CC BY
35
тттт
ш
Эндотелиальные клетки-предшественницы костного мозга играют ключевую роль в прогрессии опухолевого роста на примере модели легочных метастазов у мышей
Наиболее ранней стадией рака является карцинома in situ. Она представляет собой образования мелкого размера, чаще всего не более 1-3 мм в диаметре, не прорастающие глубже базальной мембраны. В этой фазе опухоли лишены сосудов и питание клеток осуществляется лишь за счет процесса диффузии необходимых веществ из окружающих тканей. Так как трансформированные клетки значительно лимитированы в отношении необходимых для жизнедеятельности продуктов, рост новообразований в эту фазу сильно замедлен и они в течение нескольких месяцев или даже лет пребывают в «латентном состоянии». Ключевые события, которые инициируют фазу быстрого (экспоненциального) роста опухоли, плохо изучены. Они четко ассоциируются с васкуляризацией новообразования, так называемым «ангиогенным переключением», которое, возможно, стимулируется ангиогенными факторами продуцируемыми трансформированными клетками [1 ].
Формирование метастазов во многих случаях происходит по схожему сценарию. Большинство попадающих в системную циркуляцию малигнизированных клеток, по-видимому, погибает, а меньшая часть заселяет преметастатические ниши или участвует в их формировании [2, 3]. Затем клетки пролиферируют и формируют лишенные сосудов микрометастазы диаметром до 1-2 мм, в которых появление новых клеток находится в равновесии с их гибелью [4]. В подобном состоянии микрометастазы могут находиться длительное время, их прогрессия в макрометастазы также ассоциируется с «ангиогенным переключением» [5].
Неудивительно, что феномен «ангиогенного переключения» является предметом внимательного изучения, так как раскрытие основных механизмов данного процесса может дать толчок к разработке новых видов терапии и профилактики новообразований. Новые кровеносные сосуды могут образовываться путем ответвления от уже существующих или формироваться de novo за счет дифференцировки эндотелиальных клеток-предшественниц, мигрирующих из костного мозга [1]. Ранее было продемонстрировано, что циркулирующие эндотелиальные клетки-предшественницы могут участвовать в формировании сосудистой сети некоторых видов опухолей, а также трансплантированных тканей [6, 7]. Однако количество мигрирующих клеток было столь мало, что какая-либо существенная роль у описанного явления остается сомнительной.
Эти данные, опубликованные в журнале Science исследовательской группой V. Mittal, позволяют по новому оценить роль циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественниц костномозгового происхождения в процессе «ангиогенного переключения».
На первом этапе исследования RPF+ клетки карциномы легких Левиса, трансплантировали внутрикожно сингенным мышам, клетки костного мозга которых экспрессировали GFP (рис. 1А). На 14-е сут. после введения злокачественных клеток первичные опухоли подвергались резекции. Легкие исследовались на наличие метастазов на 14-е, 21 -е и 28-е сут. Через 2 недели в легочной ткани животных было обнаружено в среднем около 12 RPF+ микрометастазов (менее 1 мм в диаметре). Общее количество метастазов увеличивалось со временем (22 и 35 к 21-м и 28-м сут., соответственно). На 28-е сут. посттрансплантационного периода
47% процентов метастазов являлись макрометастазами (более 1 мм в диаметре). Таким образом, прогрессия микрометастазов в макрометастазы наступала на 3-4-й неделе после введения малигнизированных клеток.
Ассоциируется ли прогрессия микрометастазов в макрометастазы с «ангиогенным переключением»? Иммуногисто-химическое исследование метастазов на 14-е сут. показало практически полное отсутствие капиллярной сети при наличии редких CD31+ эндотелиоцитов. Напротив, анализ макрометастазов на 21-28-е сут. посттрансплантацион-ного периода выявил большое количество сосудов, содержащих CD31 + клетки. Следовательно, экспансия роста метастазов сопровождалось и параллельным развитием и ростом сосудов.
При детальном анализе макрометастазов было обнаружено, что около 13% клеток эндотелия формирующихся сосудов характеризовались фенотипом GFP+/CD31+, то есть имели костномозговое происхождение. Как было показано ранее, эндотелиальные клетки костномозгового происхождения являются потомками костномозговых эндотелиальных клеток-предшественников (bone-marrow endothelial progenitor cells, BM-EPCs) с высокой степенью экспрессии VE-cadherin, VEGFR2, слабой экспрессией CD31 и CD133 и отсутствием экспрессии гематопоэтических маркеров [8]. Инфильтрация GFP+/VE-cadherin+ BM-EPCs наблюдалась по периферии микрометастазов. Концентрация этой популяции клеток была в 5 раз выше, чем в нормальной окружающей легочной ткани.
Таким образом, прогрессия микрометастазов в макрометастазы ассоциируются с «ангиогенным переключением», в процессе которого BM-EPCs мигрируют в очаги поражения, дифференцируются и участвуют в формировании сети кровеносных сосудов метастатических очагов.
