CC BY
112
УДК 615.371:579.873.21].015.44.076. 9
ДИНАМИКА ИММУНОКЛЕТОЧНЫХ РЕАКЦИЙ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ БЦЖ-ВАКЦИНАЛЬНОГО ПРОЦЕССА У КРОЛИКОВ
В. А. Четвертных, И. В. Фельдблюм, Л. П. Санакоева, Э. С. Горовиц,
Л. А. Фокина
На протяжении 87 лет одним из приоритетных методов борьбы с туберкулезом является БЦЖ-вакцинация. Между тем, несмотря на значительные успехи в области создания искусственной антиинфекционной защиты, вопросы иммунологической перестройки организма, наступающей в результате введения БЦЖ, изучены недостаточно. Сложной задачей остается оценка длительности сохранения иммунных реакций, лежащих в основе формирования протективных механизмов против вирулентных штаммов микобактерий [1, 4]. Кроме того, в системе эпидемиологического надзора и контроля за туберкулезной инфекцией отсутствуют объективные унифицированные критерии анализа состояния прививочного иммунитета. Недостаточно также изучена и динамика развития защитных реакций с позиций формирования специфического ответа. В свете вышеизложенного актуальным остается поиск и апробация новых, информативных, доступных для широкого практического применения методов контроля развития и напряженности поствакцинального противотуберкулезного иммунитета.
Материалы и методы
Для изучения кинетики иммунного ответа, индуцированного введением БЦЖ, были проведены исследования на 10 неполовозрелых кроликах породы шиншилла возрастом
до 6 мес. После определения показателей в исходном фоне шесть животных были иммунизированы внутрикожно вакциной БЦЖ в дозе 0,05 мг. Четырем кроликам (контрольная группа, или группа сравнения) вводили физиологический раствор натрия хлорида в той же дозе. В динамике развития адаптивных реакций у животных одновременно анализировали местную реакцию кожи, а также забирали кровь из краевой вены уха для исследования различных клеточных показателей специфической и неспецифической реактивности организма на 1, 3, 5, 7, 10, 14, 17, 21, 28, 39, 53, 70-е и 85-е сутки после инъекции растворов. При этом характер течения вакцинального процесса у животных контролировали визуально по эволюции развития прививочного аффекта в зоне введения БЦЖ. Лейкоцитарную формулу крови оценивали стандартной методикой.
Для изучения состояния естественной противомикробной защиты организма в эксперименте определяли фагоцитарную активность лейкоцитов (ФАЛ) модифицированным методом [6], используя в качестве объектов фагоцитоза формалинизированные эритроциты барана (ФЭБ) в концентрации 50— 60 млн/мл. Данный вид фагоцитоза условно был назван неспецифическим. Суммарный фагоцитоз выражали в виде процента фагоцитоза (ПФ), фагоцитарного числа (ФЧ) и индекса активности фагоцитов (ИАФ). Наряду с этим использовали оригинальный ме-
тод выявления специфических изменений ФАЛ (ФАЛсп) крови [5] с применением специфического и гетерогенного (контрольного — неспецифического) объектов фагоцитоза (ОФ). В качестве первого служили ФЭБ, сенсибилизированные фосфатидным антигеном микобактерий туберкулеза (ФЭБ туб.), в качестве другого — эритроциты, нагруженные липополисахаридным (ЛПС) антигеном из шигелл Зонне (ФЭБ Зонне). Контрольные ОФ предварительно окрашивали черным анилиновым красителем с целью дифференциальной их диагностики в мазках крови, обработанных по Романовскому — Гимзе. Учитывали поглотительную способность лейкоцитов по отношению к обоим типам ФЭБ и определяли ФЧ. Количественную оценку ФАЛсп у примированных кроликов осуществляли по изменению соотношения уровней фагоцитоза ФЭБ туб. и ФЭБ Зонне относительно соответствующих средних величин ФЧ животных группы сравнения. Такой подход к оценке ФАЛсп позволил использовать интегральный относительный критерий — индекс специфического фагоцитоза (ИСФ). Были установлены его контрольные границы, составившие 0,20—2,00. Выход за указанные пределы свидетельствовал о наличии специфических изменений (угнетении или стимуляции) ФАЛ крови.
