CC BY
29
Ri'qi: - tmy Mcchanisms
înTïiosystems
* %
Regulatory Mechanisms
in Biosystems
EISSN 2519-8521 (Print) ISSN 2520-2588 (Online) Regul. Mech. Biosyst., 9(1), 69-74 doi: 10.15421/021809
Strains of soil microorganisms promising for the creation
of a complex plant protection product against mycoses and harmful insects
O. A. Drehval, A. A. Dreus, N. V. Cherevach, T. V. Sklyar
Oles Honchar Dnipro National University, Dnipro, Ukraine
Article info
Received 17.01.2018 Received in revised form 12.02.2018 Accepted 26.02.2018
Oles Honchar Dnipro National University, Gagarin ave., 72, Dnipro, 49010, Ukraine. Tel.: +38-056-760-85-14. E-mail: microviro@ukr.net
Drehval, O. A., Dreus, A A., Cherevach, N. V., & Sklyar, T. V. (2018). Strains of soil microorganisms promising for the creation of a complex plant protection product against mycoses and harmful insects. Regulatory Mechanisms in Biosystems, 9(1), 69-74. doi: 10.15421/021809
We evaluated the antagonistic activity of 23 strains of Bacillus spp. against phytopathogenic fungi Fusarium oxysporum, F. culmorum, F. moniliforme, Cladosporium herbarum, Alternaria alternata and Aspergillus niger. The antagonistic activity was tested by agar diffusion (the method of blocks). For determining the influence of bacteria on barley plants , ardent seeds were treated by cultural liquid (dilution 1 : 10) for 2 hours and germinated in Petri dishes on moist filter paper. The fungistatic effect of Bacillus spp. separately and in combination with entomopathogens (in equal ratio) was determined by the level of inhibition of the fungi Fusarium spp. on a solid nutrient medium with 5% of the culture liquid. Insecticidal activity of microorganisms was determined in the model experiments by the percentage of death of the caterpillar Archips podana Scop. Strains of Bacillus sp. KMB-3 and Bacillus sp. KMB-6 inhibited the growth of all test cultures (zones of growth inhibition 11.4-30.6 and 11.5-29.4 mm, respectively). We established the absence of antagonism between selected strains and entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis IMB-7186, fungi Beauveria bassiana IMB-F-100043. We found that treatment of barley seeds with culture liquids of Bacillus sp. KMB-3 and Bacillus sp. KMB-6 didn't have a negative effect on the morphometric indices and dry weight of seedlings. We established that the highest percentage of growth inhibition of F. culmorum IMB-F-50716 was provided by a complex of Bacillus sp. KMB-3, B. bassiana IMB-F-100043 and B. thuringiensis IMB-7186, whose action was at the same level as the action of monoculture Bacillus sp. KMB-3 (85.4% and 84.7%, respectively). The highest percentage inhibition of growth of F. oxysporum IMB-F-54201 was provided by a complex of strains of Bacillus sp. KMB-3 and B. bassiana IMB-F-100043, whose effect was slightly inferior to that of the monoculture Bacillus sp. KMB-3 (68.4% and 75.1%, respectively). The insecticidal activity of complexes Bacillus sp. KMB-3, B. bassiana IMB-F-100043, B. thuringiensis IMB-7186 or Bacillus sp. KMB-6, B. bassiana IMB-F-100043, B. thuringiensis IMB-7186 insignificantly differed from that of the complex entomopathogens B. bassiana IMB-F-100043 and B. thuringiensis IMB-7186 (71.1%, 73.3% death versus 80.0%). The selected microbial complexes can be considered as promising for the development of a preparation for the protection of plants against fungal diseases and harmful insects.
Keywords: antifungal action; Bacillus sp.; biocontrol; plant diseases; phototoxicity; insecticidal activity
Штами грунтових MiKpoopraHi3MiB, перспективш для створення комплексного препарату захисту рослин ввд мiкoзiв та шкщливих комах
О. А. Дрегваль, А. А. Дреус, Н. В. Черевач, Т. В. Скляр
Дтпровський нацюнальний утверситет Мет Олеся Гончара, Дтпро, Укра'та
Оцшено антагошстичну актившсть 23 шташв Bacillus spp. вщносно фгтопатогенних rprfiB Fusarium oxysporum, F. culmorum, F. monili-forme, Cladosporium herbarum, Alternaria alternata та Aspergillus niger. Антагошстичну актившсть пеpевipяли методом дифузи в агар за дiаметpом зон затримання росту навколо блоков. Для визначення впливу бактерш на рослини ярого ячменю насшня обробляли культуральною рщиною (розведення 1 : 10) упродовж двох годин i пророщували в чашках Петря на зволоженому фшьтрувальному rnrapi. Фунпстатичну дто Bacillus spp. окремо та в комплекс з ентомопатогенами (в однаковому сшввщношенш) визначали за piвнем пригшчення гpибiв Fusarium spp. на щшьному живильному середовищ^ до складу якого входило 5% культурально! рщини. 1нсектицидну актившсть мiкpооpганiзмiв визначали в модельних експериментах за вщсотком загибелi гусениць Archips podana Scop. Вщбрано штами Bacillus sp. КМВ-3 та Bacillus sp. КМВ-6, що пригшчували piст уах дослщжуваних тест-культур. Установлено вщсуттсть антагошзму мгж вщбраними штамами та ентомопатогенними бактеpiями Bacillus thuringiensis 1МВ-7186 i грибами Beauveria bassiana IMB-F-100043. Показано, що обробка насшня ярого ячменю культуральними рщинами Bacillus sp. КМВ-3 та Bacillus sp. KMB-6 негативно не впливала на морфометричт показники та суху вагу проростков. Найбшьший вщсоток шпбування росту F. culmorum IMB-F-50716 забезпечив комплекс Bacillus sp. КМВ-3, B. bassiana ШВ-F-100043. i B. thuringiensis 1МВ-7186, дiя якого була на piвнi дп монокультури Bacillus sp. КМВ-3 (85,4% та 84,7% вщповщно). Найб^ше пригшчення росту F. oxysporum 54201 забезпечив комплекс Bacillus sp. КМВ-3 i B. bassiana 1МВ^-100043, дiя якого незначно поступалася ди
монокультур (68,4% та 75,1% вщповщно). У модельних дослщах шсектицидна акшвшсть комплекав Bacillus sp. KMB-3, B. bassiana IMB-F-100043, B. thuringiensis IMB-7186 або Bacillus sp. KMB-6, B. bassiana IMB-F-100043, B. thuringiensis IMB-7186 в1дносно гусениць Archips podana Scop. незначно в1др1знялася вщ ди ентомопатогешв B. bassiana IMB-F-100043 i B. thuringiensis IMB-7186 (71,1% та 73,3% загибел1 проти 80,0%). Пщбран мжробш комплекси можуть бути використан для розроблення бюпрепарату захисту рослин вщ грибкових хвороб i шкздниюв.