Для оценки значимости мигрирующих эндотелиальных клеток-предшественников в прогрессии роста метастазов была создана in vivo модель с селективной недостаточностью BM-EPCs. Авторы сфокусировались на транкрипционном факторе Id1, так как у мышей с нокаутом по гену Id1 наблюдается ослабленный рост новообразований по причине дефектов формирования сосудов [9]. В ответ на введение клеток опухоли авторы обнаружили 2,5-кратное возрастание экспрессии мРНК Id1 в клетках костного мозга. Более того, экспрессия ограничивалась популяцией EPCs и не была обнаружена в других клетках костного мозга, что может свидетельствовать о ключевой роли Id1 в реализации функций EPCs по формированию сосудистой сети новообразований.
В модели использовалась shRNA, которая снижала уровень эндогенного Id1, а также его мРНК, более чем на 95%. В качестве контроля использовалась неспецифическая shRNA. Lin- клетки костного мозга Rosa26-rtTA трансгенных мышей трансфецировались вектором на основе лен-тивируса с Id1 или неспецифической shRNA, экспрессия которых могла быть индуцирована доксициклином. Этот подход позволил авторам селективно подавлять экспрессию Id1 в клетках костного мозга в ранее установленное время прогрессии микрометастазов в макрометастазы, не оказывая какого-либо влияния на вклад BM-EPCs в рост первичной опухоли, которая не растет у мышей с нокаутом по гену Id1.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 2, 2008
тттт
_
Схема эксперимента.
Трансфецированные клетки трансплантировались летально облученным мышам. На 4-й неделе посттрансплан-тационного периода осуществлялась подкожная инъекция RPF+ клеток карциномы легких Левиса. До введения док-сициклина параметры роста опухолей у мышей обеих групп были одинаковы. Однако введение доксициклина на 14-е сут. после трансплантации опухолевых клеток приводило к существенному снижению общего количества легочных метастазов у животных опытной группы к 28-м сут. (28±5 у мышей без введения докцициклина (^ох) и 8±5 у мышей с введением доксициклина (+Dox)) в сравнении с животными контрольной группы (32±7 у ^ох мышей и 33±6 у +Dox мышей). Снижение количества метастазов у +Dox мышей опытной группы было обусловлено снижением количества макрометастазов (13,8±6,1 у ^ох мышей и 0,6±1,3 у +Dox мышей, Р = 0,0014). Не было обнаружено значительного снижения числа микрометастазов у всех групп мышей, что свидетельствует о том, что репрессия №1 не влияет на начальную колонизацию опухолевыми клетками тканей легких, однако нарушает прогрессию микрометастазов в макрометастазы. Более того, +Dox мыши
опытной группы имели значительно большую продолжительность жизни.
Подавление экспрессии Id1 приводило к трехкратному снижению уровня циркулирующих c-kit+/VEGFR2+/CD11 b-EPCs в сравнении с -Dox мышами. Снижение количества EPCs было специфично, так как уровни клеток гематопоэти-ческого ряда, включая В-, Т-клетки, миелоидные и VEGFR1 + клетки, существенно не изменялись. Индуцированная недостаточность циркулирующих BM-EPCs привела к существенному снижению плотности сосудов в метастатичеких очагах у +Dox мышей опытной группы (22,2±4,7% у -Dox мышей и 4,1 ±2,9% у +Dox мышей).
Таким образом, BM-EPCs играют ключевую роль в процессе «ангиогенного переключения», который лежит в основе прогрессии метастатических очагов. При этом BM-EPCs не влияют на инициацию образования метастазов, которая, как было показано ранее, зависит от VEGFR1 + гемопоэтических клеток [2]. Несмотря на то, что лишь около 12% эндотелиальных клеток в сосудистой сети макрометастазов имеют костномозговое происхождение, недостаточность мигрирующих EPCs приводит к критическому
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 2, 2008
I I I I I
Ш
снижению ангиогенеза и, как следствие, подавлению фор- цию в инициации формирования новых сосудов благодаря
мирования макрометастазов. Эти факты свидетельствуют о секреции многочисленных паракринных факторов.
том, BM-EPCs могут иметь важную «инструктивную» функ-
ЛИТЕРАТУРА:
1. Bergers G., Benjamin L. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat. Rev. Cancer 2003; 3: 401-10.
2. Kaplan R., Riba R., Zacharoulis S. et al. VEGFR1 -positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature 2005; 438: 820-7.
3. Hiratsuka S., Watanabe A., Aburatani H., Maru Y. Tumour-mediated upregulation of chemoattractants and recruitment of myeloid cells predetermines lung metastasis. Nat. Cell. Biol. 2006; 8: 1369-75.
