ЭВОЛЮЦИЯ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ГЕНОМОВ ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE O1 БИОВАРА ЭЛЬ ТОР, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ И ИЗ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НА КАВКАЗЕ С 1970 ПО 1998 ГОД Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»



© Савельев В.Н., Ковалев Д.А., Савельева И.В., Таран Т.В., Подопригора Е.И., Васильева О.В., Шапаков Н.А., Алехина Ю.А., Куличенко А.Н., 2020

УДК 616.932:579.843.1 «451.18»(479)

Эволюция фенотипических свойств и молекулярно-генетической организации геномов штаммов Vibrio cholerae O1 биовара Эль Тор, выделенных от больных и из объектов окружающей среды на Кавказе с 1970 по 1998 год

В.Н. Савельев, Д.А. Ковалев, И.В. Савельева, Т.В. Таран, Е.И. Подопригора, О.В. Васильева, Н.А. Шапаков, Ю.А. Алехина, А.Н. Куличенко

ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора, ул. Советская, д. 13—15, г. Ставрополь, 355035, Российская Федерация

Резюме: Введение. Формирование высокопатогенных для человека штаммов холерных вибрионов, обладающих устойчивостью к антибиотикам, определяет патогенез, клинику, эпидемиологию и лабораторную диагностику холеры. Необходимо изучение структуры генома холерных вибрионов любых серологических групп, выделяемых при плановом мониторинге объектов окружающей среды или больных ОКИ с целью обнаружения генов токси-генности, присущих эпидемическим штаммам V. choleras О1. Цель исследования. Изучение динамики изменений фе-нотипических свойств и молекулярно генетических основ персистенции, эпидемического и патогенетического потенциала Vibrio cholerae O1 биовара Эль Тор, выделенных от больных и из объектов окружающей среды на Кавказе с 1970 по 1998 год. Материалы и методы. Изучили фенотипические (микробиологический метод) и молекулярно-ге-нетические свойства (с помощью ПЦР) 32 штамма V. cholerae O1, выделенные от больных и из объектов окружающей среды на Кавказе (1970-1998 гг.). Результаты. Показано, что на территориях Кавказа обнаруживались: а) не-токсигенные, типичные по фенотипическим и молекулярно-генетическим свойствам штаммы V. cholerae O1, Эль Тор, ctxAB-, Hly+. Их токсигенный потенциал представлен экзо- и эндотоксинами, отличными от энтеротоксина токсигенного холерного вибриона; б) токсигенные типичные по фенотипическим и молекулярно-генетическим свойствам штаммы V. cholerae O1, Эль Тор, ctxABEL+, rtxC+, Hly- в период эпидемических вспышек холеры заносного характера, продуцирующие энтеротоксин СТ-2, содержащие гены, ответственные за персистентный, патогенный и пандемичный потенциал, и в) типичные по основным фенотипическим свойствам, но молекулярно-генетиче-ски измененные варианты холерного вибриона биовара Эль Тор - V. cholerae O1, Эль Тор ctxABCL+, rtxC+, Hly-. Заключение. Основным проявлением эволюционных изменений типичного токсигенного вибриона биовара Эль Тор явилась замена в его геноме гена ctxBEl на ген ctxBCL, кодирующий энтеротоксин классического типа (СТ-1), что значительно усилило персистентный, токсический, эпидемический и пандемический потенциал генетически измененных вариантов холерных вибрионов биовара Эль Тор. В геноме данных штаммов присутствует интегра-тивный и коньюгативный элемент SXT с генами полирезистентности к антибиотикам.

Ключевые слова: фенотипические и молекулярно-гнетические свойства V. cholerae O1 биовара Эль Тор, токсический, эпидемический и пандемический потенциал.

Для цитирования: Савельев В.Н., Ковалев Д.А., Савельева И.В., Таран Т.В., Подопригора Е.И., Васильева О.В., Шапаков Н.А., Алехина Ю.А., Куличенко А.Н. Эволюция фенотипических свойств и молекулярно-генетической организации геномов штаммов Vibrio cholerae O1 биовара Эль Тор, выделенных от больных и из объектов окружающей среды на Кавказе с 1970 по 1998 год // Здоровье населения и среда обитания. 2020. № 12 (333). С. 56-61. DOI: https:// doi.org/10.35627/2219-5238/2020-333-12-56-61

The Evolution of Phenotypic Properties and Molecular Genetic Organization of Genomes of Vibrio Cholerae O1 El Tor Variant Strains Isolated from Patients and Environmental