Ключовi слова: антифунгальна д1я; Bacillus spр.; бюконтроль; хвороби рослин; фгготоксичшсть; шсектицидна актившсть
Вступ
XiMi4Hi пестициди широко застосовують для захисту сшьсь-когосподарських рослин в!д збудник1в захворювань i комах-шюд-никiв. Це один i3 найважливших елеменпв штенсивних сшьсько-господарських технологи, спрямованих на отримання високих i стабiльних врожа!в рослин (Iutynska & Ponomarenko, 2010). Проте хiмiчнi препарати екологiчно небезпечт, осюльки повiльно роз-кладаються, продукти 1х розпаду потрапляють у Грунт i негативно впливають на бiоту (Meena & Kanwar, 2015). У результат! штен-сивного застосування пестицидiв знижуеться чисельнсть i житте-здатнсть Грунтових сапрофiтних мжроорганзм1в, i навпаки, щд-вищуеться вмст шюдливих органзм1в, що викликае поступове зниження родючост! Грунпв та зменшення виробництва сшьсько-господарсько! продукцй Необхщнсть отримання еколопчно чисто! продукцй вимагае розширення дослвджень, пов'язаних !з роз-робленням систем бюлопчного захисту, що не порушують еколопчно! рiвноваги Грунту, сприяють полшшенню його фггосантар-ного стану (Iutynska & Ponomarenko, 2010; Hollensteiner et al., 2017).
Серед антаготсттв фiтопатогенних мжроорганзм1в сл!д в!дм-тити представник1в роду Bacillus, яю продукують р!зн антимж-робн речовини, таи як циктчт лшопетиди, а також лпичн фер-менти та хпинази (Alvarez et. al., 2012; Ji et al., 2013; Meena & Kanwar, 2015; Yamamoto et al., 2015; Bodhankar et al., 2017; Dimkic et al., 2017; Molinatto et al., 2017; Rishad et al., 2017). Лтопептиди, як! продукуються B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. pumilus (мжо-субтилш, фенгшини А i В, пурин), проявляють антифунгальну дю, тод як сурфактин мае широкий спектр анIибактерiалъноl до (Ji et al., 2013; Khong et al., 2013; Meena & Kanwar, 2015). Крш того, широко розповсюджен у Грунт! бактерй B. amyloliquefaciens синтезують амшол]зин який не належить до лшопептидв i при-гнчуе рют переважно грампозитивних бактерш (Chen et al., 2016).
Переваги циктчних лшопептидв пор!вняно з хмчними засо-бами захисту рослин - низька токсичнiсгъ, високий ступзнь бюдег-радацй та безпечнiстъ для навколишнього середовища (Meena & Kanwar, 2015; Chen et al., 2016). Серед шших представниюв роду Bacillus сл!д вщмпити широко вщомий енгомопатогенний мжро-органзм B. thuringiensis, деяю штами якого здшснювали антагонс-тичний вплив на фггопатогенн гриби роду Verticillum. Автори припускають, що значний внесок в антифунгалъну дю, крш вто-ринних метаболшв, вносять мжолпичт хпинази, як! продукуються цими штамами (Hollensteiner et al., 2017). 1з ризосфери куку-рудзи нещодавно видлено штам Lysinibacillus sphaericus, який крм ларвшидних метаболшв продукував 2-пентил-4-хшолшкар-бонову кислоту, що проявляе антифунгальну дю рвного ступеня проти фггопатогенних гриб!в Alternaria alternata, Curvularia lunata, Aspergillus sp., Sclerotinia sp., Bipolaris spicifera, Trichophyton sp. (Nau-reen et al., 2017). Грунтов! штами бацил входять до складу ризосфери та не ттьки захишають кореневу систему ввд збудникв хвороб, а i продукують бюлопчно-активн речовини, що стимулюють рют i розвиток рослин, так! як iндолiлоцгова кислота, сприяють солюбтзацй фосфаттв i силжапв, а також шдукують пщвищення резистентном! рослин до збудниюв мкозш (Khong et al., 2013; Yamamoto et al., 2015; Hollensteiner et al., 2017; Naureen et al., 2017). На !х основ! розробляються бюлопчт препарати для захисту та полшшення живлення сiлъсъкогосподарсъких рослин. Бiлъшiстъ розроблених мжробних препаратов для захисту рослин в!д хвороб i шюдниюв створено на основ! монокультур мжроорганзм1в. Ос-таннм часом зусилля науковц1в спрямован на створення мжроб-них препарата комплексно! да на основ! асощацш мжроорганз-м1в (Srivastava et al., 2010; Egamberdieva et al., 2016, 2017).