Изучали также функциональную активность лимфоцитов крови по методу В. Н. Кап-лина [3]. Использовали те же эритродиаг-ностикумы, что и при исследовании специфического фагоцитоза. Принцип метода заключался в определении способности высокоактивных лимфоцитов (ВАЛ) к одновременной адгезии 3 и более специфических (ФЭБ туб.) или контрольных объектов (ФЭБ Зонне). При этом проводили вычисление унифицированного количественного показателя — индекса специфической лим-фоцитарной адгезии (ИСЛА). Пределы его колебаний в исходном фоне и у кроликов
группы сравнения в динамике исследования составляли 0,50—1,50. В случае выявления диагностического значения ИСЛА носил альтернативный характер. Модифицированная оценка адгезивной способности лимфоцитов позволила повысить достоверность результатов и выявить характер индивидуальных клеточных реакций у животных в динамике наблюдений, независимо от особенностей возрастной реактивности. В дальнейшем нами было выделено два класса ВАЛ: высокоактивные лимфоциты I класса — с плотным прилежанием 3 и более специфических или контрольных объектов адгезии, условно названные истинными, или иммунными. Их наличие косвенно свидетельствовало о высокой плотности специфичных для лигандов паттерн-распознающих рецепторов; и высокоактивные лимфоциты II класса — с преимущественно разрозненным расположением 3 и более объектов адгезии, условно названные диффузными. Появление их косвенно отражало низкую плотность распределения паттерн-распознающих рецепторов на наружной мембране лимфоцитов. Подобное разделение ВАЛ предложено нами в связи с тем, что характер расположения адгезированных эритроцитарных диаг-ностикумов различной специфичности на поверхности высокоактивных лимфоцитов у вакцинированных кроликов оказался различным (достоверно) в сравнении с животными группы сравнения. Это позволило ввести другой показатель — индекс специфического расположения объектов (ИСРО) [7]. Формула расчета:
ИСРО =
_ Е А ВАЛсп (туб.) I кл./ЕА ВАЛсп (туб.) II кл. ЕА ВАЛнесп (Зонне) I кл./ЕА ВАЛнесп (Зонне) II кл.
где: в числителе — отношение сумм адге-зированных специфических объектов (ФЭБ туб.) на поверхности высокоактивных лимфоцитов I и II классов с высокой и низкой
плотностью паттерн-распознающих рецепторов; в знаменателе — то же, но относящееся к процессу адгезии неспецифических объектов (ФЭБ Зонне).
Были рассчитаны контрольные значения ИСРО у интактных кроликов, равные 0,08— 0,60. Это позволило выявить стимулирующий эффект адгезии специфических объектов и особенности их распределения на поверхности ВАЛ.
Полученные данные обрабатывали общепринятыми методами вариационной статистики.
Результаты исследования
и их обсуждение
Установлено, что через 24 часа в зоне введения вакцины у всех кроликов появилось покраснение кожи, а к 3-м суткам произошло расширение зоны гиперемии. Это свидетельствовало о начале развития инфильтративно-экссудативной фазы воспаления (1-я фаза). С 5-го по 10-й день формировалась папула с нарастающей отечностью, уплотнением тканей и элементами характерного шелушения. К 17-му дню у всех животных отмечался инфильтрат с отшелушиванием верхних слоев эпидермиса и образованием корочки. На 21-е сутки размер инфильтрата достигал максимальных значений (10,00±0,80). К концу месяца стадия инфильтративно-экссудативных изменений в коже завершалась.
