CC BY
108
УДК 615.371:579.873.21].015.45.036.8
ФАГОЦИТАРНАЯ АКТИВНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ У ДЕТЕЙ В РАЗЛИЧНЫЕ СРОКИ ПОСЛЕ БЦЖ-ВАКЦИНАЦИИ
Л. П. Санакоева, Л. А. Четвертных, Е. И. Самоделкин
Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е. А. Вагнера, г. Пермь
Проведенное исследование по оригинальной методике изменений фагоцитарной активности лейкоцитов крови (ФАЛ), основанное на расчете индексов специфического фагоцитоза (ИСФ) и активности фагоцитов стандартизованного (ИАФст) у БЦЖ-вакцинированных детей, позволило количественно оценить процесс иммунной перестройки, а также уровень естественной противомикробной защиты организма индивидуально у каждого привитого ребенка при одновременном определении у него порога чувствительности к туберкулину. Регистрация и анализ специфических изменений ФАЛ крови имеют явное преимущество в оценке напряженности противотуберкулезного иммунитета перед такими традиционными эквивалентами БЦЖ-вакцинации, как диаметр кожного рубчика и чувствительность к туберкулину по пробе Манту с 2 ТЕ ППД-Л. Это приобретает принципиальное значение при обследовании детей, особенно первых трех лет жизни после БцЖ-вакцинации, когда во многих случаях происходит угасание вакцинальной противотуберкулезной защиты организма ребенка и возникает реальная угроза заболевания туберкулезом.
Ключевые слова: БцЖ-вакцинация, дети, проба Манту, кожный рубчик, напряженность поствакцинального иммунитета, фагоцитарная активность лейкоцитов крови.
Введение
Несмотря на значительные успехи в области создания искусственной антиинфекционной защиты, вопросы иммунной перестройки организма и длительность сохранения специфических адаптивных реакций, наступающих в результате введения БЦЖ, изучены недостаточно. При этом единственными критериями индивидуальной и попу-ляционной эффективности проведенной вакцинации остаются размер кожного знака и туберкулиновые пробы [2, 3]. Однако эти показатели не отражают истинной невосприимчивости к туберкулезной инфекции, особенно в случаях отсутствующего рубчика и отрицательной пробы Манту с 2 ТЕ ППД-Л, а в отдаленные сроки после введения БЦЖ при анализе вакцинального статуса ребенка они вообще утрачивают свое значение [1, 8].
Вместе с тем известно, что фагоциты крови являются ключевым звеном в сложных межклеточных взаимодействиях, а фагоцитарную их активность рассматривают в качестве системного показателя врожденной противомикробной резистентности и одного из основных механизмов развития иммунитета [1, 7]. Учитывая это, нами исследована фагоцитарная активность лейкоцитов крови у детей в различные сроки после БЦЖ-вакци-нации.
Материалы и методы исследования
В обследование было включено 70 относительно здоровых детей (38 девочек и 32 мальчика 1—11 группы здоровья), иммунизированных при рождении вакциной БЦЖ. Критериями отбора детей для оценки их
поствакцинального статуса были отсутствие инфицирования микобактериями туберкулеза (МБТ), контакта с больными туберкулезом и заболевания дизентерией Зонне в анамнезе, а также отсутствие в момент забора крови любой острой патологии, включая респираторные заболевания в последние 2 месяца. Особое внимание было уделено оценке величины поствакцинального рубчика и чувствительности к туберкулину по пробе Манту (ПМ) с 2 ТЕ ППД-Л за все годы, предшествующие обследованию.
С учетом срока, прошедшего с момента введения вакцины БЦЖ, выделено три группы детей. В первую включены дети от 1 года до 2 лет (16 чел.); во вторую — от 2 до 3 лет (15 чел.); в третью — дети 3—4 лет (29 чел.). Десять здоровых детей 6,5—7-летнего возраста с туберкулинонегативной реакцией, которые в соответствии с приложением № 1 к Приказу МЗ РФ № 673 от 30.10.2007 г. должны подвергаться календарной ревакцинации, составили четвертую группу (контрольная, или группа сравнения).
Материалом для исследования служила капиллярная кровь. Состояние естественной противомикробной защиты организма изучали модифицированным способом оценки фагоцитарной активности лейкоцитов крови (ФАЛ) с введением индекса активности фагоцитов, рассчитанного по стандартам (ИАФст). Это позволило исключить зависимость абсолютных показателей ФАл от генетически детерминированной поглотительной способности фагоцитирующих клеток [5].