Objects in the Caucasus in 1970-1998

V.N. Savelyev, D.A. Kovalev, I.V. Savelyeva, T.V. Taran, E.I. Podoprigora, O.V. Vasйyevа, N.A. Shapakov, Yu.A. Alekhina, A.N. Kulichenko Stavropol Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor, 13-15 Sovetskaya Street, Stavropol, 355035, Russian Federation Summary. Introduction: The formation of highly pathogenic strains of Vibrio cholerae resistant to antibiotics determines the pathogenesis, clinical picture, epidemiology, and laboratory diagnosis of cholera. It is necessary to study the structure of the genome of V. cholerae of any serological groups isolated during routine monitoring of environmental objects or patients with acute intestinal infections in order to detect toxigenic genes inherent to epidemic strains of V. cholerae O1. Our objective was to study changes in phenotypic properties and molecular genetic bases of persistence, epidemic and pathogenetic potential of El Tor variant of Vibrio cholerae O1 isolated from patients and environmental objects in the Caucasus in 1970-1998. Materials and methods: We studied phenotypic and molecular genetic characteristics of 32 V. cholerae O1 strains isolated from patients and environmental objects in the Caucasus (1970-1998) using a microbiological assay and PCR test, respectively. Results: We established that the following biotypes of V. cholerae O1 were found in the Caucasus: a) El Tor, ctxA-, and Hly+ nontoxigenic strains of V. cholerae O1, typical in their phenotypic and molecular genetic properties. Their toxigenic potential is represented by exo- and endotoxins different from the enterotoxin of toxigenic V. cholerae; b) toxigenic El Tor, ctxABEL+, rtxC+, and Hly- variant biotypes of V. cholerae O1, typical in their phenotypic, molecular and genetic properties during outbreaks of invasive cholera, producing a CT-2 enterotoxin and containing genes responsible for persistent, pathogenic and pandemic potential, and c) typical in terms of their main phenotypic characteristics but molecularly genetically altered variants (hybrids) of El Tor variant of Vibrio cholerae O1 including El Tor ctxABCL+, rtxC+, Hly-. Conclusions: The main manifestation of evolutionary changes in a typical toxigenic vibrio of the El Tor variant biotype was the replacement of the ctxBEl gene in its genome with the ctxBCL gene encoding the classical type of enterotoxin (CT-1), which significantly increased the persistent, toxic, epidemic, and pandemic potential of genetically modified variants of El Tor biotype Vibrio cholerae. The genome of these strains contains an integrative and conjugative element SXT with genes for antibiotic multiresistance.

Keywords: phenotypic, molecular and genetic characteristics of El Tor variant of V. cholerae O1, toxigenic, epidemic and pandemic potential.

For citation: Savelyev VN, Kovalev DA, Savelyeva IV, Taran TV, Podoprigora EI, Vasilyeva OV, Shapakov NA, Alekhina YA, Kulichenko AN. The evolution of phenotypic properties and molecular genetic organization of genomes of Vibrio cholerae O1 El Tor variant strains isolated from patients and environmental objects in the Caucasus in 1970-1998. Zdorov'e Naseleniya i Sreda Obitaniya. 2020; (12(333)):56-61. (In Russian) DOI: https://doi.org/10.35627/2219-5238/2020-333-12-56-61

Author information: Savelyev V.N., https://orcid.org/0000-0001-6458-3725; Kovalev D.A., https://orcid.org/0000-0002-9366-5647; Savelyeva I.V., https://orcid.org/0000-0002-1254-2259; Taran T.V., https://orcid.org/0000-0002-4549-9701; Vasilyevа O.V., https://orcid.org/0000-0002-8882-6477; Shapakov N.A., https://orcid.org/0000-0001-9152-4026; Alekhina Yu.A., https://orcid.org/0000-000-9152-4126; Kulichenko A.N., https://orcid.org/0000-000-9362-3949.

<-h

Введение. Холера — древняя болезнь че-■—■ ловека, насчитывающая более 200 лет своего существования и в настоящее время представляют постоянную угрозу для населения ^ и общественного здравоохранения многих стран мира [1—4]. Продолжающаяся с 1961 г. седьмая пандемия характеризуется интенсивными проявлениями холеры в Африке, Азии, на Американском континенте (остров Гаити) с высокой вероятностью выноса инфекции в другие страны, в том числе и в Россию [5—8]. Седьмая пандемия холеры неоднократно заявляла о себе на Кавказе, традиционно остающемся высокоуязвимым в плане вероятного заноса инфекции из стран ближнего и дальнего зарубежья и последующего широкого распространения инфекции. Так, в семидесятые годы прошлого столетия холера регистрировалась в Азербайджане, Грузии, Дагестане; в восьмидесятые — в Грузии и Азербайджане; в девяностые — в Ставропольском крае, Дагестане, Армении.

Формирование высокопатогенных для человека штаммов холерных вибрионов, обладающих устойчивостью к антибиотикам, определяет патогенез, клинику, эпидемиологию и лабораторную диагностику холеры. У Vibrio cholerae О1 основные гены вирулентности кодируют факторы колонизации (ген tcpA), токсигенности (оперон ctxAB, кодирующий А и В субъединицы холерного энтеротоксина) и являются частью генома лизогенного филамен-тозного бактериофага СТХф [9]. Распространение СТХф может обусловить возникновение новых токсигенных штаммов V. cholerae из нетокси-генных предшественников [1]. Установлено, что геном V. cholerae О1 содержит уникальный класс интегронов, элементов генной экспрессии, приобретают открытые рамки считывания (ORF), что приводит к функциональным изменениям генома вибриона [10]. Это позволяет бактериям захватывать гены от других микроорганизмов. Поэтому необходимо изучение структуры генома холерных вибрионов любых серологических групп, выделяемых при плановом мониторинге объектов окружающей среды или больных ОКИ, с целью обнаружения генов токсигенности, присущих эпидемическим штаммам V. cholerae О1.