На втором месяце (39—53-е сутки) происходила резорбция местных воспалительных изменений с рассасыванием инфильтрата и локальным уплотнением тканей. Отмечались уменьшение размеров прививочного знака и формирование узелка. Это соответствовало развитию 2-й (продуктивной) фазы воспаления. В 3-й фазе — фиброза (70—85-е сутки),— образовавшийся узелок трансформировался в рубчик, диаметр которого ко-
лебался от 2 до 6 мм. У животных контрольной группы подобных изменений кожи не наблюдали.
В целом цикл развития специфических изменений кожной поствакцинальной реакции (с момента появления инфильтрата до образования рубчика) составил 10 недель.
При анализе лейкоцитарной формулы выявлено, что на этапе формирования поствакцинальной гиперемии и папулы (вплоть до 10-х суток) развивался относительный и абсолютный нейтрофильный лейкоцитоз с одновременной лимфомоноцитопенией. К 10-м суткам и началу 2-й фазы воспаления происходило однонаправленное увеличение числа нейтрофилов и лимфоцитов (4,68±1,16* 109/л нейтрофилов; 11,75±0,72* 109/л лимфоцитов — на 39-е сутки против 2,23±0,21* 109/л и 8,97±0,82х 109/л — в исходном фоне соответственно; р<0,05), сменяющееся в фазе фиброза лимфоцитозом (13,15±1,36* 109/л — на 85-е сутки). Оба этих показателя — последовательная воспалительная реакция тканей кожи и изменение клеточного состава клеток крови — свидетельствовали о состоявшемся прививочном эффекте.
При оценке неспецифических фагоцитарных реакций крови выявлено увеличение ПФ и ФЧ уже на 1-е сутки. С 5-го и по 53-й день исследований (первые две фазы воспаления) доминировали, главным образом, высокоактивные формы фагоцитов. Это нашло отражение в достоверно высоких показателях ИАФ относительно данных исходного фона и контрольной группы животных. При этом величина индекса коррелировала с активностью 1-й фазы воспалительного процесса в коже (г=0,93, р<0,001). По мере стихания воспаления в зоне введения БЦЖ фагоцитарная активность лейкоцитов прогрессивно снижалась. Это, с одной стороны, указывает на тесную взаимосвязь оцениваемых сопряженных процессов, с другой — позволяет
использовать ИАФ в качестве интегрального показателя состояния естественной противо-микробной резистентности организма при БЦЖ-вакцинации [6].
Характерными являлись также специфические изменения фагоцитарной активности лейкоцитов (ФАЛсп), оцениваемые по унифицированному показателю — ИСФ. Первое достоверное повышение значения индекса наблюдали на 7-й день, а прогрессивное его нарастание происходило с 10-х по 21-е сутки (табл. 1), увеличиваясь в 6—9 раз по отношению к таковому у невакцинированных кроликов. Затем, хотя и имелось неуклонное снижение величины ИСФ, тем не менее даже на 85-е сутки она еще в 3,6 раза достоверно была выше, чем у животных контрольной группы (3,94±0,65 и 1,10+0,29 соответственно). Сравнивая оба вида фагоцитарных реакций (неспецифических и специфических), следует заметить, что в первом случае ФАЛ хотя и возрастала в начальные сроки, но оставалась на более низком уровне — вплоть до 28-х суток, уступая в 5—6 раз активности специфически активированного фагоцитоза, и заканчивалась в начале фазы фиброза. Более выраженная специфически активированная ФАЛ, очевидно, связана с тем, что, несмотря на завершение воспалительных реакций в коже, в органах, богатых лимфоидной тканью, продолжался гранулематозный процесс, являющийся источником появления в кровотоке антигенов [1]. С этой позиции можно понять длительно сохраняющиеся процессы специфической активации фагоцитов. Полученные результаты согласуются с данными литературы, указывающими на более раннюю реакцию неспецифического фагоцитоза, наблюдающегося в период логарифмического размножения вакцинных штаммов МБТ [1, 8]. Затем акцент смещается в сторону специфически активированной ФАЛ при непосредственном воздействии на фагоциты крови иммунных опсонинов и антигенспеци-
фичных факторов эффекторных лимфоцитов. В итоге начинается быстрая инактивация ми-кобактериальных антигенов, а сенсибилизированные в гранулематозных очагах лимфоциты рециркулируют через кровь и лимфу, обеспечивая тем самым развитие адаптивного поствакцинального противотуберкулезного иммунитета [8].
