CC BY
38
УДК 637.146.2
Боднарчук О.В., к.т.н., Шульга Н.М., к.т.н., Гудима В.В., Югель Н.Ф., д.т.н. ®
Технолог1чний тститут молока та м 'яса УААН, м. Киге
АНТАГОН1СТИЧНА АКТИВН1СТЬ ЗАКВАШУВАЛЬНО1 М1КРОФЛОРИ КЕФ1РУ
Дослгджено антаготстичну актиетсть грибкоеог кеф1рног закваски та закеашуеальног композицп для еиробництеа кеф1ру щодо патогенног та умоено-патогенног мжрофлори. Показано особлиеост1 стльного культиеуеання у молоц закеашуеальног мжрофлори кеф1ру та тест-культур бактерш групи кишкоеог палички, Staphylococcus aureus i Bacillus subtilis.
Ключовi слова: грибкоеа кефiрна закеаска, закеашуеальна композищя, кефiр, молочноки^i бактерп, дрiжджi, антаготстична актиетсть, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis.
Кефiр - продукт молочнокислого та спиртового бродшня, що виробляють сквашуванням молока симбютичною кефiрною грибковою закваскою. У результат ферментування у цьому кисломолочному напо! накопичуеться значна кшьккть молочно! кислоти, етанолу, вуглекислого газу, а також смако-ароматичних сполук. Завдяки !м формуються специфiчнi ознаки продукту та посилюються функщональш властивостi, а утворення деякими мжрооргашзмами бактерiоцинiв, специфiчних бiологiчно активних полiсахаридiв зумовлюе пригнiчення росту патогенно! мжрофлори та дае змогу вщнести кефiр до комплексних пробiотикiв [1].
За свщченнями численних дослiдникiв [2-3] антагошстичш взаемовiдносини обумовленi високим ступенем конкурентност мiкрофлори, що залежить вщ енерги кислотоутворення, стiйкостi до юнцевих продуктiв бродiння (молочно!, оцтово! та шших кислот), потреб у поживних речовинах, низького рiвня окисно-вiдновного потенщалу (неспецифiчний антагонiзм) та спричиненi дiею специфiчних факторiв (утворення перекису водню, метаболiтiв антибiотикоподiбно!' природи, бактерiоцинiв). Зокрема вщомо, що потенцiал антагонiстично!' активност мiкробно! асоцiацi! кефiрного грибка зростае за рахунок вироблення нейтральних лшдав, амiнокислот, коротколанцюгових жирних кислот ферменив, лiзоциму, якi руйнують стiнки бактерiальних клiтин.
Прагнення до iнтеграцi! у св^ову спiльноту ставлять перед молокопереробними тдприемствами важливу задачу - адаптуватися до умов на мiжнародному ринку. I яюсть та безпечнiсть продукци при цьому е основним шструментом у боротьбi за ринки збуту. Зважаючи на значний рiвень бактерiального забруднення молочно! сировини зростае ймовiрнiсть присутностi потенцiйно небезпечних мiкроорганiзмiв у готовому продукт в разi недотримання технолопчних режимiв i санiтарних правил тд час його виробництва. Ц перестороги потребують ретельно! перевiрки.
® Боднарчук О.В., Шульга Н.М., Гудима В.В., Югель Н.Ф., 2010
7
Незважаючи на те, що кислотшсть е важливим чинником регулювання росту та виживання сторонньо! мiкрофлори, ферментованi молочнi продукти з високою кислотнiстю все ж таки е причиною спалахiв харчових отруень. £ свщчення, що кислоторезистентнi штами бактерiй групи кишково! палички, спороутворювальних бактерiй та стафiлококiв можуть виживати i впродовж довготривалого зберiгання продукту [4].
У Технолопчному iнститутi молока та м'яса розроблено заквашувальну композицш для виробництва кефiру. Бiотехнологiя ще! культури передбачае використання як основи природного симбюзу грибково! кефiрноl закваски у кшькосп 25% з додатковим залученням видiлених виключно з кефiрних грибкiв лактобактерiй :видiв Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. lactis biovar diacetilactis, Streptococcus thermophilus та лактозонегативних дрiжджiв Saccharomyces unisporus. 1хне застосування дае змогу одержати продукт з характерними для кефiру ознаками.
