Эндотелиальная и иммунная дисфункция в раннем периоперационном периоде у пациентов с травмой нижних конечностей Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 616.728-001-089.168.1-089.5 С.П. Крыжановский1, Т.С. Запорожец2

1 Медицинское объединение Дальневосточного отделения РАН (690022 г. Владивосток, ул. Кирова, 95),

2 НИИ эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения РАМН (690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1)

ЭНДОТЕЛИАЛЬНАЯ И ИММУННАЯ ДИСФУНКЦИЯ В РАННЕМ ПЕРИОПЕРАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ У ПАЦИЕНТОВ С ТРАВМОЙ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ

Ключевые слова: послеоперационная боль, эндотелий, молекулы адгезии и активационные антигены, лимфоциты.

Исследованы роль и адекватность анальгезии в развитии эндотелиальной и иммунной дисфункции в периопераци-онном периоде у 20 пациентов 40—60 лет с тяжелой травмой нижних конечностей. Установлено, что к моменту выполнения хирургической операции на фоне дисфункции эндотелия и иммунной системы активационного типа наблюдались расстройства клеточных и гуморальных факторов врожденного и адаптивного иммунитета депрессивной направленности. Отсутствие значимых различий показателей, характеризующих состояние иммунной системы и эндотелия в динамике раннего периоперационного периода, свидетельствовало об адекватности обезболивания. Использованный метод анестезии, включающий комбинированное применение анальгетика периферического действия (кето-профен) в сочетании с опиоидами (промедол), обеспечивал поддержание послеоперационного гомеостаза и позволял сохранить баланс про- и противоспалительных потенций иммунокомпетентных клеток, предотвращая развернутый стресс-ответ на хирургическое вмешательство.

Несмотря на разработку и совершенствование средств медикаментозной и немедикаментозной анальгезии проблема послеоперационной боли продолжает занимать важное место в современной медицине и является предметом широкомасштабного мультидисципли-нарного исследования. Послеоперационная боль служит мощнейшим фактором, индуцирующим развитие хирургического стресс-ответа, который представляет собой совокупность эндокринных, метаболических и воспалительных процессов, развивающихся в ответ на хирургическую травму и боль и ведущих к нарушениям деятельности жизненно важных функциональных систем [1, 3, 6]. Центральная роль в процессе развития и поддержания этих реакций отводится эндотелиальной и иммунной дисфункции. К настоящему времени разработана концепции сбалансированной анальгезии, основанная на сочетанном применении препаратов, действующих на разные участки передачи боли и позволяющая снизить ее интенсивность в раннем периоперационном периоде [1, 2]. Методика сбалансированной анальгезии показана при обширных хирургических вмешательствах [3, 5].

Целью настоящей работы было исследование роли и адекватности анальгезии в развитии эндотелиальной и иммунной дисфункции в периоперацион-ном периоде у пациентов с тяжелой травмой нижних конечностей.

Материал и методы. В исследование были включены 20 пациентов от 40 до 60 лет, которые подвер-

Крыжановский Сергей Петрович — канд. мед. наук, главный врач Медицинского объединения ДВО РАН; тел.: 8 (4232) 31-09-10; e-mail: [email protected].

гались хирургическому вмешательству по поводу тяжелой травмы нижних конечностей. Тяжесть травмы по RTS (Revised Trauma Score) у всех пациентов составила 6,75±0,4 балла. В структуре повреждений преобладала травма бедра (17 случаев). Всем пациентам проводили комбинированную эндотрахеальную общую анестезию, по окончании операции назначали опиоиды и нестероидные противовоспалительные препараты (промедол 60 мг/сутки, кетопрофен 300 мг/сутки). Периферическую венозную кровь забирали в гепаринизированные стерильные пробирки до операции (1-я группа), после операции (2-я группа) и через 40 минут после обезболивания (3-я группа), центрифугировали при 3000 об./мин. Плазму декантировали в полипропиленовые пробирки и хранили при —80°С. Группа контроля (4-я) состояла из 20 здоровых доноров в возрасте 40—60 лет.

Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови и исследование концентрации растворимых молекул адгезии проводили методом проточной цитометрии (цитофлуориметр FACSсan, Becton Dickinson) с использованием моноклональных антител к кластерам дифференцировки (Claster of Differentiation — CD) с двойной меткой: CD3-FITC/ CD4-PE, CD3-FITC/ CD8-PE, CD3-FITC/CD56+16-PE, CD3-FITC/CD19-PE (Becton Dickinson, США), CD3-FITC/CD25-PE, CD3-FITC/CD95-PE, CD3-FITC/HLA-DR-PE (Bekman Coulter, Франция), а также моноклональных антител к молекулам адгезии: sICAM-1, sICAM-3, sVCAM-1, sPECAM-1, sE-selectin, sP-selectin (Bender Medsystems).