Существует научно обоснованное мнение, что использование профилактических прививок позволяет смещать фетальный ТЪ2-поляризованный иммунный ответ на различные антигены у детей раннего возраста в направлении взрослого Th1 -ответа с выработкой интерферона-у и интер-лейкина-2, являющихся активаторами эффек-торных лимфоцитов и макрофагов, обеспечивающих устойчивость организма к возбудителю туберкулеза [11]. Также известно, что эффекты Th1-поляризованного иммунного ответа выражаются в образовании и накоплении клонов лимфоцитов, специфически взаимодействующих с антигеном при помощи рецепторов, комплементарных к данному антигену. В активированных лимфоцитах de novo происходит синтез клональных мембранных рецепторов и увеличение экспрессии молекул межклеточной адгезии, обеспечивающих эффективное взаимодействие иммунокомпетентных клеток с гомологичными структурами [1, 8, 9, 10].
До вакцинации способность ВАЛ фиксировать на своей поверхности ФЭБ Зонне в 6,7 раза превышала таковую с ФЭБ туб., хотя разброс индивидуальных показателей в обоих случаях был незначительным (64—83 и 8—14 соответственно). Однако ИСЛА у ин-тактных животных оказался более стабильным показателем, а полученный максимальный результат индекса (1,27) лишь в 1,7 раза превышал минимальное его значение (0,73).
После вакцинации первое диагностически значимое увеличение ИСЛА отмечали с 3-х суток (табл. 1). На протяжении 1-й и
Таблица 1
Показатели специфической реактивности кроликов в различные сроки после БЦЖ-вакцинации (М±т)
Показатели специфической реактивности Срок после вакцинации
Исх. фон 1 сут. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут. 14 сут. 21 сут. 28 сут. 39 сут. 53 сут. 70 сут. 85 сут.
ИСФ (0,20-2,00) 1,10+ 0,09 1,10+ 0,09 0,72± 0,15 1,09+ 0,18 2,23± 0,36* 5,80± 1 40 */** 3,40± 1,30* 10,70+ 5,60 */** 2,26± 1,30 ** 7,65± 3,90 */** 8,34± 3,37* 4,70± 1,10* 3,94± 0,65*
X адгезия ФЭБ туб. (абс. кол-во) 11,20+ 0,56 13,83+ 1,57 20,00± 1,61*/** 45,83± 6,22 */** 59,50± 6,82* 63,50± 5,56* 71,50+ 3,06* 69,17+ 4,55* 71,83+ 1,74* 64,60± 6,62* 49,80± 6,17*/** 40,05± 5,51*/** 30,20± 4,85*/**
X адгезия ФЭБ Зонне (абс. кол-во) 74,90± 1,78 72,83± 1,77 83,50± 2,35** 59,67± 5,13*/** 51,33+ 4,34* 48,50± 2,76* 39,00± 3,48 */** 41,83+ 3,30* 31,33+ 1,93* 49,20± 3,31* 70,40± 4,24 ** 77,68± 4,56 ** 85,00± 4,86*
ИСЛА (0,50-1,50) 0,99+ 0,05 1,10+ 0,15 1,51 + 0,15*/** 5,94± ^ ^ */** 8,09+ 2,08* 9,17+ 1,82* 11,40+ 1,44* 11,35+ 1,68* 12,59+ 0,87* 9,13+ 1,50* 4,60± 0,84 */** 3,51 + 0,69*/** 2,40± 0,55 **
% ВАЛ туб. I кл. — — 0,6+ 0,6 7,8+ 2 4 */** 16,1 + 2 о */** 19,1 + 1,5* 18,8+ 1,9* 30,1 + 3,7* 22,8+ 1,6* 21,7+ 3,8* 8,5+ ^ 2 */** 2,5+ 0,6*/** 1,2+ 0,7*
X адгезия ФЭБ туб. на ВАЛ I кл. — — 0,50± 0,50 9,67± 2,98 */** 18,67+ 2,50 */** 23,17+ 1,94* 22,33± 2,42* 30,00± 4,86* 26,67± 1,28* 26,00± 5,52* 9,60± 1,54 */** 2,60± 0,68*/** 1,40+ 0,87
ИСРО (0,08 0,60) 0,35± 0,03 0,32± 0,05 0,21 + 0,08 1,10+ 0,32*/** 2,15+ 0,43* 2,40± 0,54* 5,19+ 1,70* 5,61 + 1,51* 6,70± 2,96* 7,13+ 2,57* 0,49+ 0,09 */** 0,63± 0,13* 0,64± 0,21
Примечание. В скобках указаны диапазоны колебаний контрольных значений индексов. При оценке ранговой последовательности абсолютных разностей пар значений использовали непараметрический критерий Уилкоксона; * — достоверные различия с исходным фоном, /КО,05; ** — достоверные различия с предыдущим сроком, /><0,05.