Автори статп розробили комплексний шсекто-акарицидний мжробний препарат Бактофунгiн-LS на основ! ентомопатогенних
мжроорганзм1в B. thuringiensis IMB-7186 та Beauveria bassiana IMB-F-100043, який показав високу активность проти широкого спектра комах-шюдниюв (Drehval et al., 2015). Bраховуючи потреби сшьськогосподарського виробництва щодо збереження врожаю, доЦльно розширити сфери застосування цього препарату не тльки проти шюдниюв, а i проти збудник1в грибних хвороб.
Ыега ще! статп - видлення бактерш роду Bacillus - ангагонс-т1в фiгопагогенних гриб!в, перевiрка вщсутносп фiгогоксичносгi вид1лених культур, визначення взаемовщносин бакгерiй-ангаго-н1ст1в з ентомопатогенними мжроорганзмами, що входять до складу бактофунгшу, дослгдження фунгiстатичноl дИ комплекс!в ангагонста фiтопатогенiв та ентомопатоген1в вгдносно гриб!в роду Fusarium, а також шсектицидно! активностг вгдносно гусениць Archips podana Scop.
MaTepiai i методи досл1джень
Антагон1стичну активн1сть штампв Грунтових бактер1й вгднос-но фггопатогенних грибiв перевiряли методом дифузй в агар за даметром зон затримання росту навколо блок1в. Як тест-культури використано штами фiтопатогенних грибiв iз колекцй вiддiлу фi-зiологii та систематики мжромщега IMB НАН Укратни Fusarium oxysporum IMB-F-54201, F. culmorum IMB-F-50716, Cladosporium herbarum IMB-F-16878, а також штами з колекцй культур мжро-органзм1в кафедри мiкробiологii, вiрусологii та бiотехнологii ДНУ iменi Олеся Гончара, видшет зi зразк1в Грунту, ураженого насшня та плодiв: F. oxysporum KMB-F-12, F. moniliforme KMB-F-23, Alternaria alternata KMB-F-16, Aspergillus niger KMB-F-25. Фiто-патогенн1 гриби вирощували на картопляному агарi з 1% глюкози. Bзаeмовiдносини бактерiй-ангагонiстiв з ентомопатогенними мжроорганзмами визначали вищезгаданим методом дифузй в агар.
Для перевiрки вщсутносп фiтотоксичноl дй штам1в на росли-ни ярого ячменю сорту Кристалы бактерй вирощували у м'ясо-пептонному бульйон1 (ЫПБ) на мжробюлопчнш качали! (200 об./хв) за 29 °С три доби. Насiння ячменю (100 насшин) об-робляли культуральною р1диною у розведенн1 1 : 10 упродовж двох годин i пророщували в чашках Петрi на зволоженому ф!ль-трувальному паперi. На четверту добу дослгду визначали ввдсоток пророслого нас1ння, довжину та суху масу корен1в i надземноТ час-тини рослин. Як контроль використовували насiння, оброблене стерильною водопров1дною водою.
Для визначення фунпстатично! дй антагонспв та ентомопато-генiв окремо кожного та в комплекс (у р}вних сп1вв1дношеннях) культуральн1 р1дини мiкроорганiзмiв вносили у розплавлене жи-вильне середовище Чапека (5%о в1д об'ему) в чашки Петр1, на по-верхню якого п1сля застигання розмзщували блок 10-добово! куль-тури гри6!в F. oxysporum IMB-F-54201 або F. culmorum IMB-F-50716. Bизначали вщсоток шпбування росту гри6!в на шосту добу ж^няно з контролем (середовищем без культурально! р1дини).
Iнсектицидну акгивнiсть культуральних р1дин м1кроорган1з-м!в (розведення 1 : 10) визначали у модельних доипдах за вщсот-ком загибел1 гусениць Archips podana Scop. Контролем слугували комахи, корм яких обробляли водопров1дною водою. Статистичну обробку даних здiйснювали за допомогою комп'ютерно! програ-ми Statistica 6 (StatSoft Inc., USA). Достов!рнсть в1дм1нностей результатов визначали !з застосуванням ANOVA.
Результата
3i зразк1в Грунту чорнозему звичайного видiлено 23 !золяти грампозитивних аеробних i факультативно-анаербних споротв!р-них бактерш, як! попередньо в1днесено до роду Bacillus, та дослщ-жено на ангагонсшчну активн1сть в1дносно штам1в фггопатоген-
них грибТв - збудникв фузаргозу (F. oxysporum KMB-F-12, F. oxysporum IMB-F-54201, F. culmorum IMB-F-50716, F. moniliforme KMB-F-23), альтернаргозу (A. alternata KMB-F-16), 4opHoï цвт (A. niger KMB-F-25), кладоспоргозу (С. herbarum IMB-F-16878). 1з 23 тзолятв 14 проявили фунпстатичну Дю (табл. 1).
Найперспективтшими за спектром да виявилися штами КМВ-3 та KMB-6, якг пригшчували рст уск перевгрених тест-культур, та-кож i3 дещо меншим спектром високу антагошстичну дю проявили штами КМВ-5 та КМВ-8. Серед перевгреших тест-культур найчут-ливiшими до да видiлених штамiв бактерш виявилися А. alternata KMB-F-16, A. niger KMB-F-25 та С. herbarum IMB-F-16878, найстш-кшими - F. oxysporum KMB-F-12 i F. oxysporum IMB-F-54201 (рис. 1).
