CC BY
42
Д1АГНОСТИКА, Л1КУВАННЯ ТА ПРОФ1ЛАКТИКА
ХВОРОБ ТВАРИН
DIAGNOSTICS, TREATMENT AND PROPHYLACTICS
OF ANIMAL DISEASES
УДК 363.087.8:579.264:579.222.3
Агеев В. О., Дерев'янко С. В. ®
1нститут сыьськогосподарськог мшробюлогп УААН, Чернше
ФАКТОРИ АНТАГОН1СТИЧНО1 АКТИВНОСТ1 ШТАМ1В БАКТЕР1Й — КОМПОНЕНТ1В ПРОБ1ОТИЧНИХ ПРЕПАРАТ1В БПС-44 ТА БПС-Л
Встаноелено фактори, що обумоелюють антаготстичну актиетсть пробютичних штам1е бактерт — компонент1е пробютиюе БПС-44 та БПС-Л. Для молочнокислих бактерт штаму Lactobacillus plantarum L5 — це продукщя молочног кислоти i л1зоциму, для штам1е аеробних бацил Bacillus subtilis B3 i 44-p — антибютичних речоеин та, меншою мiрою, оргатчних кислот i лiзоциму.
Ключовi слова: пробютичт препарати, Bacillus subtilis, Lactobacillus plantarum, антаготзм, молочна кислота, лiзоцим.
Вступ. Нормальна мжрофлора розглядаеться як якюне i кшьккне сшввщношення популяцш MiKpo6iB оргашзму, що тдтримують 6ioxiMi4Hy, метаболiчну та iмунологiчну рiвновагу органiзму хазя!на, необхiдну для збереження його здоров'я. Нормальна мжрофлора виконуе ряд важливих функцiй: колонiзацiйно-резистентну ^жшкробний антагонiзм, активацiя iMyHiTeTy), детоксикацiйну, синтетичну i травну.
У тваринництвi та ветеринарнш медицинi застосовуються пробiотичнi препарати, створеш на основi представникiв нормально! м^офлори — переважно аеробних бацил та молочнокислих бактерш [11; 12]. 1х широке застосування зумовлене високою антагонiстичною активнiстю до патогенних та умовно-патогенних бактерiй, здатнiстю до адгези на клiтинах шлунково-кишкового тракту, !х iмyномодyлюючими властивостями, здатнiстю продукувати спектр бiологiчно активних речовин, в^аммв, незамiнних амiнокислот тощо [1; 5].
Антагошзм представникiв нормально! мiкрофлори обумовлюеться продyкцiею природних антибiотичних речовин, оргашчних кислот, лiзоцимy, гiдроген пероксиду та шших бактерiоцинiв, якi мають широкий спектр антимжробно! дi! [15], що зумовлюе високу лiкyвально-профiлактичнy ефективнiсть пробютичних препарата.
® Агеев В. О., Дерев'янко С. В., 2010
3
Отже, пробютики — це ефективш лжувально-профшактичш препарати, !х дiя на макрооргашзм pi3Ho6i4Ha. Потрапляючи в шлунково-кишковий тракт, вони продукують бiологiчно aктивнi речовини, якi згубно дшть на пaтогеннi та умовно-патогенш мiкрооргaнiзми. Застосування пробiотикiв необхiдне для вщновлення нормофлори оргaнiзму пiсля проведення антибютикотерапи. Безпечнiсть пробiотикiв визнана Всесвггньою оргaнiзaцieю охорони здоров'я та разом з Продовольчою i сiльськогосподaрською оргашзащею ООН розробленi вимоги до безпеки пробютичних штaмiв мiкрооргaнiзмiв [10; 14].
Матер1али i методи. У дослщах використовували однокомпонентний бацилярний препарат субтилк БПС-44 (реeстрaцiйне посвiдчення № 2154-04-0254-06 вщ 24.11.2006 р.), виготовлений на основi штаму бaктерiй Bacillus subtilis 44-р (депонований у Депозитари Державного науково-контрольного iнституту бютехнологи i штaмiв мiкрооргaнiзмiв 17.05.2002 р. за реестрацшним номером 141) та двокомпонентний бацилярний препарат субтилю-лакто БПС-Л (проект ТУ розглянуто та затверджено Вченою радою 1нституту сшьськогосподарсько1 мжробюлоги УААН 8.11.2005 р.), до складу якого входять штам бaктерiй B. subtilis В3 (депонований у Депозитари ДНК1БШМ 23.06.2009 р. за реeстрaцiйним номером 480) та штам бактерш Lactobacillus plantarum L5 (депонований у Депозитари ДНК1БШМ 23.06.2009 р. за реестрацшним номером 479).
