CC BY
34
I I I I I
Ш
Новости клеточных технологий
снижению ангиогенеза и, как следствие, подавлению фор- цию в инициации формирования новых сосудов благодаря
мирования макрометастазов. Эти факты свидетельствуют о секреции многочисленных паракринных факторов.
том, BM-EPCs могут иметь важную «инструктивную» функ-
ЛИТЕРАТУРА:
1. Bergers G., Benjamin L. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat. Rev. Cancer 2003; 3: 401-10.
2. Kaplan R., Riba R., Zacharoulis S. et al. VEGFR1 -positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature 2005; 438: 820-7.
3. Hiratsuka S., Watanabe A., Aburatani H., Maru Y. Tumour-mediated upregulation of chemoattractants and recruitment of myeloid cells predetermines lung metastasis. Nat. Cell. Biol. 2006; 8: 1369-75.
4. Townson J., Chambers A. Dormancy of solitary metastatic cells. Cell Cycle 2006; 5: 1744-50.
5. Holmgren L., O'Reilly M., Folkman J. Dormancy of micrometastases: balanced proliferation and apoptosis in the presence of angiogenesis suppression.
Nat. Med. 1995; 1: 149-53.
6. Peters B., Diaz L., Polyak K. et al. Contribution of bone marrow-derived endothelial cells to human tumor vasculature. Nat. Med. 2005; 11: 261-2.
7. Minami E., Laflamme M., Saffitz J., Murry C. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation 2005; 112: 2951-8.
8. Nolan D., Ciarrocchi A, Mellick A. et al. Bone marrow-derived endothelial progenitor cells are a major determinant of nascent tumor neovascularization. Genes Dev. 2007; 21: 1546-58.
9. Ruzinova M., Schoer R., Gerald W. et al. Effect of angiogenesis inhibition by Id loss and the contribution of bone-marrow-derived endothelial cells in spontaneous murine tumors. Cancer Cell 2003; 4: 277-89.
Подготовил B.C. Сергеев
По материалам: Gao D., Nolan D., Mellick A. et al. Endothelial progenitor cells control the angiogenic switch in mouse lung metastasis. Science. 2008; 319: 195-8
Количество стволовых гемопоэтических клеток в кровотоке подвержено суточным колебаниям
Одним из наиболее эффективных методов лечения пациентов с заболеваниями системы крови [иммунопатии, лейкозы, лимфомы) является трансплантация клеток костного мозга [1, 2]. Эффективность операции определяется не только HLA-совместимостью клеточного материала, но и успешностью проведения предоперационных мероприятий - миелоабляции. Помимо ликвидации трансформированных клеток крови и освобождения костномозговых ниш от стволовых кроветворных клеток (СКК) реципиента радикальные способы предоперационной подготовки сопровождаются тяжелыми побочными эффектами в виде манифестации оппортунистических инфекций, остеопении, поражения эндокринных желез, печени, нервной и дыхательной систем [3].
С целью предотвращения побочных эффектов разрабатываются новые щадящие способы предтрансплантацион-ных мероприятий. В частности, положительные результаты были получены при системном введении антител против c-kit [CD 117), экспрессирующегося СКК. В результате блокировались c-kit-зависимые процессы пролиферации, диф-ференцировки, миграции и адгезии клеток, что вызывало временное высвобождение недифференцированных гемопоэтических клеток из занимаемых костномозговых ниш, нивелируя риск развития опасных побочных реакций [4]. Одновременно детализируются физиологические механизмы миграции недифференцированных гемопоэтических клеток, что создает предпосылки для разработки более совершенных предтрансплантационных методов [5].
В журнале Nature S. Mendez-Ferrer с соавт. опубликовали материалы исследования, в которых описали суточные колебания численности СКК в крови и идентифицировали механизмы высвобождения недифференцированных гемо-поэтических клеток из костномозговых ниш.
Авторы показали, что максимальное содержание СКК в крови мышей приходится на 5 часов после начала воздействия светового стимула длительностью 12 часов, а самая низкая численность наблюдается через 5 часов
после прекращения его действия. Приняв выявленные циркадианные колебания за стандарт, исследователи показали, что при воздействии только светом в течение 2 недель происходит нарушение ритмичности изменения содержания СКК в крови, а при нахождении животных в темноте на протяжении 2 недель колебания численности имели ритмичный характер, который отличается от стандартного. Следовательно, изменение длительности светового раздражителя влияет на численность СКК в кровотоке.
Одним из основных цитокинов, ответственных за миграцию недифференцированных гемопоэтических клеток, является СХ^12 [SDF-1) [6, 7]. Механизм действия грануло-цитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСф), применяющегося в клинической практике для мобилизации СКК в кровоток, реализуется, как считается, через индукцию биодеградации СХ^12 и супрессию синтетической активности остеобластов [8]. Исследователи установили, что протеолизу подвергается лишь та фракция цитокина, которая синтезируется остеобластами, а циркадианным колебаниям подвержен уровень экспрессии мРНК СХ^12 в преостеобластах и ретикулярных клетках.