Цель исследования: изучение динамики изменений фенотипических свойств и моле-кулярно-генетических основ персистенции, эпидемического и патогенетического потенциала Vibrio cholerae O1 биовара Эль Тор, выделенные от больных и из объектов окружающей среды на Кавказе с 1970 по 1998 год.

Материалы и методы. В работе использованы 8 штаммов V. cholerae O1, El Tor, выделенные при рутинном методе забора воды в Азербайджане (реки Кура, Аракс) и 3 штамма данных микроорганизмов изолированные в Республике Дагестан (река Терек и канал им. Октябрьской Революции, далее — КОР); 5 штаммов, выделенные от людей в период эпидемических вспышек холеры в Азербайджане

в 1977 и 1985 годах; 16 штаммов V. cholerae O1, El Tor, выделенные от людей в Дагестане в период вспышек холеры в 1993, 1994, 1998 гг. Штаммы получены из «Коллекции патогенных микроорганизмов» ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора, где хранились в 0,4 % агаре Хоттингера под вазелиновым маслом при температуре 20—25 °С. Для изучения фенотипических и биологических свойств данных штаммов холерных вибрионов применена стандартная методика1.

Выделение бактериальной ДНК осуществляли в соответствие с инструкцией к набору ДНК-сорб В, «AmpliSens» (Россия). Полученную тотальную ДНК использовали для амплификации фрагментов генома изучаемых штаммов холерных вибрионов.

Молекулярно-генетические исследования заключались в поиске в геномах штаммов V. cholerae O1 генов токсигенности, свойственных типичному токсигенному или генетически измененному холерному вибриону биовара Эль Тор, с помощью ПЦР-тест системы «АмплиСенс V. cholerae-FL» (Россия) и экспериментальной ПЦР-тест-системы «Гены Vibrio cholerae О1 вариант ctxB, rtxC, FL» (Патент на изобретение № 2732448,РФ)2.

Результаты и обсуждение. Фенотипические и биологические свойства Vibrio cholerae O1, выделенных из объектов окружающей среды и от человека, представлены в табл. 1, из данных которой следует, что, независимо от места и времени изоляции штаммов изучаемых микроорганизмов, последние являются грамотрица-тельными, аспорогенными, полиморфными, прямыми или слегка изогнутыми палочками, активно подвижными с одним полярно расположенным жгутиком. Штаммы индофенолокси-дазоположительные, ферментирующие глюкозу в аэробных и анаэробных условиях до кислоты (без газа), расщепляющие маннозу, сахарозу, манит, не активные к лактозе, арабинозе, дуль-циту, инозиту, декарбоксилирующие лизин и орнитин, не обладающие аргининдегидролазой, агглютинирующиеся холерной сывороткой О1 серогруппы и О типовыми Ogawa или Inaba, и таким образом таксономически относятся к роду Vibrio семейства Vibrionaceae, виду Vibrio cholerae О1 серологической группы, сероварам Ogawа или Inaba.

Следует отметить, что штаммы Vibrio cholerae О1, выделенные в Азербайджане и Дагестане из воды поверхностных водоемов в период эпидблагополучия, были гемолиз положительными, а выделенные из окружающей среды из тех же объектов в период неблагополучия по холере оказались гемолиз отрицательными. Все исследуемые штаммы Vibrio cholerae О1, изолированные от людей с 1970 по 1998 г. в период вспышек холеры, были также гемолиз отрицательными в пробе Грейга. Вместе с тем оказалось (табл. 1), что если типичные токси-генные и нетоксигенные штаммы холерных вибрионов О1 серологической группы (выделенные

1 МУК 4.2.2218—07 «Лабораторная диагностика холеры». М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007. 87 с.

2 Савельев В.Н., Савельева И.В., Сосунов В.В., Ковалев Д.А., Подопригора Е.И., Васильева О.В., Гусева Л.В. Способ идентификации штаммов Vibrio cholerae O1, определения их токсигенности и биовара с дифференциацией на типичные и генетически измененные варианты методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест- система для его осуществления с учетом результатов в режиме «реального времени». Патент РФ № 2732448, опубл. 24.08.20. Бюл. № 24.

Таблица 1. Биохимическая характеристика штаммов V cholerae выделенных из воды поверхностных водоемов и от людей Table 1. Biochemical characteristics of V. cholerae strains isolated from surface bodies of water and humans

e s tí Я r

Штаммы V. cholerae О1 №№ / Numbers of V. cholerae Ol strains роза / sucrose e s о an s а з o in 1 Й а з о я я Хью Лейф- С( Hugh Leifson medium соза / glucose tol '3 3 т я e и to ct la з о si o in Ё e s о 3 а з озть н / lysine гтин / ornithine нин / arginine e ase •о 'Я o а аза ч лиз / hemolysis 0 m rn ¡= 1 о ЭМС / GPE aue M m О r -P se g £ фаги / phages

а X tí о я tí s IQ а £ O F 2 g IS tí s У з о я я s s н & о я и ¡¿ о о S SP Рч > E С

Азербайджан: V. cholerae О1, Эль Тор, Огава (ctxA-), вода рек Аракса и Куры, эпидблагополучие / Azerbaijan: V. cholerae О1, El Tor, Ogawa (ctxA-), waters of Rivers Araks and Kura, epidemiological well-being