2-й фаз воспаления процесс специфической адгезии ФЭБ туб. нарастал и достигал максимума на 28-й день (71,83±1,74 против 11,20±0,5б в исходном фоне), что нашло свое отражение в увеличении значений ИСЛА. В этот период, начиная с 5-х суток, в крови доминировали ВАЛсп (туб.) I класса, что сопровождалось высокими показателями ИСРО (на 39-й день в 20 раз больше исходной величины). Динамика же суммарной адгезии ФЭБ Зонне постоянно снижалась (31,33±1,93 на 28-е сутки против 74,90±1,78 в исходном фоне и 82,75±1,09 у кроликов группы сравнения). Подобную тенденцию в реакциях отмечали вплоть до 53-го дня. Однако даже и на стадии рубцевания (70-е сутки) показатели ИСЛА и ИСРО еще были выше установленных нормативных значений (табл. 1). Следовательно, адгезивная способность лимфоцитов в отношении ФЭБ туб. в наибольшей степени проявлялась на стадии развития инфильтрата — периода формирования иммунной гранулемы. В это же время макрофаги также становятся наиболее активированными в отношении вакцинных штаммов МБТ [1, 8]. Вместе с тем увеличение со временем общего пула специфически реагирующих эффектор-ных клеток с нарастанием доли иммунных ВАЛ туб. I класса (до 30,1±3,7 на 21-й день) с одновременным возрастанием их адгезивного потенциала (30,0±4,б8 на 21-й день) (табл. 1), на наш взгляд, являлись результатом перестройки рецепторного аппарата лимфоцитов в процессе их сенсибилизации антигенами БЦЖ. Кроме того, все это свидетельствовало не только об активации функциональной способности эффекторных клеток, но и об усиленном развитии адаптивных реакций, индуцированных введением вакцинного штамма.
Динамика изменения относительных показателей ВАЛ с адгезией ФЭБ Зонне имела противоположную направленность. С 3-го дня и до 70-х суток их содержание прогрес-
сивно уменьшалось (93,1±0,9% в исходном фоне против 32,2±2,0% на 28-е сутки). При этом минимальное количество неспецифических клеток I класса выявлено к концу 2—3-й недели поствакцинального периода (4,4±1,1—4,0±1,8%), а II класса — к первому месяцу (2б,7±1,7%), что составило почти трехкратное снижение относительно такового показателя в исходном фоне.
Таким образом, вакцинация меняет «профиль» эффекторных лимфоцитов. Увеличение доли специфических ВАЛ, прежде всего иммунных лимфоцитов I класса, носит альтернативный характер и свидетельствует, на наш взгляд, о развитии напряженного адаптивного ответа, индуцированного введением БЦЖ. Подтверждением сказанному служат установленные корреляционные связи: между средними значениями ИСРО и величиной суммарной адгезии специфических объектов (ФЭБ туб.) на мембранах ВАЛ туб. I класса (г=0,89, р<0,005); между динамикой значений ИСРО и абсолютными показателями ИСЛА (г=0,86, р<0,005). Полученные результаты позволяют говорить о сформировавшемся к концу сроков исследования прививочном противотуберкулезном иммунитете, а одновременное наличие иммунных ВАЛ туб. I класса и диагностических результатов ИСФ, ИСЛА и ИСРО — считать эквивалентами вакцинального процесса.