При визначенш антагошстично! aктивностi пробiотичних штaмiв бaктерiй та концентраци лiзоциму як тест-культури використовували патогенш штами бaктерiй Staphylococcus aureus 23, Escherichia coli 14/1, Salmonella typhimurium 12, Shigella sonnei 22, Micrococcus lysodeikticus 4/7 з колекци 1нституту сшьськогосподарсько1 мжробюлоги УААН.
Культивування штaмiв аеробних бацил та бшьшост тест-культур (окрiм M. lysodeikticus) здшснювали на м'ясо-пептонному aгaрi (МПА) [8], штаму молочнокислих бактерш — на бульош MRS (середовищi де Мана) [13], тест-культури M. lysodeikticus — на бiфтaлaтному aгaрi [2].
Антагошстичну aктивнiсть пробiотичних штaмiв бактерш визначали методом перпендикулярних штрихiв, що полягае у пiдсiвaннi тест-культур до вирослих на щшьному живильному середовищi штрихiв дослiджувaних штaмiв бaктерiй (вщстрочений aнтaгонiзм) [3]. Загальну концентрaцiю кислот у культуральнш рiдинi визначали прямим кислотно-лужним титруванням [9], спiввiдношення та концентрацш оргaнiчних кислот — методом диференцшно! вiдгонки, що полягае у дистиляци безцукрового екстракту культурально! рщини з подальшим кислотно-лужним титруванням дистиляив [4], концентрaцiю лiзоциму (КФ 3.2.1.17) — нефелометричним методом за Х. Перрi [6]. Математичну обробку результат здшснювали методами вaрiaцiйноl статистики з використанням t-критерш Стьюдента [7].
Результати дослщження. Антаготстична активтсть пробютитв до патогенних бактерш. Встановлено, що пробютичний штам Lactobacillus plantarum L5 на живильному середовищi з 2 % глюкози характеризуеться високою aнтaгонiстичною aктивнiстю до використаних патогенних тест-культур, зумовлюючи затримку росту останшх 14,5-18,6 мм, без глюкози —
4
0,8-1,3 мм. Ц даш дають тдстави вважати, що з фaктоpiв, яю можуть обyмовлювaти aнтaгонiстичнy aктивнiсть, дослiджyвaним штамом молочнокислих бактерш продукуються переважно оpгaнiчнi кислоти.
У випадку штaмiв аеробних бацил Bacillus subtilis 44-р та В3 проявляеться протилежна тенденцiя. Так, B. subtilis B3 на сеpедовищi без глюкози виявляе значну aнтaгонiстичнy актившсть, затримуючи piст патогенних тест-культур на вщсташ 5,1-10,2 мм, що y 2,2-4,9 раза бшьше, нiж на сеpедовищi з 2 %-ним вмютом глюкози (2,1-2,8 мм). Стосовно штаму B. subtilis 44-p, то вш обумовлюе пpигнiчення росту тест-культур на вщсташ 5,8-9,3 мм, яке так само вipогiдно вiдpiзняеться вiд вщповщних значень затримки росту y випадку використання середовища з глюкозою y 2,5-4,7 раза (табл. 1), що спонукае до вивчення особливостей кислотоутворення дослщжуваними штамами.
Таблиця 1
AHTaroHÍCTHMHa актившсть дослщжуваннх штам1в бактерш
Штами Живильне середови-ще Зони затримки тест-культур, мм (M ± m, n = S)
Escherichia coli Staphylococcus aureus Salmonella typhimurium Shigella sonnei
Bacillus subtilis 44-р МПЛ. 6,0±0,5 5,8±0,7 9,3±0,3 7,S±1,2
МПЛ. з 2 % глюкози 1,6±0,4* 2,3±0,5* 2,0±1,0* 1,9±0,4**
Bacillus subtilis B3 МПЛ. 6,7±0,3 5,1±0,2 7,5±0,7 10,2±0,9
МПA з 2 % глюкози 2,S±0,3** 2,3±0,3* 2,0±0,3* 2,1±0,4**
Lactobacillus plantarum L5 МПЛ. 1,3±0,3 1,2±0,3 0,8±0,2 1,1±0,4
МПA з 2 % глюкози 14,S±1,1*** 14,5±0,9*** 1S,6±1,2*** 16,1±1,0***
Примггка: в1ропдна р1зниця пор1вняно з в1дпов1дним середовищем без вуглевод1в: * — p < 0,05; ** — p < 0,01; *** — p < 0,001.