288Az, 1970

2407Az, 1984

1800 Az, 1986 a a - + / + а а - - а + + - + + R + + + -

2409Az, 1987

2384Az, 1987

V. cholerae О1, Эль Тор, Огава (ctxA+), вода рек Аракса и Куры в период вспышек холеры / V. cholerae О1, El Tor, Ogawa (ctxA-), waters of Rivers Araks and Kura, cholera outbreaks

S352Az, 1985

S385Az, 1985 а a + / + a a a + + + R + + +

S396Az, 1985

S397Az, 1985

V. cholerae О1, Эль Тор, Огава (ctxA+), больные в период вспышек' холеры / V. cholerae О1, El Tor, Ogawa (ctxA-), patients, cholera outbreaks

123Az, 1977

276Az, 1977

285Az, 1977 a a - + / + a a - - a + + - + - R + + + -

363Az, 1985

357Az, 1985

Дагестан: V. cholerae О1, Эль Тор, Огава (ctxA—), вода реки Терек и КОР, эпидблагополучие / Dagestan: V. cholerae О1, El Tor, Ogawa (ctxA-), waters of River Terek and October Revolution Canal, epidemiological well-being

159D, 1967

1860, 1983 a a - + / + a a - - a + + - + + R + + + -

S546, 1996

V. cholerae О1, Эль Тор, Огава (ctxВСL+, rxC+), больные в период вспышек' холеры / V. cholerae О1, El Tor, Ogawa rxC+), patients, cholera outbreaks

169D, 1993 a a - + / + a a - - a + + - + + R + + + -

1045D, 1993 a a - + / + a a - - a + + - + + R + + + -

1308D, 1993 a a - + / + a a - - a + + - + + R + + + -

1726D, 1993 a a - + / + a a - - a + + - + + R + + + -

7D, 1994 a a - + / + a a - - a + + - + + R + + + -

17D, 1994 a a - + / + a a - - a + + - + + R + + + -

26D, 1994 a a - + / + a a - - a + + - + + R + + + -

S557D, 1994 a a - + / + a a - - a + + - + + R + + + -

1971D, 1994 a a - + / + a a - - a + + - + + R + + + -

16241D, 1994 a a - + / + a a - - a + + - + + R + + + -

10213D, 1994 a a - + / + a a - - a + + - + + R + + + -

10D, 1998 a a - + / + a a - - a + + - + + R + + + -

22D, 1998 a a - + / + a a - - a + + - + + R + + + -

34D, 1998 a a - + / + a a - - a + + - + + R + + + -

41D, 1998 a a - + / + a a - - a + + - + + R + + + -

Примечание к таблице 1: РВ полимиксин В, 50 ЕД; ЭМС эритроциты морской свинки, 2,5 %; VP — реакция Фогеса-Проскауэра; E — диагностический бактериофаг Эль Тор в ДРТ; С — диагностический бактериофаг классический в ДРТ; a — кислота; R — устойчивость к полимиксину; S — чувствительность к полимиксину.

Notes: PB, polymyxin B, 50 Units; GPE, guinea pig erythrocytes, 2.5%; VP, Voges-Proskauer test; E, El Tor typing bacteriophage in vibriocidal titer assay; C, classical typing bacteriophage in vibriocidal titer assay; a, acid; R, resistant to polymyxin; S, sensitive to polymyxin.

в 1970—1990 гг.) фенотипически были биоваром Эль Тор (устойчивы к 50 ЕД полимикси-на В, агглютинировали эритроциты морской свинки, образовывали ацетилметилкарбинол в реакции Фогес Проскауэра, лизировались диагностическим бактериофагом Эль Тор II), то часть штаммов Vibrio cholerae О1, выделенные в Дагестане в 1993, 1994 и 1998 гг., имели смешанные фенотипические свойства биовара

Эль Тор и классического. Подобные штаммы с неопределенным биоваром обнаруживались в Индии [11] и Тайланде [12]. Полученные данные (табл. 1) свидетельствуют, что в 90-е годы прошлого столетия появились штаммы холерного вибриона О1 серологической группы с типичными фенотипическими признаками биовара Эль Тор, продуцирующие классический тип энтеротоксина (СТ1) и с фенотипическими

признаками биоваров Эль Тор и классического, ■—■ но также с продукцией энтеротоксина классического типа (СТ1) [2, 19—23].

Традиционные фенотипические тесты, ^ определяющие биовар V. cholerae O1, оказались недостаточными для классификации на биовары данного таксона. Очевидно, в существующую схему биотипирования необходимо включить генетические маркеры, то есть маркерные гены классического и Эль Тор биоваров [23].

Молекулярно-генетическую организацию геномов штаммов Vibrio cholerae O1 El Tor изучали методом ПЦР-анализа на наличие или отсутствие генов, кодирующих токсины: ctxA, ctxB, rstR, zot, ace, ompU, tcpA, rstC, rtxC, nanH, mshA, mshQ, а также с помощью скрининга в геноме данных микроорганизмов наличия

островов персистенции (EPI), патогенности (VPI-1,2), пандемичности (VSP-1,2), интегра-тивного и коньюгативного элемента SXT с генами полирезистентности к антибиотикам.