Оскшьки вiдомо, що молочноки^ бактери та дрiжджi пригнiчують життедiяльнiсть патогенних та умовно-патогенних мiкроорганiзмiв i здатнi до !хнього конкурентного виткнення, науковий та практичний iнтерес становило вивчення антагошстичних властивостей кефiрних заквасок.
Метою роботи було дослщити антагошстичну активнiсть грибково! кефiрно! закваски та новостворено! бактерiально! композици для виробництва кефiру щодо основних небезпечних контамшанив.
Об'ектами дослiджень були грибкова кефiрна закваска (ГКЗ), заквашувальна композицiя (ЗК), дрiжджi виду Saccharomyces unisporus, 15 штамiв тест-культур видiв Escherichia coli, Escherichia blattae, Enterobacter cloaceae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Proteus morganii, Proteus vulgari, Proteus rettgeri.
Матер1али та методи дослщжень. Антагошстичну актившсть заквасок щодо тест-культур визначали методом «лунок» за величиною зон затримки росту [5], а також за приростом чисельност вщповщно! тест-культури порiвняно з !! початковим вмiстом пiд час спшьного культивування у молоцi упродовж 5 дiб за кiлькостi шокуляту 1%.
Добовi тест-культури змивали з поверхш м'ясо-пептонного агару (МПА) фiзiологiчним розчином та доводили густину бактерiально! суспензи за стандартом мутностi Мак-Ферлана до 108 КУО/см3.
Для одержання грибково! кефiрно! закваски у пастеризоване знежирене молоко вносили кефiрнi грибки за сшввщношення «грибки : молоко» 1:30 та здшснювали культивування за температури (20±2) °С упродовж 16-20 годин до утворення згустку.
Кшькють життездатних кл^ин бактерiй визначали стандартними методами: молочнокисло! мкрофлори - згiдно з ГОСТ 10444.11-89, дрiжджiв - згiдно з ГОСТ 10444.12-88, Staphylococcus aureus - згщно з ГОСТ 10444.2-94. Чисельшсть мiкроорганiзмiв роду Escherichia sp. аналiзували методом висiву серiйних розведень на селективне хромогенне середовище (Coliform-agar), Bacillus subtilis - на середовище МПА.
8
PiBeHb активно! кислотносп визначали потенцюметрично.
Повторювашсть дослiдiв триразова.
Результати дослщжень. Результати з визначення антагошстично! активностi ГКЗ, заквашувально! композици ЗК та дрiжджiв виду Saccharomycs unisporus, що входять до складу заквашувально! композици, показали !хню високу здатшсть до пригнiчення росту патогенно! та умовно-патогенно! мiкрофлори (табл. 1).
Таблиця 1.
Антагошстнчна актившсть грибково!' кефирно!' закваски, заквашувально! композицi'l' для виробництва кефиру та дргжджчв_
Кшьшсть Величина зон затримки росту тест-
штам1в тест- культур, мм
Tecr-Ky^bTypa культур ГКЗ ЗК Saccharomyces unisporus 5502
Escherichia coli 3 14±4 15±2 19±10
Escherichia blattae 1 21±3 15±1 25±2
Enterobacter cloaceae 1 18±2 15±1 29±4
Staphylococcus aureus 3 15±3 16±4 14±5
Staphylococcus epidermis 1 19±2 13±3 29±2
Bacillus subtilis 2 32±3 30±2 32±4
Proteus sp. 3 14±4 12±1 12±3
Pseudomonas aeruginosa 1 8±1 8±1 12±1
Встановлено, що бiльшiсть Í3 проаналiзованих патогенних i умовно-патогенних бактерш були чутливими до дií заквашувальних культур. Так, величина зон затримки росту спороутворювальних мiкроорганiзмiв B. subtilis становила вщ 28 мм до 36 мм, бактерш групи кишковоí палички E. blattae - вщ 14 мм до 27 мм, стрептокоюв виду S. epidermis - вщ 10 мм до 31 мм. Як свщчать експериментальнi даш, ГКЗ та дрiжджi активнiше пригшчували усi тест-культури, особливо мжрооргашзми родини Enterobacterciae, у порiвняннi 3i ЗК. Очевидно, це обумовлено дieю лактобацил та iнших складових мжробюти грибковоí закваски, якi у процес метаболiзму утворюють органiчнi кислоти, у тому чи^ молочну кислоту та ряд коротколанцюгових жирних кислот. Помiрнiша антагонiстична активнiсть ЗК пов'язана з тим, що до íí складу залучено лише чверть об'ему мжробного симбiозу кефiрних грибкiв.