Статистический анализ полученных результатов проводился на основе прикладного пакета Statistica 6. Использовались следующие методы: проверка нормальности распределения количественных признаков при малом числе наблюдений с использованием Shapiro—Wilk, основанная на регрессии порядковых статистик. Межгрупповые различия показателей проводили при помощи однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Для сравнения уровня молекул адгезии в сыворотках крови больных и здоровых доноров использовали непараметрический критерий Mann—Whitney и t-критерий Стьюдента (для двух не связанных между собой вариационных рядов), двусторонние доверительные интервалы. Наличие связей между показателями определяли, используя коэффициент корреляции Пирсона (r).

Результаты исследования. При оценке параметров нормирования значений уровня раство-

римых молеул адгезии, а также показателей иммунного статуса было обнаружено, что показатели, характеризующие концентрацию sE-selectin, sICAM-3, sPECAM-1 и sVCAM-1, а также содержание CD3+CD16+CD56+-лимфоцитов и HLA-DR+-лимфоцитов, имели гауссово распределение. Для sР-selectin, sICAM-1 наблюдалось отклонение от нормального распределения.

Установлено, что концентрация молекул межклеточной адгезии в сыворотке крови пациентов, измеренная перед операцией, значимо превышала норму, отражая процессы активации эндотелия в ответ на травматические повреждения нижних конечностей. Динамика показателей в послеоперационном периоде не имела значимых различий в содержании молекул адгезии сразу после операции и через 40 мин

после обезболивания: уровень sE-selectin, sICAM-3, sPECAM-1 и sVCAM-1, sР-selectin и sICAM-1 оставался повышенным по сравнению с таковым у здоровых (табл. 1).

При анализе иммунологических показателей было установлено снижение относительного содержания лимфоцитов с CD3+CD19- и с CD4+ и увеличение относительного содержания NK-клеток (CD3-CD16+CD56+). В послеоперационном периоде изменения клеточного иммунитета сохранялись, показатели значимо отличались от таковых у здоровых доноров. В эти же сроки регистрировалось увеличение HLA-DR+-лимфоцитов (табл. 2). В то же время однофакторный дисперсионный анализ не выявил межгрупповых различий показателей в динамике обследования.

Таблица 1

Концентрация растворимых молекул адгезии в сыворотках крови пациентов с тяжелой травмой нижних конечностей

в раннем периоперационном периоде

Молекулы адгезии, нг/мл Группа W1 М±ст Ме2 LQ-UQ3 Т Чез! и4 ANOVA

группы сравнения Р Р F Р

вРЕСЛМ-1 1 0,88495 223,9+155,9 - - 1-4 0,0322 - 0,022 0,978

2 0,90715 213,6+105,1 - - 2-4 0,0071 -

3 0,97225 216,0+102,2 - - 3-4 0,0052 -

4 0,94225 118,8+35,3 - - - - - - -

8ІСЛМ-3 1 0,97695 196,6+91,7 - - 1-4 0,0000 - 0,468 0,630

2 0,91615 204,2+70,7 - - 2-4 0,0000 -

3 0,89485 199,9+60,4 - - 3-4 0,0000 -

4 0,89295 66,6+6,6 - - - - - - -

вЕ-веІеСїп 1 0,97275 150,2+80,0 - - 1-4 0,0000 - 0,029 0,972

2 0,95845 150,5+80,4 - - 2-4 0,0000 -

3 0,93895 158,3+90,7 - - 3-4 0,0000 -

4 0,88345 32,6+8,2 - - - - - - -

БІСЛМ-1 1 0,8083 - 514 471-529 1-4 - 0,0000 0,836 0,446

2 0,8687 - 576 7 3 7 7 6 4 2-4 - 0,0000

3 0,8186 - 560 449-700 3-4 - 0,0000

4 0,8316 - 248 5 7 2 6 0 2 - - - - -

вР-БеІеСІШ 1 0,8383 - 506 8 4 6 3 9 1-4 - 0,0000 0,025 0,975

2 0,8240 - 402 233-565 2-4 - 0,0000

3 0,8765 - 471 5 0 6 2 4 2 3-4 - 0,0000

4 0,8681 - 137 8 6 О 2 - - - - -

¥СЛМ-1 1 0,94775 1010,8+461,2 - - - 0,0004 - 1,276 0,291

2 0,91775 1129,2+299,4 - - - 0,0000 -

3 0,96845 1274,4+480,1 - - - 0,0000 -

4 0,90735 483,6+196,6 - - - - - - -

1 Критерий Shapiro—Wilk.

