CC BY
83
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕВМАТОЛОГИЯ № 4, 2002
УДК: 616.72.002.77-058
ХАРАКТЕРИСТИКА СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ И АКТИВАЦИОННЫХ ПРОЦЕССОВ В ИММУННОЙ СИСТЕМЕ БОЛЬНЫХ РАННИМ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ
Г.В. Порядип, Л.Ю. Семенова, А.Н. Кашмирский, H.A. Шоспшк, Т.К. Логинова, Ж.М. Салмаси, А.Ю. Потанин Кафедра факультетской терапии им. акад. А.И. Нестерова, кафедра патофизиологии, РГМУ, Москва
Резюме.
Цель. Определить иммунный профиль больных ранним ревматоидным артритом (РА) и провести клинико-иммунологические сопоставления.
Материалы и методы. Обследовано 14 пациентов с достоверным диагнозом раннего РА. В периферической крови больных определяли содержание лимфоцитов, экспрессирующих антигены CD3, CD4, CDS. CD16, CD56, CD20, CD72, CD38, CD23, CD25, CD71, HLA-DR, CD95, CD22, CD54, mlgM, mlgG. Оценены клинико-иммунологические параллели.
Результаты. У больных ранним РА выявлено угнетение Т-клеточного звена иммунной системы, проявляющееся снижением в периферической крови общего содержания Т-лимфоцитов и появлением незрелых Т-клеток с фенотипом CD3*4*8* в сочетании с выраженной активацией В-клеточного звена иммунной системы; отмечена корреляция между некоторыми клиническими и иммунологическими показателями.
Ключевые слова: ревматоидный аптрит. субпопуляшги лимФоиитов.
Ревматоидный артрит (РА) является хроническим системным воспалительным заболеванием с прогрессирующим поражением суставов по типу эрозивно-деструктивного полиартрита [6,11]. Относительно широкая распространенность РА. особенно среди лиц трудоспособного возраста, неуклонное прогрессирование заболевания, значительная инвалидизация больных определяют необходимость изучения его иммунопатогепетических характеристик. Ведущим патоморфологическим проявлением РА является синовит с вторичным поражением суставного хряща, субхондральной кости и периартикулярных образований [1,11,12,13].
РА - одно из наиболее частых аутоиммунных ревматических заболеваний, в патогенезе которого преобладает иммунокомплексный механизм поражения. В основе РА лежат сложные нарушения иммунного ответа, следствием которых является развитие самоподдерживающе-гося хронического воспаления.
Установлено, что именно ранний, начальный период РА играет решающую роль в развитии и дальнейшем прогрессировании патологического процесса. В этот период течение РА особенно агрессивно, но обратимость развивающихся нарушений существенно выше, т.к. еще не окончательно сложились основные аутоиммунные механизмы болезни [11,12,13,14].
Согласно последним данным, заболевание характеризуется выраженным активационным процессом в лимфоцитах периферической крови и синовиальной жидкости [14]. При этом в периферической крови больных обнаруживается активация ТЬ2 лимфоцитов, а в синовиальной жидкости преобладает активация ТЫ лимфоцитов [5,15,16]. Поражение суставов обусловлено действием активированных Т-лимфоцитов [17,18,19,20,22,23], а интенсивный синтез антител в периферической крови, ведущий к образованию иммунных комплексов, вызван В-клеточ-
А дрес для переписки:
Г. В. Порядии.
Адрес: 117869, г. Москва, ул. Островитянова, д.!. Российский государственный медицинский университет.
ной активацией [10,11,14,15,16]. Таким образом, РА представляет собой сложное заболевание, при обострении которого наблюдается одновременно два вида активации им-мунокомпетеитных клеток - Т-лимфоцитов в очаге поражения и В-лимфоцитов в периферической крови.
В ранее проведенных исследованиях нет единого мнения о характере изменений в содержании Т-клеток, Вместе с тем имеются однородные данные в отношении В-клеток: многие исследователи обнаруживают повышение содержания В-лимфоцитов [2,8,10,21]. Предполагают, что в основе развития РА (по крайней мере, ранней стадии) лежит активация Т-лимфоцитов по ТЫ-типу, а прогрессирование заболевания определяется нарушением равновесия между синтезом провоспалительных и антивос-палительных цитокинов [5,22]. Установлено, что развитие РА связано с гиперпродукцией медиаторов ответа острой фазы. Цитокиновый статус больных РА характеризуется повышенной продукцией ФНОа, ИЛ-1, ИЛ-6 и ИЛ-8 при сниженной продукции ИЛ-2, ИЛ-4 и ИФН-у [2,4,5,6,22]. Показано, что В-клеточная активация иммунной системы зависит от продукции множества регуляторных цитокинов [2,3,10].
Цель исследования состояла в определении популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов больных РА и проведении клинико-иммунологических параллелей.
Материалы и методы.
Обследовано 14 пациентов ранним РА (длительность болезни от 3-х до 12 мес), 12 женщин и 2 мужчин в возрасте от 40 до 68 лет, средний возраст 54 года. У 10 пациентов длительность заболевания была до 6 мес, у остальных до 12 мес. Диагноз РА ставился на основании критериев Американской Ревматологической Ассоциации с учетом признаков, наиболее характерных для ранней стадии РА.
У 12 больных диагностирована преимущественно суставная форма РА, у 2 - имелись различные системные проявления (лихорадка, ревматоидные узлы, потеря массы тела, гипотрофия мышц).
ХАРАКТЕРИСТИКА СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ И АКТИВАЦИОННЫХ ПРОЦЕССОВ В ИММУННОЙ СИСТЕМЕ БОЛЬНЫХ РАННИМ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ.