Водночас кефiрнi закваски та дрiжджi характеризувалися вщносно низьким рiвнем iнгiбування псевдомонад (7-13 мм) та протею (10-18 мм).
Наявшсть зон пригшчення небезпечних контамшанив мiкрофлорою кефiрних заквасок на твердих середовищах недостатньо висвiтлюe характер "х взаeмовiдносин у виробничих умовах. Слщ враховувати, що у рiдкому середовищi - молоцi, кiлькiсть життездатних кл^ин мiкроорганiзмiв та видiлених ними антимжробних речовин знижуеться. Тому оцiнка росту вЫх груп мiкроорганiзмiв заквашувально!' мжрофлори та виживання шкiдливоí у ходi технологiчного процесу виробництва кефiру е доречною i привертае увагу, насамперед, з питань безпеки та якост виробленого продукту.
За спшьного росту тест-культур та дослщжуваних культур у молощ встановлено, що мiкрофлора кефiрних заквасок згубно дiе на контамшантш бактери (рис. 1).
9
1
а) 1 доба 5 Aiö
| ИЗ Escherichia sp. □ Escherichia sp.+ГКЗ □ Escherichia sp.+Зк]
б)
1,6
1,2
i
0,8
0,4
—
I--I
1 доба
E3 S.aureus □ S.aureus+ГКЗ
5 д1б_
□ S.aureus+ЗК
в)
3
2,5 2
I1: 1
0,5 0
-0,5
ЕЭ B.subtilis □ B.subtüis+ГКЗ
□ B.subtilis+ЗК
Рис. 1. 1ндекс антагошстичноУ активност1 ГКЗ та ЗК щодо тест-культур п1д час сп1льного культивування з упродовж 5 д1б:
а) - Escherichia sp., б) - S.aureus, в) - B.subtilis
5
4
3
2
1
0
2
0
10
Про це свщчить ютотне зниження чисельност Bcix тест-культур у продуктах, вироблених як 3i застосуванням симбютично! грибково! закваски, так i новостворено! заквашувально! культури. Зокрема, найвразлившими були клiтини B. subtilis. Пщ час спiльного культивування з ГКЗ та ЗК чисельшсть спороутворювальних бацил знижувалася вiд 0,16 lg КУО/см3 на 1 добу до 0,35 lg КУО/см3 тсля 5 дiб зберiгання кефiру порiвняно з початковим вмiстом (4,34 lg КУО/см3), тодi як у разi шокулювання молока лише бактерiями B. subtilis кшьккть останнiх наприкiнцi зберiгання досягала 6,48 lg КУО/см3.
У разi стльного нарощування у молоцi заквашувально! мжрофлори та бактерiй роду Escherichia sp. також спостерiгали значну затримку росту кишково! палички на вщмшу вiд !хнього росту у чистш культурi. Однак упродовж п'ятиденного збер^ання дослiджуваних зразкiв було вiдмiчено приркт чисельностi вказано! тест-культури на 0,28-0,98 lg КУО/см3. У свiжовироблених кефiрах помiчено тенденцiю до уповiльнення росту бактерш групи кишково! палички з тдвищенням кислотностi. Варто акцентувати увагу, що рiвень активно! кислотностi у вЫх молочних згустках досягав вщ 3,92 од. рН до 4,02 од.рН. Проте, навт за умови тако! низько! кислотностi середовища дослщжуваш штами роду Escherichia були здатш до виживання. Це свiдчить про високу небезпеку цих контамшанив у молочнш промисловостi, адже посилене !хне розмноження може не лише зумовити вади кисломолочних напо!в: надмiрне газоутворення, що супроводжуеться утворенням збродженого згустку, нечистий смак та запах продукту, але й стати причиною харчових отруень.