2 Медиана.

3 Интерквантильный размах (25—75%).

4 Критерий Mann—Whitney.

5 р>0,05 — уровень значимости, соответствующий данному критерию W (при р<0,05 параметр имеет отклонение от нормального распределения).

Таблица 2

Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови пациентов с тяжелой травмой нижних конечностей в раннем

периоперационном периоде

Субпопуляция лимфоцитов Группа W1 Кол-во лимфоцитов, М±ст T-test лмот

% абс. в мкл группы сравнения Р F Р

СБ3+СБ19- 1 0,8887 70,4±4,2 1295+225 1-4 0,0130 1,043 0,364

2 0,9226 69,6±5,5 899+157 2-4 0,0066

3 0,8971 67,4±5,9 891+146 3-4 0,0061

4 0,9422 73,3±5,4 1480+113 - - - -

СБ3+СБ4+ 1 0,8816 41,8±6,2 769+116 1-4 0,0097 0,094 0,911

2 0,8975 42,8±6,0 556+78 2-4 0,0040

3 0,9295 43,3±8,4 573+112 3-4 0,0023

4 0,9596 46,1±4,1 931+84 - - - -

СБ3+СБ8+ 1 0,9683 23,6±5,2 434+96 1-4 0,4274 0,390 0,680

2 0,9535 21,9±5,5 284+71 2-4 0,1007

3 0,9754 22,4±5,3 296+70 3-4 0,1473

4 0,9544 25,1±5,6 507+112 - - - -

СБ3СБ19+ 1 0,8799 11,9±3,4 219+63 1-4 0,4890 2,576 0,089

2 0,9179 11,1±3,4 144+44 2-4 0,1827

3 0,8826 13,7±4,5 181+61 3-4 0,450

4 0,9622 12,6±3,3 255+67 - - - -

СБ3-СВ16+СБ56+ 1 0,9095 17,1±5,7 326+108 1-4 0,0018 0,076 0,927

2 0,9365 16,2±7,4 210+95 2-4 0,0135

3 0,9021 16,0±6,9 211+81 3-4 0,0134

4 0,9637 10,4±4,9 204+74 - - - -

СБ25+ 1 0,9036 16,9±4,7 310+91 1-4 0,0000 0,348 0,708

2 0,9246 18,4±5,0 239+66 2-4 0,0000

3 0,9513 18,4±5,6 243+76 3-4 0,0000

4 0,9580 10,6±2,4 214+49 - - - -

СБ3+СБ25+ 1 0,8888 12,3±4,2 226+78 1-4 0,0000 0,278 0,759

2 0,8862 12,8±4,2 166+55 2-4 0,0000

3 0,9451 13,7±5,8 181+65 3-4 0,0000

4 0,8948 6,9±1,9 139+38 - - - -

СБ95+ 1 0,9561 35,8+11,6 659+212 1-4 0,0000 1,344 0,277

2 0,9937 41,7±6,3 541+81 2-4 0,0000

3 0,9737 40,6+9,5 537+124 3-4 0,0000

4 0,9441 21,2+7,8 428+158 - - - -

НЬЛ-БР+ 1 0,9144 18,1+3,9 333+71 1-4 0,0572 1,548 0,255

2 0,8873 18,7+4,9 243+464 2-4 0,0269

3 0,9385 21,2+5,8 280+76 3-4 0,0001

4 0,9619 16,0+3,5 323+70 - - - -

ИРИ2 1 0,9624 1,8+0,6 - 1-4 0,3920 0,648 0,549

2 0,8902 2,0+0,9 - 2-4 0,8910

3 0,9284 2,2+0,9 - 3-4 0,5304

4 0,9168 1,9+0,5 - - - - -

Лейкоциты, кл./мкл 1 0,8856 7133+1173 - 1-4 0,0179 0,025 0,975

2 0,8910 7214+1016 - 2-4 0,0043

3 0,9306 7116+1189 - 3-4 0,0203

4 0,9580 6169+1157 - - - - -

Лимфоциты, % 1 0,9055 25,8+9,2 - 1-4 0,0071 2,560 0,094

2 0,9461 18,0+8,4 - 2-4 0,0000

3 0,9747 18,6+8,7 - 3-4 0,0000

4 0,9769 32,6+5,6 - - - - -

1 Критерий Shapiro—Wilk. Для всех значений критерия W — р>0,05 (параметры имеют нормальное распределение).