Оскшьки основна мета дослдження - пошук мжробТв-антаго-нiстiв для створення комплексного бiопрепарату для захисту рос-лин вТд шюдниюв i хвороб, здГйснено перевiрку взаемовщношен-ня вiдiбраних вищезгаданих штамТв антагошстГв та ентомопато-генних бактерiй B. thuringiensis IMB-7186 та грибiв B. bassiana IMB-F-100043 - компонент бюпрепарату Бактофунтн^ (рис. 2).
yd дослТджеш штами не пригшчували ргст B. thuringiensis IMB-7186, три штами (KMB-3, KMB-5, KMB-6) також не пригш-чували рiст B. bassiana IMB-F-100043, штам КМВ-8 показав не-значне шпбування росту B. bassiana. Bраховуючи актившсть i спектр до видлеших антагошстГв, для подальшоï роботи обрано два штами бацил (KMB-3 та KMB-6).
Таблиця 1
Антагошстична актившсть штамзв бактерш роду Bacillus до фгтопатогенних грибв (n = 8)
_Даметр зони пригшчення росту тест-культур, мм_
Fusarium xysporum Fusarium oxysporum Fusarium culmorum Fusarium moniliforme Alternaria alternata Aspergillus niger Cladosporium herbarum
KMB-F-12 IMB-F-54201 IMB-F-50716 KMB-F-23 KMB-F-16 KMB-F-25 IMB-F-16878
KMB-1 0 13,2 ± 0,3 0 11,2 ± 0,3 0 0 0
KMB-2 0 0 20,6 ± 1,0 20,4 ± 0,8 24,0 ± 0,7 20,2 ± 0,5 26,1 ± 1,1
KMB-3 13,3 ± 0,3 11,4 ± 0,3 18,5 ± 0,7 21,5 ± 0,6 30,6 ± 1,2 24,2 ± 0,7 28,3 ± 2,0
KMB-4 12,4 ± 0,4 0 13,3 ± 0,5 0 0 0 15,2 ± 0,8
KMB-5 0 17,5 ± 0,7 21,4 ± 1,2 19,6 ± 0,5 28,5 ± 0,9 25,1 ± 0,9 27,4 ± 1,0
KMB-6 11,5 ± 0,2 15,2 ± 0,9 23,2 ± 1,5 20,5 ± 0,7 27,2 ± 0,6 29,4 ± 0,6 23,5 ± 0,9
KMB-7 15,3 ± 0,8 15,1 ± 0,6 0 19,3 ± 0,2 27,3 ± 0,8 19,5 ± 0,3 26,5 ± 0,5
KMB-8 0 18,5 ± 0,8 20,0 ± 0,9 20,7 ± 0,3 25,5 ± 0,4 25,5 ± 0,8 28,1 ± 0,6
KMB-9 16,2 ± 0,9 0 10,5 ± 0,1 0 0 0 0,
KMB-10 12,0 ± 0,3 0 0 0 0 0 0
KMB-11 0 0 0 0 12,5 ± 0,2 9,5 ± 0,2 13,2 ± 0,3
KMB-12 10,5 ± 0,2 10,3 ± 0,2 14,5 ± 0,6 0 12,0 ± 0,5 0 0
KMB-13 0 11,2 ± 0,3 0 12,0 ± 0,4 0 10,4 ± 0,1 0
KMB-14 12,2 ± 0,4 12,4 ± 0,5 13,3 ± 0,5 10,0 ± 0,6 0 0 13,3 ± 0,4
Рис. 1. Bmrn штамТв бактерш роду Bacillus на ргст фгтопатогенних грибТв: а - Aspergillus niger KMB-F-25; б - Alternaria alternata KMB-F-16; в - Fusarium oxysporum IMB-F-54201; г - Cladosporium herbarum IMB-F-16878; 1-6 - номери штамТв-антагонТстТв
Таблиця 2
Brrnrn штамТв бактфш-антагонТстТв на формування проросткв ярого ячменю сорту Кристалш (n = 100)
Bарiант Частка пророслого Середня довжина Середня довжина обробки_насшня, %_пагошв, мм_корешв, мм
Bacillus sp. KMB-3 Bacillus sp. KMB-6 Контроль_
91,0 ±1,9 84,0 ± 6,6 95,0 ± 2,2
38,8 ± 2,0 38,3 ± 2,8 43,1 ± 2,9
261,0 ± 6,3 246,7 ± 18,4 264,7 ± 26,4
Розробляючи бгопрепарати для захисту рослин, необхТдно здй-сиювати випробування иа фТтотоксичнТсть мТкробших культур. НашТ дослТджеиня на рослинах ячменю ярого сорту Кристалш показали вТдсутшсть фiтотоксичиоï дг1 Bacillus sp. KMB-3 та Bacillus
sp. KMB-6 за морфометричними показниками та сухою вагою проросткТв. НезначнТ ргзииц вТдсотка пророслого насшня, довжи-ии пагонТв i корТння проросткТв та ïх сужд ваги статистичио ие достовгрнТ (табл. 2, рис. 3).
Рис. 2. Brrnrn найактившших штамТв-антагонТстТв фТтопатогеиних грибТв на ргст ентомопатогеиних мТкроорганТзмТв: а - Bacillus thuringiensis IMB-7186; б - Beauveria bassiana IMB-F-100043; 3,5,6,8 - номери штамТв-антагоиТстТв
Bapiairm обробки
Рис. 3. Суха маса корешв та пагонТв ярого ячменю сорту ристали за обробки культуральною рТдиною бактерш 1 - Bacillus sp. KMB-3; 2 - Bacillus sp. KMB-6; 3 - контроль (n = 100)
Ддя створення комплексного препарату важливо дослщити спольну дю Bcix компонентов мОкробного комплексу на збудник1в грибних хвороб рослин. Випробувано дою комплексiв на гриби роду Fusarium, оскольки, з одного боку, вони завдають наибольших збиткiв сольськогосподарському виробництву, з iншого - ni гриби виявилися менш чутливими до дй видлених антагонютов.