Таю вщмшност пояснюються тим, що ïx антагошстична aктивнiсть обумовлена речовинами aнтибiотичноï природи, для синтезу яких не потpiбно велико1' кшькосп легкодоступних джерел вyглеводiв, i утворення яких може пpигнiчyвaтися при достатнш концентраци y сеpедовищi глюкози.
Динамжа кuслоmоуmворення шmамамu бакmерiй — компоненmамu npo6iomurne БПС-44 ma БПС-Л. Для вивчення накопичення кислот y культуральнш рщиш та 1х сшввщношення використовували стaндapтнi piдкi живильнi середовища — МПБ та МПБ з додаванням 2 % глюкози.
Дослщжуваш аеробш бацили впродовж 24 год. y сеpедовищi без глюкози продукують кислоту до кiнцевоï концентpaцiï 11,3-11,9 мМ H+, вже з 2-ï доби концентращя кислоти y кyльтypaльнiй рщиш починае зменшуватися, повертаючись до початкового piвня на 4-5-ту добу культивування, а починаючи iз 6-ï доби зниження концентраци кислоти прискорюеться y 2,6-3,3 раза. При культивуванш дослщжуваного штаму молочнокислих бaктеpiй вже з 1-ï доби культивування вмiст кислоти y сеpедовищi пiдвищyеться i упродовж 7 дiб ïï концентpaцiя збер^аеться на piвнi 12,7-14,0 мМ H+.
5
При культивуванш у живильному середовищi з 2 %-ним вмктом глюкози штами бaктерiй Bacillus subtilis 44-р та В3 за першу добу культивування накопичують у культуральнш рщиш оргaнiчнi кислоти у концентраци 19,6 мМ H+, що суттево перевищуе кiлькiсть кислот, накопичених упродовж вщповщного перiоду при вирощуванш цих штaмiв на середовищi без глюкози. Упродовж 5 дiб культивування рiвень кислотностi середовища майже не змшюеться, а з 6-l доби починае поступово знижуватися — на 1,0-1,6 мМ H+ за добу. При культивуванш штаму Lactobacillus plantarum L5 концентращя оргaнiчних кислот у культуральнш рщиш зростае впродовж 7 дiб зi швидкiстю, яка коливаеться вщ 0,9 до 4,6 мМ H+ за добу.
Отже, загальна динaмiкa накопичення оргaнiчних кислот у культуральнш рщиш дослщжуваними штамами залежить вiд нaлежностi пробiотичних штaмiв до певних груп мiкрооргaнiзмiв.
Той факт, що на середовищi з глюкозою аеробш бацили на першу добу культивування продукують бiльше оргaнiчних кислот, шж молочнокислi бактери, поступаючись при цьому останшм за aнтaгонiстичною актившстю, може пояснюватися кiлькiсним спiввiдношенням утворених кислот, що мають рiзну бактерицидну та бактерюстатичну aктивнiсть.
Встановлено, що тсля 7 дiб культивування на середовища що не мiстить глюкози, штами Bacillus subtilis 44-р i B3 продукують оцтову кислоту у кшцевш концентраци 0,13-0,18 % та масляну — у концентраци 0,28-0,31 %, а при !х культивуванш на середовищi з 2 % глюкози оцтово1 кислоти накопичуеться у 2,7-3,2 раза бшьше (до 0,42-0,48 %), масляна кислота вщсутня, ^м того накопичуеться молочна кислота у концентраци 2,14-2,32 % (табл. 2). Серед дослщжуваних оргашчних кислот найбшьшу бактерицидну дш мае молочна кислота, яка продукуеться цими штамами бактерш лише за наявност у живильному середовищi достатньо1 кiлькостi вуглеводiв. А враховуючи те, що аеробш бацили при вирощуванш на МПБ без глюкози бшьш виражено проявляють антагошзм до патогешв, отримaнi дaнi пщтверджують попередне припущення щодо продукци аеробними бацилами антибютичних речовин.