Аналопчну тенденцiю спостерiгали i в разi спiльного культивування ГКЗ та ЗК з S. aureus. Рiвень пригшчення золотистого стафiлококу пiд впливом заквашувально! мжрофлори становив вiд 56% до 68%. Упродовж 5 дiб зберкання зразку, виробленого з використанням ЗК, чисельшсть S. aureus знижувалася ще на 28%. Разом з тим активна кислотшсть середовища упродовж зазначеного перюду змшювалася незначно (вiд 4,29 од.рН до 4,17 од.рН). Очевидно, антагошстичш властивост ЗК обумовленi не лише за рахунок накопичення молочно! кислоти, але й iнших бюлопчно активних речовин.
Слiд зазначити, що у молощ мiкрофлора ЗК штенсившше гальмувала розвиток усiх тест-культур, знижуючи чисельнiсть останнiх на 1,5-2,0 порядки. Пригшчення !хнього росту можна пояснити не лише несприятливим впливом кисло! реакци продукту, зниженням температури впродовж зберкання, але й антагонiстичною дiею заквашувально! мiкрофлори. Проте результати дослщжень показують, що Escherichia sp. i S. aureus можуть виживати i розмножуватися тд час виробництва продукту, !хнш умiст може зростати у 2,02,2 рази наприкiнцi зберкання. Крiм того, небезпечною е також забруднення цими мжрооргашзмами продукту на вЫх технологiчних етапах виробництва. Також основш зусилля необхiдно спрямовувати на полшшення якостi вихiдно! сировини.
Контамiнування молока сторонньою мiкрофлорою позначалося на розвитку заквашувальних культур. У всiх дослщних варiантах у порiвнянi з
11
контролями (кефiри, виготовлеш лише на кефiрних заквасках без шф^вання патогенними та умовно-патогенними бактерiями) вiдмiчено зниження чисельност всiх складових мiкроорганiзмiв заквасок (табл. 2). Так, умкт мезофiльних лактобактерiй ГКЗ та ЗК через 1 добу стльного культивування з тест-культурами знижувався вщ 8,5% до 11,5%, ароматоутворювальних молочнокислих мiкроорганiзмiв - вiд 4,5% до 18,0%, дрiжджiв - вiд 4,0% до 13,5%. Упродовж 5 дiб зберкання подiбна тенденцiя зберiгалася. Ймовiрним поясненням тако! динамiки розвитку заквашувально! мiкрофлори може бути конкурування за поживш речовини, а також часткове гальмування пiд дieю продуктiв метаболiзму сторонньо! мiкрофлори. Слiд вiдмiтити, що з-помiж проаналiзованих варiантiв спороутворювальнi бацили В. subtilis найменше впливали на розвиток уЫх складових заквашувально! мжрофлори. У разi застосування ЗК уповшьнення розвитку молочнокислих бактерiй було менш вираженим порiвняно з ГКЗ, очевидно, завдяки додатковому залученню до складу ново! бактерiально!' композицi!' дрiжджiв Saccharomycеs unisporus, яю збагачують середовище рядом незамшних продуктiв свого метаболiзму i е факторами росту для лактобактерш.
Таблиця 2.
Розвиток мiкрофлори кефирноУ грибково! закваски та заквашувально*!