Попередня перевОрка антагоностичних властивостей ентомо-патогенних мОкроорганОзмОв показала водсутность фунгостатично" д" B. thuringiensis 1МВ-7186 i, навпаки, суттеве Онгобування росту фузарйв культурою B. bassiana IMB-F-100043. Тому дю мокроб-
них комплексiв, що складалися зi штаму-атагоноста та ентомопа-тогена B. bassiana IMB-F-100043 i штаму-антагонюта та штамiв B. bassiana IMB-F-100043 i B. thuringiensis IMB-7186 порОвнювали з дею монокультур штамiв-антагонiстiв (табл. 3, 4).
Найбольший водсоток iнгiбування росту F. culmorum IMB-F-50716 забезпечив комплекс Bacillus sp. KMB-3, B. bassiana IMB-F-100043 i B. thuringiensis IMB-7186, дя якого була на рiвнi до моно-культури Bacillus sp. KMB-3. Найбольше пригшчення росту F. oxysporum IMB-F-54201 забезпечив комплекс Bacillus sp. KMB-3 i B. bassiana IMB-F-100043, дя якого дещо поступалася да монокультур.
Таблиця 3
Комплексна дя штам1в-антагон1ст1в та B. thuringiensis IMB-7186 i B. bassiana IMB-F-100043 на лОнойний рiст F. culmorum 50716 (n = 8)
B^iom- дослщу Доаметр колони, мм !нпбування росту,% Доаметр колонй', мм Iнгiбування росту, %
третя доба третя доба шоста доба шоста доба
Kонгроль 29,7 ± 1,4 - 78,5 ± 1,9 -
Bacillus sp. KMB-3 12,0 ± 0,3** 59,6 12,0 ± 0,3** 84,7
Bacillus sp. KMB-6 11,4 ± 0,3** 61,6 11,1 ± 0,2*** 85,9
B. thuringiensis IMB-7186 30,1 ± 1,5 0,0 83,2 ± 1,1 0,0
B. bassiana IMB-F-100043 10,7 ± 0,3*** 64,0 15,5 ± 1,3* 80,3
Bacillus sp. KMB-3 + B. bassiana IMB-F-100043 11,3 ± 0,3** 62,0 11,5 ± 0,3*** 85,4
Bacillus sp. KMB-6 + B. bassiana IMB-F-100043 14,2 ± 0,9* 52,2 13,7 ± 0,3* 82,5
Bacillus sp. KMB-3 + B. bassiana IMB-F-100043 11,3 ± 0,7** 62,0 11,3 ± 0,2*** 85,6
+B. thuringiensis IMB-7186
Bacillus sp. KMB-6 + B. bassiana IMB-F-100043 15,2 ± 0,4* 48,8 14,8 ± 1,2* 81,1
+B. thuringiensis IMB-7186
Примтка: * - Р < 0,05, ** - Р < 0,01, *** - Р < 0,001 вщносно контролю - ростом гриба за вщсутносп культуральних родин мкрооргаизтв у середовищо.
Таблиця 4
Комплексна дя штамiв-антагонiстiв та B. thuringiensis IMB-7186 i B. bassiana IMB-F-100043 на лониний рiстF. oxysporum IMB-F-54201 (n = 8)
B^îo^ дослоду Доаметр колонй', мм третя доба !нпбування росту, %> третя доба Доаметр колош", мм шоста доба !нпбування росту, %> шоста доба
Kонгроль 44, 3 ± 0,6 - 85,4 ± 0,4 -
Bacillus sp. KMB-3 23,4 ± 2,6* 47,2 21,3 ± 1,3*** 75,1
Bacillus sp. KMB-6 23,9 ± 1,7* 46,1 25,6 ± 1,6** 70,0
B. thuringiensis IMB-7186 B. bassiana IMB-F-100043 45,3 ± 2,3 18,9 ± 0,7** 0,0 57,3 87,5 ± 1,2 21,2 ± 3,3** 0,0 75,2
Bacillus sp. KMB-3 + B. bassiana IMB-F-100043 25,5 ± 2,9* 42,4 27,0 ± 2,7* 68,4
Bacillus sp. KMB-6 + B. bassiana IMB-F-100043 29,8 ±1,4* 22,7 29,4 ± 2,0* 65,6
Bacillus sp. KMB-3 + B. bassiana IMB-F-100043 +B. thuringiensis IMB-7186 Bacillus sp. KMB-6 + B. bassiana IMB-F-100043 +B. thuringiensis IMB-7186 33,2 ± 0,9* 35,2 ± 1,1* 25,1 20,6 31,4 ± 1,3* 35,4 ± 1,5* 63,2 58,5
Примтка: див. табл. 3.
