CC BY
45
■■■ ■ I I I I I I I 4. I ■ ■ ИПТ1
Новости клеточных технологий
methylation state of the donor nucleus. Stem Cells 2006; 24; 2007-13. pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat.
6. Nakagawa M., Yoyanagi M., Tanabe K. et al. Generation of induced Biotechnol. 2008; 26: 101-106.
Подготовила B.C. Мелихова
По материалам: Huangfu D, Maehr R, Guo W. et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nature Biotechnology 2008; 26: 795-7
19
Эндотелиальные клетки-предшественницы костного мозга не участвуют в процессах опухолевого ангиогенеза и не являются необходимыми для роста злокачественных новообразований
Формирование кровеносных сосудов в первичных или вторичных [метастазах] новообразованиях является ключевым условием опухолевой прогрессии. Прежде всего это связано с обеспечением опухолевых клеток необходимыми для жизнедеятельности веществами, поступление которых из окружающих опухоль нормальных тканей весьма ограничено. Действительно, бессосудистые новообразования, обнаруживаемые как у человека, так и у животных, как правило, не превышают 1-2 мм в диаметре и их дальнейший рост ассоциируется с индукцией ангиогенеза («ангиогенное переключение»] [1].
В многочисленных исследованиях было показано, что опухолевые клетки могут секретировать значительные количества стимулирующих ангиогенез факторов роста, наибольшее значение из которых имеет сосудистый эндотелиальный фактор роста [vascular endolelial grows factor, VEGF] [2]. Секреция этих факторов злокачественными клетками может обеспечивать рост сосудов в опухоли путем ответвления из сосудов окружающих нормальных тканей. Кроме того, локальное и/или системное повышение концентрации VEGF может обусловливать миграцию в область опухолевого роста циркулирующих предшественников эндотелиоцитов [endothelial progenitor cells, EPCs] и формирование сосудов de novo внутри опухоли [1]. Какой из этих механизмов является ведущим? По крайней мере, при использовании некоторых видов экспериментальных моделей злокачественных новообразований у мышей была показана ключевая роль EPCs в инициации «ангиогенного переключения» [3-5]. Эти пилотные экспериментальные исследования послужили поводом для появления многочисленных идей о разработке новых методов лечения злокачественных новообразований путем фармакологического подавления физиологических функций EPCs и/или выхода EPCs из костного мозга [2].
Однако, результаты исследования P. Salven и соавт. из академии биологии рака [Финляндия], посвященного изучению миграции VEGF-2R+ EPCs и их роли в ангиогенезе, позволяют усомниться в существовании какой-либо роли EPCs в опухолевом ангиогенезе у взрослых животных.
Путем трансплантации клеток костного мозга от трансгенных мышей летально облученным нормальным реципиентам авторы создали три группы химерных мышей. В первой и второй группах клетки костного мозга экспрессировали флюоро-хром-содержащие белки GFP или DsRed.T3. В третьей группе химерных мышей в EPCs костного мозга экспрессировался ген
р-галактозидазы LacZ, находящийся под контролем специфичных для EPCs промоторов [VEGF-R2 или Тю-1 ]. После восстановления кроветворения у химерных мышей индуцировался ангиогенез путем подкожной инъекции аденовирусных векторов с геном VEGF или путем имплантации матригеля с VEGF. Опухолевый ангиогенез изучался при подкожной инъекции сингенных клеток меланомы В16 или при использовании в качестве реципиентов костного мозга мышей линии, характеризующейся высокой частотой спонтанного возникновения аденом (АРСтлп мыши]. Чтобы исключить вероятные артефакты, связанные с облучением и трансплантацией костного мозга, авторы также исследовали опухолевый ангиогенез у мышей-парабионтов, которые были получены путем наложения перекрестных сосудистых анастомозов между трансгенными GFP+ и молодыми АРСтлп мышами.
Проводимые исследования [в том числе конфокальное сканирование и построение 3D ортогональных проекций, а также перфузионное окрашивание лектином], целью которых являлось выявление меченых клеток в местах введения аденовирусов, в матригеле или опухолях, проводилось на 14 сут. после инъекций, трансплантаций клеток меланомы, костного мозга или наложения анастомозов. Кроме того, во всех экспериментальных сериях отдельные исследования выполнялись на сроки от 7 сут. до 6 мес. Мобилизация EPCs из костного мозга оценивалась методом проточной ци-тофлюорометрии.
Ни в одной из экспериментальных серий не было обнаружено увеличения концентрации VEGF-R2+ EPCs в крови, даже несмотря на то, что период максимально быстрого роста меланомы В16 [примерно на 14 сут.] сопровождался повышением общего количества клеток гемопоэтического ряда в крови.