По аналогии с доказанной зависимостью секреции Г-КСФ от сигналов симпатической нервной системы (СНС) [9] авторы предположили, что продукция СХ^12 также регулируется симпатическим отделом вегетативной нервной системы. Подтверждением послужило отклонение суточного ритма экспрессии СХ^12 при денервации костного мозга как введением 6-гидроксидофамина (системная обратимая дисфункция СНС), так и односторонней резекцией бедренного и седалищного нервов вблизи выхода их из поясничного и крестцового сплетений соответственно. Десимпатизацию костного мозга подтверждали использованием антител против тирозинкиназы, что позволяет визуализировать волокна СНС при нормальном физиологическом состоянии [10]. Аритмичность колебаний секреции СХ^12 коррелировала с отклонением содержания СКК в кровотоке.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 2, 2008
тттт
Новости клеточных технологий
Для идентификации типа адренорецепторов, посредством которых реализуется влияние СНС на функционирование элементов костномозгового микроокружения, исследователи применяли селективные и неселективные адреномиметики и антагонисты. Было показано, что секреция СХ^12 изменяется лишь при воздействии на Р3-адренорецепторы (Р3-ар), которые экспрессируются преостеобластами и фибробластоподобными ретикулярными клетками, определяя незначительную роль зрелых остеобластов, содержащих р2-ар в регуляции циркадианных колебаний уровня СКК в кровотоке. При стимуляции Р3-ар снижалась продукция транскрипционного фактора Sp-1 в связи с ингибированием цАМФ-зависимой протеин-киназы, снижалась экспрессия мРНК СХ^12, что ассоциировалось с повышением уровня недифференцированных гемопоэтических клеток в крови. Сходная тенденция наблюдалась при блокаде цАМФ-зависимой протеинкиназы специфическим ингибитором (Н-89).
Напротив, блок р3-ар за час до инициация действия светового раздражителя предотвращал утреннее повышение содержания СКК в кровотоке, а применение р-адреноми-метиков не влияло на колебание уровня недифференцированных гемопоэтических клеток мышей, лишенных гена Adrb3, кодирующего р3-ар.
Авторы показали определяющую роль основных генов «биологических часов» Bmall, Perl, Per2, Cry1 и Rev-erba [11], активно экспрессирующихся как нейронами супрахи-азмального ядра гипоталамуса, связанными с сетчаткой ре-тиногипоталамическими трактами, так и в периферических тканях. Однако основное значение в регуляции циркадианных колебаний численности СКК в кровотоке принадлежит именно структурам ЦНС, так как исследователи in vitro показали, что даже при отсутствии Bmall, Perl или Per2 в генотипе стромальных клеток при воздействии неселективного p-адреномиметика наблюдалось закономерное снижение экспрессии CXCL12.
Qi—* СхсИ 2 іХ» Схс112
Схс112
Модель регуляции миграции СКК:
ГМ - головной мозг: СХЯ - супрахиазмальное ядро; КМ - костный мозг: р3-АР - ¡33-адренорецептор, НА - норадреналин
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 2, 2008
I I I I I
Ш
Новости клеточных технологий
Нейроны супрахиазмального ядра имеют рецепторы к мелатонину - основному гормону эпифиза, регулирующему биоритмы организма [12]. Секреция гормона также подчинена циркадианным колебаниям с максимумом концентрации в крови в ночное время суток [13]. В этой связи, сбалансированная модуляция активности симпатической нервной системы мелатонином через клетки супрахиаз-мального ядра, контролирующаяся основными генами «биологических часов», определяет ритмичность выделения катехоламинов в костном мозге. В итоге обеспечивается физиологическая циркуляция СКК между костномозговыми нишами и периферическим кровотоком.
Таким образом, содержание недифференцированных гемопоэтических клеток в системном кровотоке регулируется в том числе и генами «биологических часов», ритмично индуцирующими секрецию катехоламинов синаптическими окончаниями СНС в костном мозге в корреляции с действием светового раздражителя и функционированием эпифиза (рис.). Данная закономерность может быть использована в выборе времени трансплантации недифференцированных гемопоэтических клеток - при максимальной концентрации СКК в кровотоке, а также в мобилизации СКК из костномозговых ниш путем воздействия на определенные звенья регуляции миграции СКК.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Buckley R., Schiff S., Schiff R. Hematopoietic stem-cell transplantation for the treatment of severe combined immunodeficiency. N. Engl. J. Med. 1999; 340: 508-16.
2. Appelbaum F., Herzig G., Ziegler J. Successful engraftment of cryopreserved autologous bone marrow in patients with malignant lymphoma. Blood 1978; 52: 85-95.