Таблиця 2
Спiввiдношення оргашчних кислот, накопичених пробштичними штамами у культуральнш рщиш (M±m, n = 6)_
Штами Середовища (позначення) Концентращя оргашчних кислот, %
оцтово1 масляно1 молочно1
Bacillus subtilis 44-р МПБ 0,13±0,02 0,28±0,12 0,00±0,00
МПБ з 2 % глюкози 0,42±0,03** 0,00±0,00** 2,14±0,13**
Bacillus subtilis B3 МПБ 0,18±0,07 0,31±0,09 0,00±0,00
МПБ з 2 % глюкози 0,48±0,06* 0,00±0,00** 2,32±0,17**
Lactobacillus plantarum L5 МПБ 0,42±0,12 0,00±0,00 0,23±0,02
МПБ з 2 % глюкози 0,17±0,04* 0,00±0,00 4,31±0,11***
Прим1тка: в1рог1дна р1зниця пор1вняно з в1дпов1дним середовищем без вуглевод1в: * —
p < 0,05; ** — p < 0,01; *** - p < 0,001.
6
Щодо штаму Lactobacillus plantarum L5, то при вирощуванш на середовища яке не мютить моноцу^в, вщбуваеться накопичення у культуральнш рщиш оцтово1 та молочно1 кислот у концентращях 0,42 % i 0,23 % вiдповiдно. Водночас у середовище з 2 % глюкози дослщжуваний штам бактерш видiляе оцтово1 кислоти у 2,5 раза менше, а молочно1 кислоти — у 18,7 раза бшьше, до концентраци 4,31 %.
Продукцт бактерюцитв бактерiальними компонентами пробютичних препаратiв. Лiзоцимну актившсть пробiотичних штaмiв бaктерiй вивчали на тих самих середовищах, що i кислотоутворення, визначення концентраци лiзоциму здшснювали у центрифугaтi культурально1 рiдини.
Дослщження показали, що склад середовища для культивування аеробних бацил практично не впливае на концентращю лiзоциму у культуральнш рщиш, яка складае 2,40-3,15 мкг/см3.
Штам Lactobacillus plantarum L5 на середовищi з 2 %-ним вмiстом глюкози продукуе лiзоцим у 2,4 рази актившше, нiж на аналопчному середовищi без глюкози — до концентраци 12,65 мкг/см3 порiвняно з 5,30 мкг/см3 при вирощуванш штаму на МПБ без глюкози (табл. 3).
Отже, результати вивчення мехaнiзмiв антагошстично1 ди пробiотичних штaмiв мiкрооргaнiзмiв свiдчaть, що aнтaгонiстичнa актившсть молочнокислих бактерш штаму Lactobacillus plantarum L5 обумовлюеться продукщею молочно1 кислоти та лiзоциму; штaмiв аеробних бацил Bacillus subtilis В3 та 44-р — антибютичних речовин та частково оргашчних кислот i лiзоциму.
Таблиця 3
Концентращя лiзоциму у культуральнiй рiдинi, мкг/см3 (M±m, n = 6)
Пробютичш штами Середовища (позначення)
МПБ МПБ з 2 % глюкози
Bacillus subtilis 44-р 2,95±0,35 3,15±0,20
Bacillus subtilis B3 2,65±0,25 2,40±0,15
Lactobacillus plantarum L5 5,30±0,65 12,65±1,05**
Примггка: ** — в1ропдна р1зниця пор1вняно з в1дпов1дним середовищем без вуглевод1в, p < 0,01.
Висновки. 1. Штами бaктерiй, що е основою пробютиюв БПС-44 та БПС-Л, володшть помiрною та високою aнтaгонiстичною актившстю щодо низки патогенних мiкрооргaнiзмiв.
2. Антагошстична aктивнiсть бaктерiй штаму Lactobacillus plantarum L5 обумовлюеться продукщею молочно1 кислоти та лiзоциму, штaмiв Bacillus subtilis В3 та 44-р — антибютичних речовин та, дещо менше, оргашчних кислот i лiзоциму.
Л^ература
1. а-амшази Bacillus subtilis / [Л. Д. Варбанець, К. В. Мишак, О. В. Мацелюх та ш.] // Мкробюл. журн. — 2006. — Т. 68, № 2. — С. 30-38.