1 J j ■) S 6
Bapiafrm обробки
Рис. 4. 1нсектицидна активисть мокробних культур та "х комплексов водносно гусениць Archips podana Scop.: 1 - Bacillus sp. KMB-3; 2 - Bacillus sp. KMB-6; 3 - Bacillus sp. KMB-3 + B. bassiana IMB-F-100043 + B. thuringiensis IMB-7186; 4 - Bacillus sp. KMB-6 + B. bassiana IMB-F-100043 + B. thuringiensis IMB-7186; 5 -B. bassiana IMB-F-100043 + B. thuringiensis IMB-7186; 6 - контрольно (незаражет) комахи (n = 8)
Розробляючи склад потфункщонального мОкробного препарату, доЦльно перевiриги Онсектицидну акгивн1сть комплексов ентомопатогешв Оз Bacillus sp. KMB-3 або Bacillus sp. KMB-6. Дою комплексов поровнювали з Онсектицидною активнютю B. bassiana
IMB-F-100043 + B. thuringiensis IMB-7186 (Бактофунгш-LS) та дею штамов бацил вОдносно гусениць листовшки всегдно" (рис. 4).
Шсектицидна активность комплексов Bacillus sp. KMB-3, B. bassiana IMB-F-100043, B. thuringiensis IMB-7186 та Bacillus sp. KMB-6, B. bassiana IMB-F-100043, B. thuringiensis IMB-7186 не-значно водрОзнялася вод дог ентомопатогенОв B. bassiana IMB-F-100043 + B. thuringiensis IMB-7186. Невисоку шсектицидну дю встановлено також для штаму Bacillus sp. KMB-3 (36,7% загибел личинок, Р < 0,01 порОвняно з контролем).
Обговорення
ГрунтовО штами Bacillus spр. характеризувалися рОзним ступе-нем i спектром антифунгально" дог. Iз даних логератури водомо, що бактери роду Bacillus здатно продукувати рОзно антимокробнО речовини, наприклад, циклОчно лопопептиди, яю пригночують рОст моце-лою грибОв i проростання кощдй мОкромоцепв. Зокрема, В. amyloliquefaciens CNU114001 продукував лопопептид пурин, який ха-рактеризувався активнОстю проти широкого спектра фггопатогенних грибОв Alternaria panax, Botrytis cinerea, Colletotrichum orbicu-lare, Penicillium digitatum, Pyricularia grisea та Sclerotinia sclerotiorum (Ji et al., 2013). B Оншому доипджент показано, що бактерй того самого виду бацил продукують циктчт лопопептиди сурфак-тин C, фенгоцини A i B, яю пригтачували рОст S. sclerotiorum. Штами В. amyloliquefaciens пропонуеться використовувати для бОоконтролю склеротиноального захворювання стовбуровою гнил-
лю (Alvarez et al., 2012). Бактери, якТ продукують сурфактии, за-звичай характеризуються антибактерГальною дею. Так, B. subtilis 6051 пригшчував ртст Pseudomonas syringae, а В. amyloliquefaciens KPS46 - Xanthomonas axonopodis pv. glycines (M^na & Kanwar, 2015). У цьому дослтджеинТ широкий спектр антифуигальжд до показали штами Bacillus sp. KMB-3 i Bacillus sp. KMB-6, яю пригшчували ртст уск протестованих культур фгтопатогентв та не проявляли фгтотоксичиостт.
Останнтм часом у рослинницти замТсть препаратТв на основт монокультур дослТдники пропонують використовувати комплекс ртзиих мткрооргашзмтв тз додатковими або синергТчними власти-востями. ПередпосТвна Гнокуляця комплексом, що складався симбютичного азотфТксатора Mesorhizobium ciceri IC53 та ендо-фпного штаму B. subtilis NUU4, ефектившше стимулювала ртст бобовоï рослиии Cicer arietinum L., а також утвореиня бульбочок, формування стручкТв та урожаю порТвняно з Гнокулящею одним азотфТксатором. Позитивиий вплив мткробного комплексу автори поясиюють такими додатковими властивостями B. subtilis NUU4 як здатшсть до утвореиня iндолiлоцтовоï кислоти, солюбЫзаптя фосфаттв i змеишеиня прояву Тнфекцй, спричииеноï фггопатоген-иим грибом Fusarium solani (Egamberdieva et al., 2017). Egamberdi-eva et al. (2016) повТдомили про сииергетичиий вплив комбТнова-ноï Тнокуляцй Mesorhizobium sp. та Pseudomonas extremorientalis TSAU20 на ростовт показиики лiкарськоï бобовоï рослиии Glycyr-rhiza uralensis Fish. за сольового стресу. B Тншому дослТджеинТ сумТсне застосування Pseudomonas fluorescens, Trichoderma harzi-namum i ендомткоризиих грибТв краще зиижувало iнфiкування томапв F. oxysporum f. lycopersici, нтж шокулящя одним тз цих мiкроорганiзмiв. Kомбiнована Тнокулядя зиизила важкТсть захво-рювання на 74% у польових умовах, урожайнТсть культури при цьому пдвищилась на 20% порТвняио з контролем (Srivastava et al., 2010). У нашому дослiдженнi пiдiбранi комплекси мткрооргашзмтв проявили фунгiстатичну та Тнсектицидну дтю та можуть застосову-ватись для захисту рослин вТд грибкових хвороб i комах-шкТдникТв.