Исследование тканей, в которые инъецировался аденовирус, матригеля и опухолей показало во всех случаях наличие выраженного ангиогенеза, причем нормальные и опухолевые ткани, матригель были сильно инфильтрированы клетками гемопоэтического ряда, имеющих костномозговое происхождение. Тем не менее, детальный анализ показал, что все меченые клетки имели стромальную или перивас-кулярную локализацию. Ни в одном случае среди клеток, выстилающих сосуды, не было обнаружено колокализации маркера, свидетельствующего о костномозговом происхождении клетки, и маркеров EPCs (VEGF-R2) или зрелых клеток эндотелия (CD105, vWF и CD31). В свою очередь, при
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 3, 2008
тттт
_
Новости клеточных технологий
[ж
перфузионном окрашивании лектином не было выявлено меченых эндотелиоцитов, связывающих лектин.
Таким образом, несмотря на использование методов исследования с высокой разрешающей способностью, не была подтверждена сколько-нибудь заметная роль VEGF-R2+ EPCs в целом ряде экспериментальных моделей ангиогенеза, и, что особенно важно, в опухолевом ангиогенезе. Авторы заключают, что по аналогии с трансдифференцировкой ГСК, диф-ференцировка в клетки эндотелия не является типичной функцией нормальных EPCs костного мозга и является очень редким событием, если вообще происходит.
Полученные результаты напрямую противоречат данным предыдущих исследований, в которых была обнаружена ключевая роль VEGFR2+ EPCs в опухолевом ангиогенезе [3-5], а также в ангиогенезе, индуцированном инъекцией аденовирусов с геном VEGF [6] или имплантацией матригеля с VEGF [4]. Однако, следует отметить, что у настоящей работы есть несколько отличительных преимуществ. Во-первых, в каждой экспериментальной серии анализировалось большое количество животных [не менее 40]. Во-вторых, во всех
случаях в качестве сравнения использовались как отрицательные, так и положительные контроли. В-третьих, авторы использовали разные метки ^Р, DsRed.T3 или галактози-дазу], выбор которых не повлиял на конечные результаты. Это имеет принципиальное значение, так как ранее было показано, что, например, GFP может оказывать значительное влияние на экспрессию некоторых генов EPCs и, таким образом, нарушать их функцию [7]. В-четвертых, использовались разные экспериментальные модели - как с облучением, так и без. В-пятых, авторы не использовали экспериментальную систему с подавлением активности фактора транскрипции в клетках костного мозга, на основе которой была получена основная масса результатов о ключевой роли EPCs в опухолевом ангиогенезе [3, 4]. Слабым местом этих работ является недооценка роли клеток гемопоэтичес-кого ряда, которые также экспрессируют [8]. Кроме того,
определенный вес исследованию придает участие в качестве соавтора директора института биологии стволовых клеток и регенеративной медицины Стэнфордского университета профессора I.Weissman.
Схема получения химерных мышей, использованных в эксперименте. После облучения мышам дикого типа трансплантировались клетки костного мозга от трансгенных мышей. В зависимости от выбранного промотора (промоторы генов р-актина, VEGF-R2 или Т'!е-1} у химер маркеры экспрессировались во всех клетках костного мозга или только в EPCs
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 3, 2008
■■■■I I I I III + I ■■ ТП
Новости клеточных технологий
ЛИТЕРАТУРА:
1. Bergers G., Benjamin L. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat. Rev. Cancer 2003; 3: 401-10.
2. Ellis L., Hicklin D. VEGF-targeted therapy: mechanisms of anti-tumour activity. Nat. Rev. Cancer 2008; 8: 579-91.
3. Gao D., Nolan D., Mellick A. et al. Endothelial progenitor cells control the angiogenic switch in mouse lung metastasis. Science 2008; 319: 195-8.
4. Lyden D., Hattori K., Dias S. et al. Impaired recruitment of bone-marrow-derived endothelial and hematopoietic precursor cells blocks tumor angiogenesis and growth. Nat. Med. 2001; 7: 1194-201.
5. Nolan D., Ciarrocchi A., Mellick A. et al. Bone marrow-derived endothelial progenitor cells are a major determinant of nascent tumor neovascularization. Genes Dev. 2007; 21: 1546-58.
6. Hattori K., Dias S., Heissig B. et al. Vascular endothelial growth factor and angiopoietin-1 stimulate postnatal hematopoiesis by recruitment of vasculogenic and hematopoietic stem cells. J. Exp. Med. 2001; 193: 1005-14.