В качестве объектов фагоцитоза (ОФ) использовали формалинизированные эритроциты барана (ФЭБ) в концентрации 50—60 млн/мл (НПО «Биомед», г. Пермь). данный вид фагоцитоза с целью отличия его от фагоцитоза ФЭБ, сенсибилизированных различными антигенами, условно был назван «неспецифическим». Контрольная величина индекса, рассчитанная по стандартам,
унифицирована и составляет 0,70—1,40. При значениях ниже 0,70 констатируют недостаточность фагоцитарной защиты организма, а выше 1,40 — стимуляцию фагоцитоза [5].
По мнению большинства исследователей, главным критерием в оценке эффективности БЦЖ-вакцинации является уровень формирования в организме клеточно-опосредованного иммунитета, сопровождающегося повышением ферментативной и общей бактерицидной активности фагоцитов, опосредуемых в свою очередь цитокина-ми, выделяемыми дифференцированными Т-лимфоцитами [1, 2, 3, 6, 9].
для выявления специфических изменений функциональной активности фагоцитирующих клеток, индуцированных введением БцЖ, использовали оригинальную методику оценки ФАл с применением ФЭБ, сенсибилизированных фосфатидным антигеном мико-бактерий туберкулеза (ФЭБтуб. — специфический ОФ) производства РАО «Биопрепарат» (С.-Петербург) [4]. В качестве контрольных («неспецифических») ОФ были взяты эритроциты, нагруженные липополисахаридным (ЛПС) антигеном из шигелл Зонне (ФЭБ Зон-не) того же предприятия.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При анализе результатов учитывали фагоцитарную способность нейтрофилов и моноцитов крови по отношению к обоим типам ФЭБ и определяли фагоцитарное число (ФЧ). Однако количественную оценку ФАЛ у обследуемых вакцинированных детей осуществляли не по абсолютным значениям Фч, а по соотношению уровней фагоцитоза ФЭБтуб. (Фчтуб.) и ФЭБ Зонне (Фч Зонне). Затем полученные результаты выражали в процентах к соответствующему отношению средних величин ФЧ детей контрольной группы. Такой подход к оценке ФАЛ позволил ввести
унифицированный относительный показатель — индекс специфического фагоцитоза (ИСФ). ИСФ отражал изменение соотношения специфического и «неспецифического» объектов фагоцитоза у иммунных обследуемых по сравнению с таковыми соотношениями в группе сравнения и показывал, во сколько раз величина фагоцитоза ФЭБтуб. больше или меньше соответствующей величины ФЭБ Зонне (Санакоева, Каплин, 1988; 1989). Формула расчета ИСФ:
,
Ср. ФЧСП (ту6 ) Ср. ФЧ|1есп(3онне)
где в числителе представлены фагоцитарные числа поглощенных специфических (ФЭБтуб.) и «неспецифических» (ФЭБ Зонне) объектов фагоцитоза у иммунокомпетент-ных детей; в знаменателе отражены средние значения ФЧ тех же объектов фагоцитоза у детей группы сравнения.
Оценка ФАЛ с использованием гетерогенных ФЭБ позволила в абсолютно идентичных условиях оценить реакцию фагоцитов крови в отношении специфического ОФ и дать представление об индивидуальном уровне естественной активности лейкоцитов крови. Все это не только повысило чувствительность метода, но и позволило унифицировать оценку получаемых индивидуальных результатов. При этом значение диагностического показателя ИСФ, как было установлено, имеет альтернативный характер [4]. Наличие же стимулирующего эффекта фагоцитоза ФЭБтуб. с повышением величины ИСФ относительно установленной верхней контрольной границы: 1,50 — свидетельствует об усилении развития специфических адаптивных фагоцитарных реакций; снижение менее чем 0,60 — об их угнетении.
Результаты клинических наблюдений показали, что через 1—2 года (1-я группа) после БЦЖ-вакцинации между величиной кожно-
го рубчика и выраженностью чувствительности к туберкулину еще имеется положительная корреляционная зависимость (г=0,46; р<0,05). Однако впоследствии эта закономерность нарушается. Так, у детей 2-й группы (2—3 года) реакция на туберкулин в 26,6% случаев являлась либо уже отрицательной, либо сомнительной (наличие инфильтрата 2—4 мм или только гиперемии любого размера), а величина рубчика у каждого пятого ребенка (20%) не превышала 2—3 мм, то есть не достигала оптимальных размеров (не менее 4 мм). В 3—4 года (3-я группа) эти показатели достигали еще больших значений — 51,9% и 24% соответственно, а у 13,8% детей прививочный рубчик отсутствовал вообще. Указанный возраст, как показали наши исследования, стал первым критическим периодом, когда нарастало полярное изменение порога индивидуальной чувствительности к туберкулину. При этом была установлена высокая прямая корреляционная зависимость между долей детей, отрицательно реагирующих на туберкулин, и увеличением времени с момента введения БЦЖ (с 1 года до 6,5— 7 лет; г = 0,82, р<0,005).
