACOKINETICS OF MOLECULAR CONSTRUCTION FOR DEPOSITION AND TRANSPORTATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES TO TARGET CELLS
S.G. Gamaley, E.D. Danilenko, A.V. Bateneva, L.R. Lebedev, V.I. Masycheva
SUMMARY
Studying pharmacokinetics of virus-like particle (VLP) marked by [gamma-3^] was performed in non-inbred mice having transplanted solid Erlich carcinoma. VLP preparation was established to quickly eliminate from the blood and accumulate mainly in kidneys, spleen and intestine. The degree of accumulation of VLP in tumor tissue was higher than the preparation of comparison, double-stranded RNA. Preparation was eliminated from the organism of laboratory animals mostly via kidneys and completed by the end of the second day after the administration.
Key words: virus-like particle, dsRNA, pharmacokinetics, Ehrlich carcinoma, mice.
—-----------------------------------
"IV Tv ✓ V ~ /s V У
Neaebneee
\ О • • V • • V / /^/ /v v s
iaaeoeineee
Я0В1АЁ
ЕЖЕКВАРТАЛЬНЫЙ РЕЦЕНЗИРУЕМЫЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ЦЕНТРАЛЬНОЕ ИЗДАНИЕ
Издавался в г.Томске с 1923-го по 1931 год.
С1996 года возрождено издание журнала решением президиума Томского научного центра СО РАМН.
Адрес в сети INTERNET:
http://www.medicina.tomsk.ru
В настоящее время начинается подписка на первое полугодие 2009 года.
Стоимость журналов:
для индивидуальных
подписчиков 690 руб.
для организаций 1610 руб., вкл. НДС
Тарифы на размещение рекламного материала Для отечественного рекламодателя:
1 черно-белая страница 1/2 черно-белой страницы 1/4 черно-белой страницы
1 цветная страница 1/2 цветной страницы
Наценки:
2-я стр. обложки - +40%
3-я стр. обложки - +25%
4-я стр. обложки - +35%
(плюс 5% налог на рекламу)
Подписку на журнал можно оформить:
• ДЛЯ ЮРИДИЧЕСКИХ ЛИЦ,
выслав заявку с указанием полного названия заказчика, его почтового адреса, ИНН по адресу: 634012, г. Томск, ул. Киевская, 111а, редакция «СМЖ»; факс (3822) 55-87-17.
E-mail: medicina@tomsk.ru
По заявке высылается счет для оплаты.
• ДЛЯ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ПОДПИСЧИКОВ, отправив почтовый перевод с указанием полных Ф.И.О., почтового адреса и заказываемых номеров по адресу: 634012, г. Томск, а/я 922, Коломийцеву Андрею Юрьевичу, прислав копию квитанции почтового перевода по факсу редакции: (3822) 55-87-17.
4000 руб. 2200 руб. 800 руб. 8000 руб. 4300 руб.