2. Вихоть Н. Е. Факторы естественной резистентности / Н. Е. Вихоть, Е. У. Пастер // Иммунология : практикум / Е. У. Пастер, В. В. Овод,
7
В. К. Позур, Н. Е. Вихоть. — К. : Выща шк. Изд-во при Киев. гос. ун-те, 1989. — С. 265-297.
3. Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках: учеб. для студ. биол. спец. ун-тов. / Н. С. Егоров — 4-е изд., перераб. и доп. — М. : Высш. шк., 1986. — 448 с.
4. Зоотехнический анализ кормов / Е. А. Петухова, Р. Ф. Бессарабова, Л. Д. Халенева, О. А. Антонова. — 2-е изд., доп. и перераб. — М. : Агропромиздат, 1989. — 239 с.
5. Квасников Е. И. Антагонистическая активность молочнокислых бактерий по отношению к возбудителям кишечных заболеваний домашних птиц / Е. И. Квасников, Т. Н. Шишлевская, Н. К. Коваленко // Микробиол. журн. — 1983. — Т. 45, № 5. — С. 27-32.
6. Лабинская А. С. Микробиология с техникой микробиологических исследований / А. С. Лабинская. — 4-е изд., перераб. и доп. — М. : Медицина, 1978. — 392 с.
7. Лакин Г. Ф. Биометрия / Г. Ф. Лакин : учеб. пособие для биол. спец. вузов. — 4-е изд., перераб. и доп. — М. : Высш. шк., 1990. — 352 с.
8. Методы общей бактериологии / под ред. Ф. Герхардта и др. ; [пер. с англ. Е. Н. Кондратьевой и Л. В. Калакуцкого] : в 3 т. — М. : Мир, 1983-1984. — Т. 3. — 1984. — 264 с.
9. Пискарёва С. К. Аналитическая химия: учеб. для сред. спец. учеб. заведений / С. К. Пискарёва, К. М. Барашков, К. М. Ольшанова. — 2-е изд., перераб. и доп. — М. : Высш. шк., 1994. — 384 с.
10. Health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria : report of a joint FAO/WHO expert consultation. — Córdoba : FAO/WHO, 2001. — 33 p.
11. In vitro anti-Helicobacter pylori activity of the probiotic strain Bacillus subtilis 3 is due to secretion of antibiotics / [Irina V. Pinchuk, Philippe Bressollier, Bernard Verneuil et al.] // Antimicrobial agents and chemotherapy. — 2001. — Vol. 45, № 11. — P. 3156-3161.
12. Kizerwetter-Swida M. Selection of potentially probiotic Lactobacillus strains towards their inhibitory activity against poultry enteropathogenic bacteria / Magdalena Kizerwetter-Swida and Marian Binek // Polish journal of microbiology. — 2005. — Vol. 54, № 4. — P. 287-294.
13. de Mann J. C. A medium for the cultivation of lactobacilli / J. C. de Mann, M. Rogosa, M. Elisabeth Sharpe // Journal of applied bacteriology. — 1960. — Vol. 23, № 1. — P. 130-135.
14. Potential uses of probiotics in clinical practice / Gregor Reid, Jana Jass, M. Tom Sebulsky, John K. McCormick // Clinical microbiology review. — 2003. — Vol. 16, № 4. — P. 658-672.
15. Todorov S. D. Bacteriocins from Lactobacillus plantarum — production, genetic organization and more of action / Svetoslav D. Todorov // Brazilian journal of microbiology. — 2009. — Vol. 40, № 2. — P. 209-221.
8
Summary Aheyev V. O., Derevyanko S. V.
Institute of agricultural microbiology, UAAS, Chernihiv, Ukraine THE ANTAGONISTIC FACTORS OF THE STRAINS OF BACTERIA — THE COMPONENTS OF BPS-44 AND BPS-L PROBIOTIC DRUGS
The paper shows the factors that determined antagonistic activity of the probiotic strains of bacteria — the components of BPS-44 and BPS-L probiotics. For a lactic acid bacteria strain Lactobacillus plantarum L5 it was the production of lactic acid and lysozyme, aerobic bacilli strains Bacillus subtilis B3 and 44-p — antibiotic substances and partially organic acids and lysozyme.
Key words: probiotic drugs, Bacillus subtilis, Lactobacillus plantarum, antagonism, lactic acid, lysozyme.
Cmammx nadiumna do peda^ii 12.04.2010
9