Кроме того, «конверсия кожных реакций» на туберкулин и непостоянство проявления кожного знака вызывали неизбежные затруднения в оценке состояния поствакцинального противотуберкулезного иммунитета у детей. Связано это с невозможностью оценить кинетику клеточно-опосредованного специфического ответа на вакцинацию.
При оценке ФАЛ, как и следовало ожидать, у детей через 1—2 года после введения БЦЖ были установлены большие пределы колебаний абсолютных показателей фагоцитоза (ФЧ): максимальное значение ФЧ превышало минимальное в 11 раз (0,18—1,99). В то же время диапазон колебаний ИАФст имел меньшую вариабельность, а кратность соответствующих значений индекса была равна 4 (табл. 1).
Таблица 1
Показатели фагоцитарной активности лейкоцитов у БЦЖ-вакцинированных детей различного возраста (М±т)
№ группы Возраст Показатели ФАЛ, пределы колебаний
ФЧ ИАФст
1 1-2 года 1,05±0,14 (0,18-1,99) 1,17±0,13 (0,51-2,00)
2 2-3 года 1,10±0,16 (0,50-2,97) 1,19±0,10 (0,75-2,00)
3 3-4 года 1,27±0,12 (0,63-1,74) 1,17±0,14 (0,40-2,10)
4 6,5-7 лет 1,26±0,12 (0,85-1,79) 1,16±0,07 (0,90-1,40)
Однако анализ ФАЛ по ИАФст выявил некоторые особенности функциональной активности клеток крови. Так, показатели индекса у большинства детей 1-й группы (66,7% случаев) соответствовали контрольным (физиологическим) величинам ИАФст. В то же время 5 детей имели изменения ФАЛ. В частности, у двух малышей по результатам ИАФст определяли недостаточность фагоцитарной активности лейкоцитов крови, у других — активацию этой защитной реакции клеток. Очевидно, временно существующая недостаточность или стимуляция фагоцитарной активности лейкоцитов, выявленная у пяти детей 1-й группы, объясняется тем, что состояние общей реактивности ребенка первых двух лет жизни зависит от многих факторов, включая вполне вероятное влияние на его организм других многочисленных календарных прививок, которые получают дети в возрасте от 12 до 20 мес.
При анализе показателей фагоцитоза у 15 детей 2-й группы (2—3 года) было установлено, что средние значения ИАФст (1,19±0,10) достоверно не отличались от таковых у детей 1, 3 и 4-й групп (табл. 1). Более
того, 12 (80%) малышей, несмотря на все те же весьма значительные пределы колебаний ФЧ (0,50—2,97), имели результаты индексов, равных 0,80—1,35, не превышающих установленные границы контрольных их значений. Однако из общего числа детей трое имели диагностически значимые величины ИАФст. Показатели их индексов свидетельствовали о стимуляции ФАЛ.
В 3-й возрастной группе подавляющее большинство детей (82,7%) также имели нормальные показатели ФАЛ, оцениваемые по ИАФст, — 1,17±0,14 (табл. 1). Анализ индивидуальной поглотительной способности фагоцитирующих клеток выявил в трех случаях ее недостаточность, а в двух — активацию.
Корреляционный анализ, проведенный между показателями фагоцитарной активности лейкоцитов крови вакцинированных детей и результатами у них чувствительности к туберкулину, не выявил какой-либо закономерности (г = -0,23, р=0,5б), что доказывает независимость формирования неспецифической ФАЛ от механизмов развития ПВА.
Следовательно, среди БЦЖ-вакциниро-ванных детей трех возрастных групп подавляющее большинство (78%) имели нормальные показатели ФАЛ на момент проводимого нами исследования. При этом активный период развития адаптивного противотуберкулезного иммунитета не оказывал негативного влияния на состояние их врожденной резистентности. Несомненно, что «состоятельность» неспецифической реактивности организма ребенка может являться залогом развития адекватного иммунного ответа на вакцинацию БцЖ, а, следовательно, и основой для формирования протективных механизмов. При этом фагоциты крови не только определяют неспецифическую резистентность к инфекционным заболеваниям, но и сами участвуют в первичных эффектор-ных реакциях адаптивного иммунного ответа [1, 6]. Вместе с тем, выявленные изменения
ФАЛ у части обследованных детей (22%), особенно с угнетением функциональной активности фагоцитирующих клеток, на наш взгляд, требуют особого внимания и контроля состояния их противотуберкулезной защиты.