7. Zhang F., Hackett N., Lam G. et al. Green fluorescent protein selectively induces HSP70-mediated up-regulation of COX-2 expression in endothelial cells. Blood 2003; 102: 2115-21.
8. Perry S., Zhao Y., Nie L. et al. Id1, but not Id3, directs long-term repopulating hematopoietic stem-cell maintenance. Blood 2007; 110 (7): 2351-60.
Подготовили: B.C. Сергеев, И.Л. Плакса По материалам: Purhonen S., Palm J., Rossi D. et al. Bone marrow-derived circulating endothelial precursors do not contribute to vascular endothelium and are not needed for tumor growth. PNAS 2008; 150: 6620-5
КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки в терапии острой РТПХ, резистентной к глюкокортикоидам: результаты II фазы клинических испытаний
Трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) - общепринятый метод терапии многих гематологических заболеваний [1, 2]. Одним из наиболее тяжелых осложнений данного метода является «реакция трансплантат против хозяина» (РТПХ). РТПХ обусловлена иммунной атакой тканей реципиента лимфоцитами донора. Для предотвращения РТПХ обычно применяются глюко-кортикоиды, результативность такой терапии составляет 30-50%. В остальных же случаях наблюдается острая резистентная к глюкокортикоидам РТПХ с неблагоприятным прогнозом [1, 3, 4].
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) костного мозга способны дифференцироваться в различные клетки мезенхимного происхождения, преимущественно в остеоциты, хондроциты и адипоциты [5]. ММСК необходимы для поддержания пролиферации и дифференци-ровки ГСК в костном мозге [6]. Естественное взаимодействие этих двух популяций навело на идею о том, что котрансп-лантация ГСК и ММСК должна быть по многим параметрам более эффективна, чем трансплантация только ГСК. В экспериментах на животных было показано, что при котран-сплантации ГСК и ММСК приживаемость трансплантата существенно повышается, не происходит реакции отторжения трансплантата или она менее выражена [6].
В экспериментах по ^культивированию ММСК с алло-генными лимфоцитами in vitro было показано, что ММСК не индуцируют их пролиферацию, секрецию IFN-у и продукцию провоспалительных цитокинов [7, 8]. Иммуномодулирующие свойства ММСК были продемонстрированы в экспериментах in vivo: показано, что внутривенные инъекции HLA-несовместимых ММСК увеличивают время жизни аллогенных кожных трансплантатов [9]. В то же время, в недавнем пилотном клиническом исследовании котрансплантации ММСК и ГСК, проведенном группой H. Ning было показано, что ММСК снижают риск развития и остроту РТПХ, но,
возможно, за счет своих иммуномодулирующих/иммуно-супрессивных свойств могут повышать вероятность рецидива основного заболевания [10].
В журнале Lancet была опубликована работа группы исследователей под руководством K. Le Blanc посвященная результатам II фазы мультицентровых клинических испытаний, в которых трансплантация аллогенных ММСК была проведена 55 пациентам с тяжелой резистентной к глюкокортикоидам РТПХ, развившейся после трансплантации ГСК (48 пациентов) либо аллогенных лимфоцитов (7 пациентов). У большинства пациентов наблюдалась РТПХ III и IV стадии с вовлечением в патологический процесс двух или трех органов. У 45 пациентов операции выполнены по поводу онкогематологических, а у 10 - незлокачественных гематологических заболеваний. Все пациенты проходили стандартные курсы терапии. В качестве профилактики РТПХ применялся циклоспорин в комбинации с метотрексатом либо микофенолат с мофетилом. Пяти пациентам, получившим трансплантации ГСК пуповинной крови, циклоспорин назначался в комбинации с преднизолоном. Ни один из пациентов из исследуемой группы не реагировал на иммуно-супрессивную терапию в течение семи или более дней.
Полным клиническим ответом на терапию ММСК считалось полное исчезновение симптомов РТПХ, частичным ответом - улучшение состояния пациента по крайней мере на одну степень РТПХ, стабильным считалось состояние без изменений, а прогрессией - ухудшение состояния пациента и дальнейшее прогрессирование РТПХ. ММСК для клеточной терапии были получены от HLA-совместимых, гаплоидентичных либо HLA-несовместимых доноров. Фенотип ММСК определялся как CD73+/CD90+/Cd105+/ CD34-/CD45-/CD14-/CD3-. Количество трансплантируемых клеток варьировало от 0,6 до 9x106 клеток на кг веса пациента. Для трансплантации использовались клетки 2, 3 и 4 пассажей.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 3, 2008