Перевiрка антагошстичиих властивостей ентомопатогеиних мiкроорганiзмiв показала вiдсутнiстъ фунгТстатичжд дт1 дослтджу-ваного штаму B. thuringiensis IMB-7186 i, навпаки, суттеве ТнгТбу-вання росту фузарив культурою B. bassiana IMB-F-100043. З да-них ттератури втдомо, що деякт штами B. thuringiensis, крш Тнсек-тициджа д11, характеризуються високою антагонiстичиою активш-стю щодо фгтопатогенних мжромтцетГв родв Venturia, Verticillium тощо. Це зумовлено синтезом протигрибкових речовин (бацилг-бактину, цвггермТцину А), а також мтколпичних хттииаз, що спричиняють лтзис, змтни щтьностт, товщини та напрямку росту мтцелТю (Hollensteiner et al., 2017; Patyka et al., 2017). Bнесений у щльне живильне середовище очищений препарат ендохгтинази B. thuringiensis subsp. tenebrionis DSM-2803 пригшчував радаль-иий ртст Colletotrichum gloeosporioides, збудника антракиозу рослии. Автори спостерТгали пряму кореляцтю мтж коицентрацТею ендохг-тинази та рТвнем ТнгТбування росту фттопатогену (De la Fuente-Salcido et al., 2016). Kрiм хттииази штам B. thuringiensis HD1 утво-рював хiтиизв'язувалъиий бшок, локалгзований в оболонках спор. Цей бшок посилював Тнсектицидну дю кристалгчиого бшка Cry 1Ac та шпбував ртст грибТв Culvularia oryzae, Aspergillus oryzae, Aspergillus parasiticus, Verticillium dahliae. Хпинзв'язувальний бг-лок де як сииерггст хпинази, внаслтдок чого втдбуваеться Тнтен-сившше пригнТчеиня росту грибТв (Arora et al., 2013). Також вТдомо, що B. bassiana, крш активностг проти комах, може виступати ашагошстом вТдносно збудниктв хвороб рослии. MеханТзм антаго-нiстичиоï до цього гриба дослТдники пов'язують зг здатшстю про-дукувати антибютичнТ речовини, а також конкуренцТею за субстрат та Тндукцтею системиоï резистентностт рослин проти збудни-кТв захворювань рослин (Shahid et al., 2012). ОтриманТ нами данТ пТдтверджують здатнтсть штаму B. bassiana IMB-F-100043 пригнТ-чувати ртст фТтопатогеииих грибТв, проте використаний нами штам B. thuringiensis IMB-7186 не пригшчував дослтджуваш гриби роду Fusarium.
Даш наших дослтджень свТдчать про невисоку Тнсектицидну актившсть культуральних рТдин Bacillus sp. KMB-3. 1з лттератур-
иих джерел вТдомо, що деякТ антагонтсти фттопатогеиних грибТв, що продукують хТтииолТтичнт ферменти, характеризуються енто-моцидиою дТею. Rishad et al. (2017) повтдомили про видлеиня та очищення хттинази Тз B. pumilus MCB-7, що проявляла мтколттичну актившсть втдносно Aspergillus flams, A. niger, A. fumigatus, Cerato-rhiza hydrophila та Fusarium oxysporum. Цей фермент показав також ентомоцидну актившсть втдносно личинок Scirpophaga incer-tulas Walker (Lepidoptera: Pyralidae), шктдника рису. Meena & Kanwar (2015) також встановили, що супернатанти культуральних ртдин штамТв B. subtilis, що продукують лтпопептид сурфактии, показали високу смертнтсть личинок i пупарив комарТв видтв Culex quinquefasciatus, Anopheles stephensi, Aedes aegypti.
Висновки
3i зразктв Грунту чорнозему звичайиого видлено 23 воляти бактерш, втднесеиих до роду Bacillus. Найвищу антагонтстичну ак-тивнтсть втдносно фттопатогеиних грибТв Fusarium culmorum, F. moniliforme, F. oxysporum, Cladosporium herbarum, Aspergillus niger, Alternaria alternate показали штами Bacillus sp. KMB-3 та Bacillus sp. KMB-6. Установлено вТдсутшсть антагошзму мТж вт-дТбраними штамами та ентомопатогеиними бактерТями Bacillus thuringiensis IMB-7186 та грибами Beauveria bassiana IMB-F-100043. Обробка насшня ярого ячменю культуральними ртдинами Bacillus sp. KMB-3 та Bacillus sp. KMB-6 негативно не впливала на морфометричнт показиики та суху вагу проросткТв. Птдтбрано мтк-робнт комплекси, до складу яких входять один тз вТдтбраних шта-мтв-антагонТстТв та ентомопатогени B. thuringiensis IMB-7186 i B. bassiana IMB-F-100043, що проявляють фуигТстатичну дтю до фттопатогеиних грибТв роду Fusarium та Тнсектицидну актившсть вТдносно гусениць Archips podana Scop.
References
Alvarez, F., Castro, M., Principe, F., Borioli, G., Fischer, S., Mori, G., & G. Jofre, E. (2012). The plant-associated Bacillus amyloliquefaciens strains MEP2 18 and ARP2 3 capable of producing the cyclic lipopeptides iturin or surfactin and fengycin are effective in biocontrol of sclerotinia stem rot disease. Journal of Applied Microbiology, 112(1), 159-174. Arora, N., Sachdev, B., Gupta, R., Vimala, Y., & Bhatnagar, R. K. (2013). Characterization of a chitin-binding protein from Bacillus thuringiensis HD-1. PLOS ONE, 8(6), e66603. Bodhankar, S., Grover, M., Hemanth, S., Reddy, G., Rasul, S., Yadav, S. K., De-sai, S., Mallappa, M., Mandapaka, M., & Srinivasarao, C. (2017). Maize seed endophytic bacteria: Dominance of antagonistic, lytic enzyme-producing Bacillus spp. 3 Biotech, 7(4), 232. Chen, J. N., Wei, C. W., Liu, H. C., Chen, S. Y., Chen, C., Juang, Y. M., Lai, C. C., & Yiang, G. T. (2016). Extracts containing CLPs of Bacillus amyloliquefaciens JN68 isolated from chicken intestines exert antimicrobial effects, particularly on methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes. Molecular Medicine Reports, 14(6), 5155-5163. De la Fuente-Salcido, N. M., Casados-Vazquez, L. E., Garcia-Perez, A. P., Barbo-za-Perez, U. E., Bideshi, D. K., Salcedo-Hernandez, R., Garcia- Almendarez, B. E., & Barboza-Corona, J. E. (2016). The endochitinase ChiA Btt of Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM- 2803 and its potential use to control the phytopathogen Colletotrichum gloeosporioides. MicrobiologyOpen, 5(5), 819-829.