Полученные результаты представлены в табл. 2, из данных которой следует, что типичный нетоксигенный холерный вибрион Эль Тор (ТНЭ, 8 штаммов) не содержит в своем геноме гены ни коровой, ни области RSII филаментозного фага СТХф, ни генов фага RSI, а также островов персистенции (EPI), патогенности (VPI-1,2) и пандемичности (VSP-1,2). Биовар атоксигенного холерного вибриона О1 серогруппы определяется общепринятыми фенотипическими тестами.

Девять исследованных типичных токси-генных штаммов биовара Эль Тор (исходно

Таблица 2. Молекулярно-генетические свойства V cholerae O1, выделенных от людей и из объектов окружающей среды на Кавказе в 1970-1998 гг. Table 2. Molecular genetic characteristics of V. cholerae O1 isolated from humans and environmental objects in the Caucasus,

1970-1998

№ п/п Штаммы V. cholerae O1 El Tor / Strains of El Tor variant of V cholerae O1 Год, место выделения / Year and place of isolation Источник / Source Наличие в геноме генов / Genes in the genome

ctxB3 ctxB1 rstC rtxC Эль / El Tor

1 288Az 1970, Азербайджан / Azerbaijan вода / water* - - + + таЭ / TN

2 2407Az 1984, Азербайджан / Azerbaijan вода / water* - - + + таэ / TN

3 1800Az 1986, Азербайджан / Azerbaijan вода / water* - - + + таЭ / TN

4 2384Az 1987, Азербайджан / Azerbaijan вода / water* - - + + таЭ / TN

5 2409Az 1987, Азербайджан / Azerbaijan вода / water* - - + + таЭ / TN

6 S352Az 1985, Азербайджан / Azerbaijan вода / water** + - + + TJ-Э / TT

7 S385Az 1985, Азербайджан / Azerbaijan вода / water** + - + + TJ-Э / TT

8 S396Az 1985, Азербайджан / Azerbaijan вода / water** + - + + TJ-Э / TT

9 S397Az 1985, Азербайджан / Azerbaijan вода / water** + - + + TJ-Э / TT

10 123Az 1977, Азербайджан / Azerbaijan больной / patient + - + + TJ-Э / TT

11 S276Az 1977, Азербайджан / Azerbaijan больной / patient + - + + TJ-Э / TT

12 S285Az 1977, Азербайджан / Azerbaijan больной / patient + - + + TJ-Э / TT

13 S353Az 1985, Азербайджан / Azerbaijan больной / patient + - + + TJ-Э / TT

14 S357Az 1985, Азербайджан / Azerbaijan больной / patient + - + + TJ-Э / TT

15 159D 1967, Дагестан / Dagestan вода*, КОР / water,* ORC - - + + таэ / TN

16 1860D 1983, Дагестан / Dagestan вода*, КОР / water,* ORC - - + + таэ / TN

17 S546D 1996, Дагестан / Dagestan вода*р. Терек / water,* River Terek - - + + таэ / TN

18 169D 1993, Махачкала / Makhachkala больной / patient - + + + ГИЭ / Hybrid

19 1045D 1993, Махачкала / Makhachkala больной / patient - + - + ГИЭ / Hybrid

20 1308D 1993, Махачкала / Makhachkala больной / patient - + + + ГИЭ / Hybrid

21 1726D 1993, Махачкала / Makhachkala больной / patient - + - + ГИЭ / Hybrid

22 7D 1994, с. Герга / Gerga rural settlement больной / patient - + + + ГИЭ / Hybrid

23 17D 1994, с. Герга / Gerga rural settlement больной / patient - + + + ГИЭ / Hybrid

24 26D 1994, с. Герга / Gerga rural settlement больной / patient - + + + ГИЭ / Hybrid

25 S557D 1994, Тляратинский р-н / Tlyaratinsky district больной / patient - + + + ГИЭ / Hybrid

26 1971D 1994, Дербентский р-н / Derbentsky district больной / patient - + + + ГИЭ / Hybrid

27 16241 1994, Дагестан, Гергебельский р-н / Dagestan, Gergebelsky district больной / patient - + + + ГИЭ / Hybrid

28 10213 1994, Дагестан, Бабаюртовский р-н / Dagestan, Babayurtovsky district больной / patient - + + + ГИЭ / Hybrid

29 10D 1998, Дербентский р-н / Derbentsky district больной / patient - + + + ГИЭ / Hybrid

30 22D 1998, Дербентский р-н / Derbentsky district больной / patient - + + + ГИЭ / Hybrid

31 34D 1998, Дербентский р-н / Derbentsky district больной / patient - + + + ГИЭ / Hybrid

32 41D 1998, Дагестан, Хивский р-н / Dagestan, Khivsky district больной / patient - + + + ГИЭ / Hybrid

Примечаниек таблице 1: РВ полимиксин В, 50 ЕД; ЭМС эритроциты морской свинки, 2,5 %; VP — реакция Фогеса-Проскауэра; E — диагностический бактериофаг Эль Тор в ДРТ; С — диагностический бактериофаг классический в ДРТ; a — кислота; R — устойчивость к полимиксину; S — чувствительность к полимиксину.