2 Иммунорегуляторный индекс: CD4+/CD8+.

Таблица 3

Показатели врожденного и адаптивного иммунитета у пациентов с тяжелой травмой нижних конечностей в раннем периоперационном периоде

Группа Т-test ANOVA

Показатель W1 М±ст группы сравнения Р F Р

1 0,9607 74,1±9,0 1-4 0,0002

Фагоцитарный 2 0,8868 66,1+11,3 2-4 0,0000 1,902 0,163

показатель, % 3 0,8889 64,5+11,8 3-4 0,0000

4 0,9497 81,2+5,2 - - - -

1 0,9471 2,9+0,9 1-4 0,0000

Фагоцитарное 2 0,9204 2,6 +1,2 2-4 0,0000 0,777 0,467

число 3 0,9238 2,5+1,1 3-4 0,0000

4 0,8992 4,5+0,5 - - - -

1 0,9337 8,4+3,5 1-4 0,0055

G 2 0,9540 8,7+2,9 2-4 0,0092 0,136 0,873

Иммуноглобулины, г/л 3 0,9540 9,2+3,8 3-4 0, 0500

4 0,9572 10,9+1,9 - - - -

1 0,8890 0,9+0,2 1-4 0,0010

М 2 0,8988 0,9+0,2 2-4 0,0010 0,040 0,961

3 0,8917 0,9+0,3 3-4 0,0026

4 0,9219 1,5+0,4 - - - -

1 0,8856 1,0+0,5 1-4 0,0006

А 2 0,8910 1,0+0,5 2-4 0,0006 0,221 0,803

3 0,9306 1,1+0,5 3-3 0,0022

4 0,9580 2,0+0,7 - - - -

1 Критерий Shapiro—Wilk. Для всех значений критерия W — р>0,05 (параметры имеют нормальное распределение).

Увеличение содержания NK-клеток могло быть обусловлено стимулирующим действием фактора некроза опухоли-а и интерлейкина-12, продукция которых увеличивается при развитии воспалительной реакции в ответ на повреждение тканей при травме. Вместе с тем активность NK-клеток как инициирующего фактора неспецифической защиты в экстремальных условиях периоперационного периода оказывается недостаточной: при анализе состояния врожденного иммунитета было выявлено снижение фагоцитарной активности нейтрофилов. Концентрация иммуноглобулинов G, А и М также была снижена (табл. 3).

Перед операцией наблюдалось усиление экспрессии рецептора к интерлейкину-2 (CD25) и проапото-тического антигена CD95/Fas на лимфоцитах, и в том числе на Т-лимфоцитах (табл. 2).

Корреляционный анализ выявил тесную отрицательную связь между выраженностью экспрессии CD95/Fas-антигена на лимфоцитах и абсолютным количеством лимфоцитов (рис.).

Обсуждение полученных данных. Воспаление является универсальным механизмом, обеспечивающим репарацию и санацию тканей в очаге травматического повреждения. В то же время избыточный воспалительный ответ может привести к вторичному повреждению тканей, опосредованному выделением цитокинов, молекул адгезии и других медиаторов. Операционный

стресс, сопровождающийся дополнительным обширным повреждением тканей и генерацией большого количества входящих ноцицептивных импульсов, усугубляет нарушения иммунной и эндотелиальной систем, вызванные травмой. Важнейшим фактором, индуцирующим развитие хирургического стресс-ответа, является послеоперационная боль. В этой связи одним из условий послеоперационной реабилитации становится адекватная послеоперационная анальгезия [4, 7].

Выполненные нами исследования показали, что у пациентов с тяжелой травмой нижних конечностей к моменту выполнения хирургической операции на фоне дисфункции эндотелия и иммунной системы активационного типа наблюдаются расстройства клеточных и гуморальных факторов врожденного и адаптивного иммунитета депрессивной направленности. В сыворотке крови перед операцией регистрировались повышенные уровни растворимых молекул адгезии. При этом изменения касались как селекти-нов, принимающих участие в каскаде адгезии на этапе атаки и активации, так и молекул межклеточной адгезии 1-го типа (1САМ-1), 3-го типа (1САМ-3) и молекул адгезии сосудистого эндотелия 1-го типа (¥САМ-1), реализующих свой потенциал на этапе прикрепления и трансэндотелиальной миграции лейкоцитов. Дисфункция иммунной системы подтверждалась усилением экспрессии активационных

CD95+

Лимфоциты

22

26 28 32 36 40 Var. 1

- Уровень доверительной вероятности (95%)

Рис. Корреляционная связь между экспрессией СБ95^ав на мембранах лимфоцитов и количеством лимфоцитов в периферической крови больных с тяжелой травмой нижних конечностей.