композищ! за стльного культивування з тест-культурами
Об'екти дослщжень Чисельнiсть, lg КУО/см3
ММКБ АМКБ дрiжджiв
1 доба 5 дiб 1 доба 5 дiб 1 доба 5 дiб
ГКЗ 8,90±0,25 8,45±0,21 7,35±0,18 6,90±0,22 5,77±0,31 5,95±0,26
Escherichia sp.+ ГКЗ 7,86±0,23 7,62±0,18 7,11±0,17 6,46±0,15 5,00±0,11 4,38±0,10
S. aureus+ГКЗ 8,16±0,24 7,20±0,16 6,00±0,27 6,78±0,17 5,65±0,20 4,15±0,13
B.subtilis+ГКЗ 8,15±0,21 6,90±0,17 6,60±1,21 6,49±0,18 5,04±0,15 4,90±0,15
ЗК 8,95±0,17 8,75±0,21 8,85±0,21 8,41±0,20 4,78±0,21 4,88±0,17
Escherichia sp.+ ЗК 8,04±0,26 7,90±0,22 8,50±0,18 8,34±0,23 4,70±0,22 4,15±0,21
S. aureus+ЗК 8,26±0,14 8,23±0,15 8,08±0,22 8,00±0,20 4,78±0,21 4,26±0,25
B.subtilis+ЗК 8,80±0,19 8,72±0,12 8,43±0,09 8,39±0,21 4,35±0,16 4,30±0,24
Примита. МКБ - мезофiльнi молочнокислi бактерп,
АМКБ - ароматоутворювальнi молочнокислi бактерй'
Таким чином, новостворена заквашувальна композищя волод1е високим антаготстичним потенщалом щодо патогенних та умовно-патогенних бактерш.
Висновки. Встановлено, що мжрофлора ГКЗ та ЗК для виробництва кеф1ру волод1е антагошстичною актившстю щодо бактерш родини Enterobacteriaceae, золотистого стафшококу S. aureus та спороутворювальних бацил B. subtilis, спричиняючи зони затримки росту на твердому середовищ! вщ 12 мм до 36 мм. У результат! дослщжень особливостей стльного культивування заквашувально! мжрофлори кеф1ру та означених тест-культур показано здаттсть новостворено! композици пригшчувати розвиток патогенних та умовно-патогенних бактерш на 1,5-2,0 порядки упродовж 5 д1б
12
зберкання продукту. Доведено, що контамшування молока сторонньою мжрофлорою призводить до уповшьнення розвитку молочнокислих мiкроорганiзмiв на 8,5-11,5%. Отриманi результати мають велике значення для наукового обгрунтування мiкробiологiчних ризикiв на шляху наближення нащональних стандартiв щодо безпечност молочних продуктiв до вимог £С.
Л1тература
1.Farnworth E.R. Kefir - a complex probiotic // Food Science and Technology Bulletin: Functional Foods. - 2004 . - Vol. 2. - P. 1-17.
2.Karagozlu N., Karagozlu C., Ergonul B. Survival characteristics of E. coli O157:H7, S. thyhimurium and S. aureus during kefir fermentation // Czech. J. Food Sci. - 2007. - Vol. 25, № 4. - P. 202-207.
3.Gulmez M., Guven A. Survival Characteristics of Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes 4b and Yersinia enterocolitica O3 in ayran and modified kefir as pre- and post fermentation contaminant // Vet. Med. Czech. - 2003. -Vol.48, № 5. - P. 126-132.
4.Ulusoy B.H., Colac H., Hampicyan H., Erkan M. E. An in vitro study on the antibacterial effect of kefir against some food-borne pathogenes // Turk Microbi Cem Derg. - 2007. - Vol. 37, № 2. -. P. 103-107.
5.Егоров Н.С. Микробы-антагонисты и биологические методы определения антагонистической активности. - М.: Высшая школа, 1975. - 209 с.
Summary
Bodnarchuk O., Shulga N., Gudyma V., Kigel N.
ANTAGONISTIC ACTIVITY OF KEFIR STARTERS
Antagonistic activity of grain kefir starter and starter composition for kefir manufacture against same pathogens was investigated. Specificity of simultaneous cultivation of kefir starters and test-cultures of coli-forms bacteria, Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis was shown in milk.
Стаття надшшла доредакцИ 9.04.2010
13