Оценка специфических изменений ФАЛ у вакцинированных детей проводилась путем расчета унифицированного показателя — ИСФ, характеризующегося большей информативностью. Как показали исследования, у малышей 1-й группы в 93,7% случаев был выявлен эффект специфической стимуляции фагоцитарных реакций. ИСФ у них достигал 7,13±1,51 (табл. 2), что в 4,7 раза оказалось выше, чем контрольное значение индекса (1,50).
Во 2-й группе показатель индекса (3,61±0,77) в 3,4 раза превосходил аналогичное значение детей группы сравнения и в 2,4 раза был больше контрольного значения индекса. Однако у 20% детей специфические изменения ФАЛ отсутствовали. Через 3—4 года после вакцинации у основной
массы детей (62%) значения интегрального показателя ИСФ уже не выходили за пределы установленной нормативной границы (0,60— 1,50). Поскольку единственной формой реакции фагоцитирующих клеток была стимуляция поглощения ФЭБтуб. при одновременном снижении интернализации ФЭБ Зонне, то, следовательно, ИСФ не только отражал процесс специфической активации фагоцитоза, но и косвенно свидетельствовал о том, что напряженный поствакцинальный иммунитет после введения БЦЖ-вакцины сохранялся у большинства детей только до 3 лет.
Таким образом, исследование ФАЛ по оригинальной методике позволило у привитых детей количественно и индивидуально оценить процесс иммунной перестройки организма вне зависимости от уровня поглотительной способности клеток. В то же время было установлено, что специфические изменения фагоцитарной активности лейкоцитов крови у детей характерны лишь для первых трех лет с момента иммунизации. К четвертому году процент вакцинированных детей
Таблица 2
Показатели специфических изменений фагоцитарной активности лейкоцитов у БЦЖ-вакцинированных детей различного возраста (М±т)
№ группы Специфическая ФАЛ, пределы колебаний
Возраст ФЧ ФЭБтуб. ФЧ ФЭБ Зонне ИСФ
1 1—2 года 0,65±0,08 (0,19—1,32) 0,16±0,04 (0,02—0,51) 7,13±1,51 (1,31—20,60)
2 2—3 года 0,67±0,09 (0,17—1,57) 0,32±0,06 (0,02—0,76) Р(2—1)<0,05 3,61±0,77 (1,00—11,50) Р(2—1)<0,05
3 3—4 года 0,68±0,10 (0,06—1,55) 0,40±0,11 (0,08—1,30) Р(з—1)<0,05 3,50±0,77 (0,66—16,00) Р(3—1)<0,05
4 (группа сравнения) 6,5—7 лет 0,62±0,09 (0,24—1,29) 0,66±0,09 (0,22—1,40) Р(4—1)<0,001 Р(4—2)<0,05 Р(4—3)>0,05 1,05±0,05 (0,83—1,33) Р(4—1)<0,005 Р(4—2)<0,05 Р(4—3)<0,05
со специфическими изменениями ФАЛ снижается до 40%. Единственной формой реакции этих эффекторных клеток была стимуляция поглощения ФЭБтуб. Несомненно, это является отражением повышенной экспрессии рецепторов, гомологичных данному паттерну. При этом повышение ФАЛ в отношении ФЭБтуб. (по ИСФ) выявляли у детей даже в случае туберкулинонегативного результата ПМ у них и при отсутствии прививочного рубчика. Независимость формирования указанных адаптивных реакций, индуцированных введением БцЖ, подтверждается отсутствием корреляционной зависимости между выраженностью специфических изменений ФАЛ, ПВА и кожным знаком. На наш взгляд, обнаруженный по ИСФ эффект стимуляции ФАЛ у вакцинированных детей в отношении ФЭБтуб. является интегральным показателем той части иммунных сдвигов и протективных механизмов, эффекторным звеном которых служит система фагоцитирующих клеток. Кроме того, ИСФ свидетельствует не только о сохраняющемся процессе специфической активации фагоцитов, опосредуемой цитокинами и опсонинами крови, но и косвенно отражает напряженность развивающегося поствакцинального иммунитета у детей, особенно в первые 3 года после введения БцЖ. При этом, в случае развития адекватного ответа организма на прививку, каждое последующее поколение фагоцитов, вступающее во взаимодействие с вакцинными штаммами микобактерий, становится все более «иммунокомпетентным», обеспечивая в дальнейшем необходимую защиту человека от заболевания туберкулезом [1, 6].