Note: PB, polymyxin B, 50 Units; GPE, guinea pig erythrocytes, 2.5%; VP, Voges-Proskauer test; E, El Tor typing bacteriophage in vibriocidal titer assay; C, classical typing bacteriophage in vibriocidal titer assay; a, acid; R, resistant to polymyxin; S, sensitive to polymyxin.

60

ЗНиСб декабрь №12 (ззз)

регистрируемых как доминантный возбудитель холеры Эль Тор с 1961 по 1991 г.), как и референтный штамм № 16961 (Gen Bank), содержат в своем геноме только эльторовские гены, в числе которых ген ctxBEl, кодирующий биосинтез холерного энтеротоксина типа СТ-2, а также гены rstREl в области RSII и в профаге RSIra; rstC в профаге RSIra; rtxC кластера RTX. Гены mshQ и ompW; tcpAEl, VC1758 и VC1760; VC0175 и VC0185, VC0490 и VC0493 свидель-ствуют о присутствии, соответственно, островов персистенции (EPI), патогенности (VPI1,2) и пандемичности (VSP1,2).

Изучаемые гибридные варианты биовара Эль Тор (15 штаммов) в своем геноме содержат, помимо генов биовара Эль Тор, гены классического биовара (ctxBCl и/или rstRCl), a также, как и типичные токсигенные холерные вибрионы ЭльТор, острова персистенции (EPI), патогенности (VPI1,2) и пандемичности (VSP1,2), но только у гибридных вариантов биовара Эль Тор обнаруживается интегративный и коньюгативный элемент SXT с генами полирезистентности к антибиотикам. Основным проявлением эволюционных изменений типичного токсигенного вибриона биовара Эль Тор явилась замена гена ctxBEl на ген ctxBCL, что значительно усилило токсический, эпидемический и пандемический потенциал генетически измененных вариантов холерных вибрионов биовара Эль Тор [24,25].

Следует отметить, что молекулярно-гене-тический анализ измененных вариантов Vibrio cholerae биовара Эль Тор, обнаруженных на Кавказе (Дагестан, 1993, 1994, 1998 гг.) и на Украине (1994, 2011 гг.), выявил изменения в структуре профагов СТХш и RS1œ как результат произошедших в девяностые годы ХХ столетия эволюционных преобразований генома типичного токсигенного холерного вибриона биовара Эль Тор, и представлена различными комбинациями генов патогенности типичного Эль Тор и классического биоваров: ctxBCL, rstRCL, rstREl, rstC; ctxBGl, rstREL, rstC; ctxB°l, rstRCL, rstC; ctxBCL, rstRCL, rstREl. Геном гибридных вариантов биовара Эль Тор обязательно содержит ген ctxBCl, кодирующий биосинтез энтеротоксина классического типа (СТ1), что подтверждается результатами секвенирования амплификата данного гена, полученного в ПЦР: в нуклеотидной последовательности этого гена в положениях 115 и 203 находится цитозин (СТ1), а аминокислотная последовательность «В» субъединицы энтеротоксина в положениях 39 и 68 содержит, соответственно, гистидин (H) и треонин (Т);

Генотипические профили «гибридных» штаммов холерного вибриона биовара Эль Тор включают гены, находящиеся на функционально значимых мобильных генетических элементах, определяющих патогенный (ctxAB, rstR, ace, zot, ompU, tcpCl, tcpEr), пандемичный (deo 0490) и персистентный (mshA, mshQ) потенциал возбудителя холеры, а также гены консервативной части ДНК (toxR, rtxA, rtxC, hap).

Заключение

На территориях Кавказа (1970—1998 гг.) в процессе мониторинга больных ОКИ и объектов окружающей среды в целях профилактики холеры обнаруживались: нетоксигенные, типичные по фенотипическим и молекулярно-

генетическим свойствам, штаммы V. cholerae O1, Эль Тор ctxAB—, Hly+ (в основном из ;—■ объектов окружающей среды); их токсигенный потенциал представлен экзо- и эндотоксинами, отличными от энтеротоксина токсигенного ^ холерного вибриона; токсигенные типичные по ^^ фенотипическим и молекулярно-генетическим свойствам штаммы V. cholerae O1, Эль Тор ctxABEL+, rtxC+ Hly— (от людей и из объектов окружающей среды в период эпидемических вспышек холеры завозного характера), продуцирующие энтеротоксин типа СТ2, содержащие гены, ответственные за персистентный, патогенный и пандемичный потенциал и типичные по основным фенотипическим свойствам, но молекулярно-генетически измененные варианты холерного вибриона биовара Эль Тор — V. cholerae O1, Эль Тор ctxABCL+, rtxC+, Hly— (в основном от людей и из объектов окружающей среды непосредственно в очагах холеры завозного характера в период с 1993 по 1998 г. на Кавказе). Основным проявлением эволюционных изменений типичного токсигенного вибриона биовара Эль Тор явилась замена в его геноме гена ctxBEl на ген ctxBCL, кодирующий энтеротоксин классического типа (СТ1), что значительно усилило персистентный, токсический, эпидемический и пандемический потенциал генетически измененных вариантов холерных вибрионов биовара Эль Тор.