антигенов (CD25, CD95/Fas) на лимфоцитах, сопряженной со снижением относительного содержания CD3+- и CD4+-клеток. Поскольку наличие на клеточной поверхности рецепторов CD95(Fas/APO-1) определяет готовность клетки к Fas-индуцирован-ному апоптозу при контакте с Fas-лигандом, отрицательная корреляционная связь между выраженностью экспрессии CD95/Fas-антигена на лимфоцитах и их абсолютным количеством свидетельствует в пользу участия системы CD95/Fas/Fas-лиганд в усилении активационного апоптоза лимфоцитов больных с тяжелой травмой нижних конечностей в периоперационном периоде.

Снижение фагоцитарной активности нейтро-филов и концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови отражало состояние недостаточности клеточных и гуморальных факторов врожденного и адаптивного иммунитета, регистрировавшееся перед операцией. Отсутствие значимых различий показателей, характеризующих состояние иммунной системы и эндотелия в динамике раннего периопе-рационного периода, свидетельствует об адекватности обезболивания. Использованный метод анестезии, включающий комбинированное применение анальгетика периферического действия (кетопро-фен) в сочетании с опиоидами (промедол), обеспечивал поддержание послеоперационного гомеостаза и позволял сохранить баланс про- и противовоспалительных потенций иммунокомпетентных клеток, предотвращая развернутый стресс-ответ на хирургическое вмешательство. В то же время снижение клеточных и гуморальных факторов врожденного и адаптивного иммунитета, регистрируемое в перио-перационном периоде, диктует необходимость использования иммунокорректоров уже на этапе предоперационной подготовки.

Литература

1. Бутров А.В., Борисов А.Ю. Современные подходы к фармакотерапии послеоперационной боли с применением синтетических опиоидов и ненаркотических анальгетиков // Русский мед. журнал. 2004. № 24. С. 1434—1437.

2. Горобец Е.С. Подходы к современному послеоперационному обезболиванию //Хирургия. 2007. № 1. C. 26—31.

3. Овечкин А.М. Послеоперационный болевой синдром: клинико-патофизиологическое значение и перспективные направления терапии // Consilium. Medicum. 2005. Т. 7, № 6. С. 486-490.

4. Овечкин А.М., Гнездилов А.Д., Морозов Д.В. Лечение и профилактика послеоперационной боли. Мировой опыт и перспективы // Боль и ее лечение. URL: http://www.painstudy. ru/matls/review/posleoper.htm (дата обращения 02.03.2009).

5. Liu S., Carpenter L., Mackey D. Effects of perioperative analgesic technique on rate of recovery after colon surgery // Anesthesiology. 1995. Vol. 83. P. 757-765.

6. Postoperative Pain Management — Good Clinical Practice // General recommendations and principles for successful pain management. Produced with the consultations with the Europeans Society of Regional Anaesthesia and Pain Therapy / project chairman N. Rawal, 2005. 57p.

7. Wheatley R., Schug S., Watson D. Safety and efficacy of postoperative epidural analgesia. // Brit. J. Anaesth. 2001. Vol. 87. P. 47—61.

Поступила в редакцию 27.03.2009.

ENDOTHELIAL AND IMMUNE DYSFUNCTIONS DURING EARLY PERI-OPERATIVE PERIOD IN PATIENTS WITH LOWER LIMB INJURIES

S.P. Kryizhanovskiy1, T.S. Zaporozhets2 1 Medical Society, FEB RAS (95Kirov St. Vladivostok 690022 Russia), 2 Research Centre of Epidemiology and Microbiology of the RAMS, Siberian Branch (1 Selskaya St. Vladivostok 690087 Russia)

Summary — The authors have studied adequacy and role of analgesia in developing endothelial and immune dysfunctions during the early peri-operative period with respect to 20 patients aged 40 to 60 with serious lower limb injuries. As shown, there were cellular and humoral dysfunctions of innate and adaptive immunity in the form of depression. These were observed by the moment of surgical treatment at the background of endothelial dysfunction. Lacking significant differences in the parameters indicating the state of immune system and endothelium in the dynamics of the early peri-operative period were indicative of an adequate character of anaesthesia. The analgesic of peripheral action (ke-toprofen) was combined with opioids (promedol) and allowed to maintain postoperative homeostasis and balance between pro-and anti-inflammatory potentials of immunocompetent cells, thus preventing extended stress response to the surgery.

Key words: postoperative pain, endothelium, adhesion molecules and activation antigens, lymphocytes.

Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 118—122.