4. Townson J., Chambers A. Dormancy of solitary metastatic cells. Cell Cycle 2006; 5: 1744-50.
5. Holmgren L., O'Reilly M., Folkman J. Dormancy of micrometastases: balanced proliferation and apoptosis in the presence of angiogenesis suppression.
Nat. Med. 1995; 1: 149-53.
6. Peters B., Diaz L., Polyak K. et al. Contribution of bone marrow-derived endothelial cells to human tumor vasculature. Nat. Med. 2005; 11: 261-2.
7. Minami E., Laflamme M., Saffitz J., Murry C. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation 2005; 112: 2951-8.
8. Nolan D., Ciarrocchi A, Mellick A. et al. Bone marrow-derived endothelial progenitor cells are a major determinant of nascent tumor neovascularization. Genes Dev. 2007; 21: 1546-58.
9. Ruzinova M., Schoer R., Gerald W. et al. Effect of angiogenesis inhibition by Id loss and the contribution of bone-marrow-derived endothelial cells in spontaneous murine tumors. Cancer Cell 2003; 4: 277-89.
Подготовил B.C. Сергеев
По материалам: Gao D., Nolan D., Mellick A. et al. Endothelial progenitor cells control the angiogenic switch in mouse lung metastasis. Science. 2008; 319: 195-8
Количество стволовых гемопоэтических клеток в кровотоке подвержено суточным колебаниям
Одним из наиболее эффективных методов лечения пациентов с заболеваниями системы крови (иммунопатии, лейкозы, лимфомы) является трансплантация клеток костного мозга [1, 2]. Эффективность операции определяется не только ^А-совместимостью клеточного материала, но и успешностью проведения предоперационных мероприятий - миелоабляции. Помимо ликвидации трансформированных клеток крови и освобождения костномозговых ниш от стволовых кроветворных клеток (СКК) реципиента радикальные способы предоперационной подготовки сопровождаются тяжелыми побочными эффектами в виде манифестации оппортунистических инфекций, остеопении, поражения эндокринных желез, печени, нервной и дыхательной систем [3].
С целью предотвращения побочных эффектов разрабатываются новые щадящие способы предтрансплантацион-ных мероприятий. В частности, положительные результаты были получены при системном введении антител против с-к^ (CD 117), экспрессирующегося СКК. В результате блокировались с-к^-зависимые процессы пролиферации, диф-ференцировки, миграции и адгезии клеток, что вызывало временное высвобождение недифференцированных гемопоэтических клеток из занимаемых костномозговых ниш, нивелируя риск развития опасных побочных реакций [4]. Одновременно детализируются физиологические механизмы миграции недифференцированных гемопоэтических клеток, что создает предпосылки для разработки более совершенных предтрансплантационных методов [5].
В журнале №^ге S. Mendez-Ferrer с соавт. опубликовали материалы исследования, в которых описали суточные колебания численности СКК в крови и идентифицировали механизмы высвобождения недифференцированных гемо-поэтических клеток из костномозговых ниш.
Авторы показали, что максимальное содержание СКК в крови мышей приходится на 5 часов после начала воздействия светового стимула длительностью 12 часов, а самая низкая численность наблюдается через 5 часов
после прекращения его действия. Приняв выявленные циркадианные колебания за стандарт, исследователи показали, что при воздействии только светом в течение 2 недель происходит нарушение ритмичности изменения содержания СКК в крови, а при нахождении животных в темноте на протяжении 2 недель колебания численности имели ритмичный характер, который отличается от стандартного. Следовательно, изменение длительности светового раздражителя влияет на численность СКК в кровотоке.
Одним из основных цитокинов, ответственных за миграцию недифференцированных гемопоэтических клеток, является СХ^12 (SDF-1) [6, 7]. Механизм действия грануло-цитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСф), применяющегося в клинической практике для мобилизации СКК в кровоток, реализуется, как считается, через индукцию биодеградации СХ^12 и супрессию синтетической активности остеобластов [8]. Исследователи установили, что протеолизу подвергается лишь та фракция цитокина, которая синтезируется остеобластами, а циркадианным колебаниям подвержен уровень экспрессии мРНК СХ^12 в преостеобластах и ретикулярных клетках.
По аналогии с доказанной зависимостью секреции Г-КСф от сигналов симпатической нервной системы (СНС) [9] авторы предположили, что продукция СХ^12 также регулируется симпатическим отделом вегетативной нервной системы. Подтверждением послужило отклонение суточного ритма экспрессии СХ^12 при денервации костного мозга как введением 6-гидроксидофамина (системная обратимая дисфункция СНС), так и односторонней резекцией бедренного и седалищного нервов вблизи выхода их из поясничного и крестцового сплетений соответственно. Десимпатизацию костного мозга подтверждали использованием антител против тирозинкиназы, что позволяет визуализировать волокна СНС при нормальном физиологическом состоянии [10]. Аритмичность колебаний секреции СХ^12 коррелировала с отклонением содержания СКК в кровотоке.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 2, 2008