Таким образом, вектор эволюции штаммов Vibrio cholerae O1 биовара Эль Тор, выделенных на Кавказе с 1970 по 1998 г., направлен на появление штаммов с высоким эпидемическим потенциалом, обеспечивающим пандемическое распространение холеры Эль Тор в настоящее время.

Информация о вкладе авторов: концепция и дии зайн исследования — Савельев В.Н., Савельева И.В., Куличенко А.Н.; сбор и обработка материала — Ковалев А.Д., Таран Т.В.; написание текста — Савельева И.В., Подопригора Е.И., Шапаков Н.А.; редактирование — Савельев В.Н.; обзор публикаций по теме статьи — Алехина Ю.А., Васильева О.В.

Финансирование: работа выполнена в рамках НИОКР по заказу Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, регистрационный номер АААА-А19-119032590021-1: «Эволюционный анализ геномов Vibrio cholerae О1 биовара Эль Тор и филогео-графия заносов возбудителя холеры на территорию Северного Кавказа с 1970 по 1998 гг.»

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список литературы (пп. 1-4, 9-12, 15-20, 25 см. References)

5. Мазрухо А.Б., Москвитина Э.А., Адаменко О.Л. и др. Актуальные вопросы эпидемиологического надзора за холерой в Российской Федерации // Холера и патогенные для человека вибрионы. Матер. совещ. спец-в Роспотребнадзора — Ростов-на-Дону, 2013. Вып. № 26. С. 11-16.

6. Москвитина Э.А., Титова С.В., Адаменко О.Л. и др. Перспективы дальнейшего совершенствования эпидемиологического надзора за холерой в Российской Федерации // Холера и патогенные для человека вибрионы. Матер. совещ. спец-в Роспотребнадзора — Ростов-на-Дону, 2014. Вып. № 27. С. 14—18.

7. Назаретян А.А., Москвитина Э.А. Холера: Эндемичные территории стран мира. 2007—2011 гг. // Холера и патогенные для человека вибрионы. Матер. совещ. спец-в Роспотребнадзора — Ростов-на-Дону, 2013. Вып. № 26. С. 16—21.

^ 8. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Москвитина Э.А. и

I_ др. Холера в начале века. Прогноз // Журнал мик-

1—' робиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. ¿5 2005. № 3. С. 43-48.

^^ 13. Савельева И.В., Тюменцева И.С., Афанасьев Е.Н. ¡^^ и др. Оптимизация мониторинга Vibrio cholera O1 в i | объектах окружающей среды на основе использования ^^ магноиммуносорбентов. Холера и патогенные для человека вибрионы сб. ст. проблемной комиссии. Ростов-на-Дону, 2016. № 29. С. 196-198.

14. Смирнова Н.И., Горяев А.А., Кутырев В.В. Эволюция генома возбудителя холеры в современный период // Молекулярная генетика. 2010. № 4. С. 11-19.

21. Савельев В.Н., Куличенко А.Н., Савельева И.В. и др. Совершенствование биотипирования Vibrio cholera O1 в связи с глобальным распространением генетически измененных (гибридных) вариантов биовара Эль-Тор. Холера и патогенные для человека вибрионы: сб. ст. проблемной комиссии. Ростов-н/Д. 2016. № 29. С. 150-153.

22. Смирнова, Н.И., Заднова С.П., Шашкова А.П. и др. Вариабельность генома измененных вариантов Vibrio cholerae биовара Эль-Тор, изолированных на территории России в современный период // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011. № 3. С. 11-17.

24. Смирнова Н.И., Костромитина Е.А., Осин А.В. и др. Вариабельность генома штаммов Vibrio cholerae биовара Эль-Тор // Вестник РАМН. 2005. № 7. С. 19-26.

References

1. Mazel D, Dychinco B, Webb VA, et al. A distinctive class of integron in the Vibrio cholerae genome. Science. 1998; 280:605-608.

2. Safa A, Nair GB, Kong RY. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2010; 18(1):46-54. DOI: https://doi.org/10.1016/_j.tim.2009.10.003

3. Haider K, Das B, Nair GB, et al. Molecular evidence favouring step-wise evolution of Mozambique Vibrio cholerae O1 El Tor hybrid strain. Microbiology (Reading). 2010; 156(Pt 1):99-107. DOI: https://doi.org/10.1099/ mic.0.032458-0

4. Weekly epidemiological record. 293 Cholera, 2009. WHO, Geneva. 2010; 85(31):293-308. Available at: https://www.who.int/wer/2010/wer8531.pdf Accessed: 2 Dec 2020.

5. Mazrukho AB, Moskvitina EA, Adamenko OL, et al. [Topical issues of cholera epidemiological surveillance in the Russian Federation.] Cholera and Human Pathogenic Vibrios: Minutes of Rospotrebnadzor Expert Meetings. Rostov-on-Don, 2013; (26):11-16.

6. Moskvitina EA, Titova SV, Adamenko OL, et al. [Prospects for further improvement of epidemiological surveillance of cholera in the Russian Federation.] Cholera and Human Pathogenic Vibrios: Minutes of Rospotrebnadzor Expert Meetings. Rostov-on-Don, 2014; (27):14-18. (In Russian).