3. Wingard J.R., Vogelsang G.B. Deeg H.J. Stem Cell Transplantation: Supportive Care and Long-Term Complications. Hematology 2002; 422-44.
4. Czechowicz A., Kraft D., Weissman I. Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches. Science 2007; 318: 1296-99.
5. Mendez-Ferrer S., Lucas D., Battista M. et al. Haematopoietic stem cell release is regulated by circadian oscillations. Nature 2008; 452: 442-7.
6. Aiuti A., Webb I.J., Bleul C. et al. The chemokine SDF-1 is a chemoattractant for human CD341 hematopoietic progenitor cells and provides a new mechanism to explain the mobilization of CD341 progenitors to peripheral blood. J. Exp. Med. 1997; 185: 111-20.
7. Wright D.E., Bowman E. P., Wagers A. J. et al. Hematopoietic stem cells are uniquely selective in their migratory response to chemokines. J. Exp. Med. 2002; 195: 1145-54.
8. Levesque J. P., Hendy J., Takamatsu Y. et al. Disruption of the CXCR4/ CXCL12 chemotactic interaction during hematopoietic stem cell mobilization induced by GCSF or cyclophosphamide. J. Clin. Invest. 2003; 111: 187-96.
9. Katayama Y., Battista M., Kao W.M. et al. Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem and progenitor cell egress from bone marrow. Cell 2006; 124: 407-21.
10. Price J. An immunohistochemical and quantitative examination of dorsal root ganglion neuronal subpopulations. J. Neurosci. 1985; 5(8): 2051-9.
11. Levi F., Schibler U. Circadian rhythms: mechanisms and therapeutic implications. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2007; 47: 593-628.
12. Korf H.W., von Gall C. Mice, melatonin and the circadian system. Mol.Cell Endocrinol. 2006; 252: 57-68.
13. Pelham R.W. A serum melatonin rhythm in chickens and its abolition by pinealectomy. Endocrinology 1975; 96 (2): 543-6.
Подготовил И.Я. Бозо
По материалам Mendez-Ferrer S., Lucas D, Battista M. et al. Haematopoietic stem cell release is regulated by circadian oscillations. Nature 2008; 452:442-7
Определение иерархии среди мультипотентных гемопоэтических клеток человека
Мультипотентность и способность к долговременному самообновлению являются главными качествами гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Следующей ступенью в иерархии гемопоэтических клеток являются мультипотент-ные клетки-предшественницы (МПП), которые сохраняют множественный дифференцировочный потенциал, но утрачивают способность к долговременному самообновлению. Иммунофенотипические характеристики, определяющие иерархию среди этих популяций клеток человека, пока еще не были четко определены.
Ранее было показано, что фракции клеток костного мозга и пуповинной крови человека, содержащие ГСК, обогащены Lin-CD34+CD38-CD90+ клетками [1, 2]. R. Majeti и соавт. предложили использовать в качестве дополнительного маркера антиген CD45RA, с помощью которого удалось продемонстрировать, что Lin-CD34+CD38- фракция клеток костного мозга и пуповинной крови человека могут быть разделены на три субпопуляции: CD90+CD45RA-, CD90-CD45RA- и CD90-CD45RA+ клетки.
Lin-CD34+CD38- клеточные субпопуляции были выделены из образцов пуповинной крови человека с помощью FACS, с чистотой >95%. Методом колониеобразующего теста в среде Methocult, авторы оценили дифференцировочный
потенциал всех трех субпопуляций. CD90+CD45RA- и CD90-CD45RA- клетки формировали все типы миелоидных колоний. Из 180 cD90-cD45RA+ клеток всего 6 образовали колонии, что свидетельствует об ограниченном диф-ференцировочном потенциале этой популяции. Для оценки способности к пролиферации, одиночные клетки (п=20) из каждой популяции помещались в среду без сыворотки, с добавлением Flt-3, SCF, ТРО, ^-3, ^-6 и культивировались в течении 2-х недель, после чего подсчитывалось количество жизнеспособных клеток. CD90+CD45RA- клетки интенсивно пролиферировали (среднее количество образовавшихся клеток - 345000), CD90-CD45RA- клетки пролиферировали с меньшей скоростью (среднее количество образовавшихся клеток - 67500), и CD90-CD45RA+ клетки пролиферировали очень слабо с образованием всего нескольких живых клеток. Эти результаты позволяют предполагать, что CD90- субпопуляции клеток являются менее примитивными, по сравнению с CD90+ субпопуляциями.
Клетки каждой из популяций помещались в среду без сыворотки, с добавлением цитокинов и после 4-х дней культивирования анализировались на экспрессию CD90 и CD45RA. CD90+CD45RA- клеточная популяция давала
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 2, 2008