Dimkic, I., Stankovic, S., Nisavic, M., Petkovic, M., Ristivojevic, P., Fira, D., & Beric, Т. (2017). The profile and antimicrobial activity of Bacillus lipopeptide extracts of five potential biocontrol strains. Frontiers in Microbiology, 8, 925. Drehval, O. A., Vlasenko, O. G., Cherevach, N. V., & Vinnikov, А I (2015). Vplyv mikrobnogo preparatu "Baktofungin-LS" na persykovu popelycju u kontro-l'ovanyh umovah [Influence of microbial preparation "Baktofungin-LS" on peach aphid in controlled conditions]. Agroekologichnyj Zhurnal, 4, 85-89 (in Ukrainian).
Egamberdieva, D., Li, L., Lindström, K., & Räsänen, L. A. (2016). A synergistic interaction between salt-tolerant Pseudomonas and Mesorhizobium strains improves growth and symbiotic performance of liquorice (Glycyrrhiza ura-lensis Fish.) under salt stress. Applied Microbiology and Biotechnology, 100(6), 2829-2841.
Egamberdieva, D., Wirth, S. J., Shurigin, V. V., Hashem, A., & Abd Allah, E. F. (2017). Endophytic bacteria improve plant growth, symbiotic performance of chickpea (Cicer arietinum L.) and induce suppression of root rot caused by Fusarium solani under salt stress. Frontiers in Microbiology, 8, 1887.
Hollensteiner, J., Wemheuer, F., Harting, R., Kolarzyk, A. M., Diaz Valerio, S. M., Poehlein, A., Brzuszkiewicz, E. B., Nesemann, K., Braus-Stromeyer, S. A., Braus, G. H., Daniel, R., & Liesegang, H. (2017). Bacillus thuringiensis and Bacillus weihenstephanensis inhibit the growth of phytopathogenic Verticillium species. Frontiers in Microbiology, 7, 2171.
Iutynska, G. O., & Ponomarenko, S. P. (eds.). (2010). Bioreguljacija mikrobno-rastitel'nyh sistem [Bioregulation of microbial-plant systems]. Nichlava, Kiev (in Russian).
Ji, S. H., Paul, N. C., Deng, J. X., Kim, Y. S., Yun, B. S., & Yu, S. H. (2013). Biocontrol activity of Bacillus amyloliquefaciens CNU114001 against fungal plant diseases. Mycobiology, 41(4), 234-242.
Khong, N. G., Randoux, B., Deravel, J., Tisserant, B., Tayeh, Ch., Coutte, F., Bourdon, N., Jacques, P., & Reignault, P. (2013). Induction of resistance in wheat by bacterial cyclic lipopeptides. Communications in Agricultural and Applied Biological Sciences, 78(3), 479-487.
Meena, K. R., & Kanwar, S. S. (2015). Lipopeptides as the antifungal and antibacterial agents: Applications in food safety and therapeutics. BioMed Research International, 2015, 473050.
Molinatto, G., Franzil, L., Steels, S., Puopolo, G., Pertot, I., & Ongena, M. (2017). Key impact of an uncommon plasmid on Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum S499 developmental traits and lipopeptide production. Frontiers in Microbiology, 8, 17.
Naureen, Z., Rehman, N. U., Hussain, H., Hussain, J., Gilani, S. A., Al Housni, S. K., Mabood, F., Khan, A. L., Farooq, S., Abbas, G., & Harrasi, A. A. (2017).
Exploring the potentials of Lysinibacillus sphaericus ZA9 for plant growth promotion and biocontrol activities against phytopathogenic fungi. Frontiers in Microbiology, 8, 1477.
Patyka, T. I., Bojko, M. V., & Patyka, M. V. (2017). Biotehnologichna polifunk-cional'nist' metabolitnogo sporo-krystalichnogo kompleksu ta osoblyvosti kultyvuvannja Bacillus thuringiensis [Biotechnological polyfunctionality of the metabolic spore-crystalline complex and Bacillus thuringiensis cultivation features]. Mikrobiologichnyj Zhurnal, 79(2), 78-85 (in Ukrainian).
Rishad, K. S., Rebello, S., Shabanamol, P. S., & Jisha, M. S. (2017). Biocontrol potential of halotolerant bacterial chitinase from high yielding novel Bacillus pumilus MCB-7 autochthonous to mangrove ecosystem. Pesticide Biochemistry and Physiology, 137, 36-41.
Shahid, A. A., Rau, A. Q., Bakhsh, A., & Husnain, T. (2012). Entomopathogenic fungi as biological controllers: New insights into their virulence and pathoge-nicity. Archives of Biological Sciences, 64(1), 21-42.
Srivastava, R., Khalid, A., Singh, U. S., & Sharma, A. K. (2010). Evaluation of arbuscular mycorrhizal fungus, fluorescent Pseudomonas and Trichoderma harzianum formulation against Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici for the management oftomato wilt. Biological Control, 53(1), 24-31.
Yamammoto, S., Shiraishi, S., & Suzuki, S. (2015). Are cyclic lipopeptides produced by Bacillus amyloliquefaciens S13-3 responsible for the plant defence response in strawberry against Colletotrichum gloeosporioides? Letters in Applied Microbiology, 60(4), 379-386.