7. Nazaretyan AA, Moskvitina EA. [Cholera: Endemic areas of the countries of the world, 2007-2011.] Cholera and Human Pathogenic Vibrios: Minutes of Rospotrebnadzor Expert Meetings. Rostov-on-Don, 2013; (26):16-21. (In Russian).

8. Onishchenko GG, Lomov YuM, Moskvitina EA, et al. Cholera at the beginning of the XXI century. Prognosis. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii. 2005; (3):44-48. (In Russian).

9. Harris JB, LaRocque RC, Qadri F, et al. Cholera. Lancet. 2012; 379(9835):2466-2476. DOI: https://doi. org/10.1016/S0140-6736(12)60436-X

10. Fasano A, Baudry B, Pumplin DW, et al. Vibrio cholerae produces a second enterotoxin, which effects intestinal tight junctions. Proc Natl Acad Sci USA. 1991; 88(12):5242-5246.

11. Raychoudhuri A, Patra T, Ghosh K, et al. Classical ctxB in Vibrio cholerae O1, Kalkata, India. Emerg Infect Dis. 2009; 15(1):131-132. DOI: https://doi.org/10.3201/ eid1501.080543

12. Na-Ubol M, Srimanote P, Chongsa-Nguan M, et al. Hybrid & El Tor variant biotypes of Vibrio cholerae O1 in Thailand. Indian J Med Res. 2011; 133(4):387-394.

13. Savelyeva IV, Tyumentseva IS, Afanasyev EN, et al. [Optimization of Vibrio cholerae O1 monitoring in environmental objects based on the use of magno-immunosorbents.] Cholera and Human Pathogenic Vibrios: Minutes of Rospotrebnadzor Expert Meetings. Rostov-on-Don, 2016; (29):196-198. (In Russian).

14. Smirnova NI, Goryaev AA, Kutyrev VV. The evolution of the Vibrio cholerae genome during the modern period. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya. 2010; (4):11-19. (In Russian).

15. Waldor MK, Mekalanos JJ. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin. Science. 1996; 272(5270):1910-1914. DOI: https://10.1126/ science.272.5270.1910

16. Ansaruzzaman M, Bhuiyan NA, Nair GB, et al. Cholera in Mozambique, variant of Vibrio cholerae. Emerg Infect Dis. 2004; 10(11):2057-2059. DOI: https://doi. org/10.3201/eid1011.040682

17. Nair GB, Faruque SM, Bhuiyan NA, et al. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J Clin Microbiol. 2002; 40(9): 3296-3299. DOI: https://doi.org/10.1128/jcm.40.9.3296-3299.2002

18. Nair GB, Qadri F, Holmgren J, et al. Cholera due to altered El Tor strains of Vibrio cholerae O1 in Bangladesh. J Clin Microbiol. 2006; 44(11):4211-4213. DOI: https:// doi.org/10.1128/JCM.01304-06

19. Safa A, Bhuiyan NA, Nusrin S, et al. Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae O1 that are hybrids between classical and El Tor biotypes. J Med Microbiol. 2006; 55(Pt 11):1563—1569. DOI: https://doi.org/10.1099/ jmm.0.46689-0

20. Safa A, Sultana J, Cam PD, et al. Vibrio cholerae O1 hybrid El Tor strains, Asia and Africa. Emerg Infect Dis. 2008; 14(6):987—988. DOI: https://doi.org/10.3201/ eid1406.080129

21. Savelyev VN, Kulichenko AN, Savelyeva IV, et al. [Improvement of biotyping of Vibrio cholerae O1 due to the global spread of genetically modified (hybrid) variants of El Tor biotype.] Cholera and Human Pathogenic Vibrios: Minutes of Rospotrebnadzor Expert Meetings. Rostov-on-Don, 2016; (29):150—153. (In Russian).

22. Smirnova NI, Zadnova SP, Shashkova AV, et al. Genome variability in the altered variants of Vibrio cholerae biovar El Tor isolated in Russia. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya. 2011; (3):11—18. (In Russian).

23. Ghosh-Banerjee J, Senoh M, Takahashi T, et al. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor end classical biotypes. J Clin Microbiol. 2010; 48(11):4283—4286. DOI: https:// doi.org/10.1128/JCM.00799-10

24. Smirnova NI, Kostromitina EA, Osin AV, et al. [Variability of the genome of the El Tor variant of Vibrio cholerae O1.] Vestnik RAMN. 2005; (7):19—26. (In Russian).

25. Grim CJ, Hasan NA, Taviani E, et al. Genome sequence of hybrid Vibrio cholerae O1 MJ-1236, B-33, and CIRS 101 and comparative genomics with V. cholerae. J Bacteriol. 2010; 192(13):3524—3533. DOI: https://doi. org/10.1128/JB.00040-10

Контактная информация:

Савельев Вилорий Николаевич, заведующий лабораторией диагностики холеры и других кишечных инфекций ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора e-mail: Savelev39@inbox.ru Corresponding author:

Vilorij N. Savelyev, D.M.Sc., Head of the Laboratory for Diagnosis of Cholera and Other Intestinal Infections, Stavropol Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor e-mail: Savelev39@inbox.ru

Статья получена: 27.07.20 Принята в печать: 04.12.20 Опубликована: 25.12.20

öö ö