Библиографический список
1. Блум Б. Р. Туберкулез. Патогенез, защита, контроль. Пер. с англ./Б. Р. Блум.— М.: Медицина, 2002.— 696 с.
2. Ерохин В. В. Современные представления о туберкулезном воспалении/В. В. Ерохин, З. С. Земскова//Пробл. туб.— 2003.— № 3.— С. 11—21.
3. Каплин В. Н. Нетрадиционная иммунология инфекций/В. Н. Каплин.— Пермь: ПГМА, 1996.— 163 с.
4. Kaufmann S. Вакцинация против туберкулеза: современное состояние и перспективы на будущее. Пер. с англ./S. Kaufmann, H.-W. Mittrukef///Пробл. туб. и болезней легких.- 2005.- № 9.— С. 59-60.
5. Способ диагностики состояния фагоцитарной защиты: Авт. св-во № 2131609 Российской Федерации/В. Н. Каплин, А. П. Шаврин, А В. Старкова и др.//Изобре-тения. Полезные модели: бюл.— 1999.— № 16.
6. Способ иммунодиагностики инфекций: Авт. св-во № 1492280 Российской Федерации/В. Н. Каплин, Л. П. Санакоева, И. П. Корюкина и др.//Изобретения. Полезные модели: бюл.— 1989.— № 25.
7. Способ иммунодиагностики инфекции, вызванной микобактериями: патент № 2302634 Российской Федерации/ Л. П. Санакоева, В. А Четвертных, Л. А. Фокина///Изобретения. Полезные модели: бюл.— 2007.— № 19.
8. Flynn J. A. L. Immune responses in tuberculosis//. A. L. Flynn, J. D. Ernst//Curr. Opin. Immunol.— 2000.— Vol. 12.— P. 432— 436.
9. Heldwein K. A The role of Toll-like receptor in immunity against mycobacterial infec-tion/K. A. Heldwein, M. J. Fenton//Microbes and Infection.— 2002.— Vol. 4.— P. 937— 944.
10. Medzhitov R. Innate immunity/R. Medzhitov, C. Janeway//The New England Journal of Medicine.— 2000.— Vol. 343.— № 5.— P. 338—344.
11. Ovsyannikova I. G. Cytokine production pattern and antibody response to measles vaccine/I. G. Ovsyannikova, K. C. Reid, R M. Jacobson et a/.//Vaccine.- 2003.- Vol. 21.- № 25.- P. 3946-3953.
V. A. Chetvertnykh, I. V. Feldblyum, L. P. Sanakoeva, E. S. Gorovits, L. A. Fokina
DYNAMICS OF IMMUNOCELLULAR REACTIONS IN MODELING OF BCG-VACCINAL PROCESS IN RABBITS
It has been shown in the paper that formation of anti-tuberculous immunity in impuberal animals after BCG-vaccination is characterized by phase changes in vaccinal cutaneous reaction accompanied by cyclic alterations of blood lymphocyte content, gradual rise of immunocellular reactions. The results of investigation of specific leukocyte phagocytic activity and adhesive blood lymphocyte ability obtained on the basis of determination of specific phagocytosis indices (SPI), specific lymphocytic adhesion and specific disposition of objects on lymphocyte membrane can be used as integral indices to control development and to estimate tension of postvaccinal antituberculous immunity.
Keywords: BCG-vaccination, experiment, phases of process, leukocyte phagocytic activity, blood lymphocyte adhesive ability.
Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е. А. Вагнера
Материал поступил в редакцию 07.07.2008