Вывод
Важно отметить, что регистрация и анализ специфических изменений ФАЛ крови имеют явное преимущество в оценке напряженности противотуберкулезного иммунитета перед такими традиционными эквива-
лентами прививки, как величина кожного рубчика и выраженность ПВА. Это приобретает принципиальное значение при обследовании детей, особенно первых трех лет жизни после БЦЖ-вакцинации, когда во многих случаях, начиная с 3—4 лет, происходит угасание поствакцинальной защиты организма ребенка и возникает угроза заболевания его туберкулезом.
Библиографический список
1. Блум Б. Р. Туберкулез. Патогенез, защита, контроль: Пер. с англ./Б. Р. Блум— М.: Медицина, 2002.— 696 с.
2. Король О. И. Туберкулез у детей и подростков: руководство/Под ред. О. И. Король и М. Э. Лозовской.— СПб.: Питер, 2005.— 432 с.
3. Митинская Л. А. Иммунопатогенетиче-ские механизмы действия вакцин БцЖ и БцЖ-М/Л. А. Митинская//Пробл. туб.— 2003.— № 3.— С. 22—23.
4. Применение метода диагностического определения специфической фагоцитарной реакции у детей при вакцинации БЦЖ и туберкулезной инфекции: метод. рекомендуя. П. Санакоева, И. П. Корюкина,
B. А Черешнев, Л. А. Фокина.— Пермь,
2006.— 28 с.
5. Способ диагностики состояния фагоцитарной защиты: авт. св-во № 2131609 Российской Федерации/В. Н. Каплин, А. П. Шаврин, А. В. Старкова и др.//Изобре-тения. Полезные модели: бюл. ВАКа.— 1999.— № 16.
6. Anuradha B. Age-related waning of in vitro interferon-y levels against r32 kDa BCG in BCG vaccinated children/В. Anuradha,
C. M. Santosh, V. Hari Sai Priya et al.//J. Immune Based Therapies and Vaccines.—
2007.— Vol. 5.— P. 8—15.
7. Medzhitov R. Innate immunity/R. Medzhitov, C. Janeway//The New England Journal
of Medicine.- 2000.- Vol. 343.- № 5.-P. 338-344.
8. Neurenberger E. Latent tuberculosis infection/E. Neurenberger, W. R. Bishai, J. H. Grosse//Seminars in Resp. and Critic.-Care Med.- 2004.- Vol. 25.- № 3.- P. 317— 336.
9. Pulickal A S. Comparison of the prevalence of tuberculosis infection in BCG vaccinated versus nonvaccinated school age children/ A S. Pulickal, G. V. Fernandez//Indian Pedi-atr.- 2007.- Vol. 44.- № 5.- P. 344-347.
L. P. Sanakoeva, L. A. Chetvertnykh, E. I. Samodelkin
BLOOD LEUKOCYTE PHAGOCYTIC ACTIVITY IN CHILDREN AT DIFFERENT
TERMS AFTER BCG-VACCINATION
The investigation performed by original technique consisting in alteration of blood leukocyte phagocytic activity based on calculation of specific phagocytosis indices (SPI) and activity of phagocytes in BCG vaccinated children permitted to assess quantitatively the process of immune reconstruction as well as the level of natural antimicrobial defense of
organism individually in each vaccinated child with simultaneous determination of tuberculosis susceptibility threshold. Registration and analysis of specific alterations of blood leukocyte phagocytic activity has preference in estimation of antituberculous immunity tension over such traditional BCG vaccination equivalents as diameter of skin scar and tuberculin susceptibility by Mantoux test. It takes special significance in examination of children, especially of the first three years of life after BCG vaccination, when in many cases there occurs dying of vaccinal antituberculous defense of child's organism and arises real threat of being taken ill with tuberculosis.
Keywords: BCG vaccination, children Mantous test, skin scar, postvaccinal immunity tension, blood leukocyte phagocytic activity.
Контактная информация: Санакоева Людмила Павловна, доктор мед. наук, доцент кафедры педиатрии ФПК и ППС Пермской государственной медицинской академии им. ак. Е. А. Вагнера, 614000, г. Пермь, ул. Петропавловская, 26, тел. 8 (342) 212-79-16
Материал поступил в редакцию 20.12.2009