Г.В. Порядин, Л.Ю. Семенова, А.Н. Казимирский, H.A. Шостак, Т.К. Логинова, Ж.М. Салмаси, А.Ю. Потанин. 23
Минимальная, 1-ая степень активности РА была у 2 пациентов, 2-ая - у 11, 3-я - у I. Рентгенологическая стадия поражения суставов по Steinbrocker: 1-9, II - 5 чел. Функциональная недостаточность суставов I степени отмечена у 8, II - у 6 больных. Ревматоидный фактор (РФ) выявлен у 8; 6 пациентов были серонегативными.
Контрольную группу составили 19 практически здоровых лиц, сопоставимых с больными по возрасту и полу.
Для иммунологического исследования кровь забирали из локтевой вены натощак в утренние часы и стабилизировали раствором ЫаЭДТА, Выделение взвеси лимфоцитов проводили в градиенте плотности фиколл-верог-рафин по методу A.Boyum. Методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител серий ИКО и ЛТ (Россия) определяли содержание в периферической крови лимфоцитов, экспрессирующих антигены CD3, CD4, CDS, CD 16. CD56, CD20, CD72, CD38, CD23, CD25, CD71, HLA-DR, CD95, CD22, CD54. mlgM, mlgG. Результаты обработаны на компьютере методом вариационной статистики с помощью пакета прикладных программ Slalistica, достоверность различий оценивали по критерию Стыодента.
Результаты и обсуждение.
При анализе популяций лимфоцитов крови у больных ранним РА было выявлено достоверное снижение от-
'Габлнца 1
Содержание основных популяций и субпопуляций лимфоцитов в периферической крови больных ранним РА (в %).
Оцениваемый Больные ранним РА Здоровые
показатель п= 14 п=19
CD3 43,94±2,24 65,96±1,04
CD4 31,76±2,52 37,11+1,67
CD8 21.9Ш.81 26,22±0.87
CD16 16,29±2,01 13,8010,91
CD56 14,5312,05 4,4310,31
CD20 14,74+0,85 10,10Ю,40
Таблица 2
Содержание субпопуляций В-лимфоцитов в периферической крови больных ранним РА (в %).
Оцениваемый показатель Больные ранннм РА п=14 Здоровые п=19
CD22 10,6312,13 11,0410,63
CD23 12,4311,97 5,24Ю,56
CD38 14.7212,36 7,4510,61
CD72 13,1011,43 10,4010.63
mlgM 11,3111,15 5.25Ю.43
mlgG 7,9711,05 6,2111,23
носительного содержания Т-лимфоцитов (CD3) по сравнению с донорами (р<0,001). Содержание хелперно-ин-дукторных Т-клеток (CD4) у обследованных больных проявляло тенденцию к снижению, а количество цитотокси-ческих Т-лимфоцитов (CD8) было достоверно ниже, чем у здоровых доноров (р<0,05) (табл. I).
Значительная Т-лимфоцитопенпя сопровождалась появлением большого количества лимфоцитов с феноти-
пом СОЗ*4*8\ называемых также дважды позитивными Т-лимфоцитами. Если у здоровых доноров содержание «дважды позитивных» Т-лимфоцитов по данным литературы не превышает 2-3% [9]. то у больных ранним РА оно составило в среднем 8,76±4,13% (р<0,01).
Содержание субпопуляцин естественных киллеров (С016) в периферической крови больных РА и здоровых людей существенно не различалось. В то же время количество естественных киллеров, реализующих свою цито-токсическую функцию (С056), у больных было значительно повышено по сравнению с контролем (р<0,01).
Относительное содержание В-лимфоцитов (С020) в периферической крови больных было достоверно выше, чем у здоровых людей (р<0,005). Это связано, в первую очередь, с увеличением в крови дифференцированных В-лимфоцитов.
Отмечено достоверное повышение содержания в крови В-лимфоцитов, экспрессирующих т^М, а также повышение в 2 раза количества плазматических клеток (С038*), завершающих процесс дифференциации В-лим-фоцитов (табл. 2).
Кроме того, у больных ранним РА было выявлена тенденция к увеличению числа В-клеток, примированных антигеном (С072), по сравнению с показателями здоровых доноров. В то же время количество В-лимфоцитов, экспрессирующих маркер С022, ответственный за транс-дукцню сигнала от иммуноглобулиновых рецепторов, у больных РА практически не отличалось от уровня здоровых доноров.
Наиболее выраженным изменением поверхностного фенотипа В-лимфоцитов у больных ранннм РА было увеличение более чем в 2 раза содержания активированных В-лимфоцитов, экспрессирующих маркер С023, который представляет собой ннзкоаффпнный рецептор для 1£Б, и его экспрессия является ранннм признаком активации В-лимфоцитов. Высокое содержание С023*-лимфоци-тов в крови больных ранним РА отражает выраженную активацию В-клеточного звена иммунной системы.
Следует отметить высокую степень корреляции между клинической и иммунологической активностью при раннем РА. Так, у 10 из 14 больных наблюдалась значительная клиническая активность (множественные поражения суставов с выраженными экссудативными явлениями, скованность более 30 мин), при этом отмечался высокий уровень РФ (до 1:1280) и СЭ23 (до 22,4%).
У двух пациентов этой группы имелись также системные проявлеши РА.
Приводим клиническое наблюдение.
Больная А-ва. 43 лет. поступила в ревматологическое отделение 1ГКБ 03.01.01 с жалобами на боли в коленных, лучезапястных, мелких суставах кистей и стоп, скованность более 3-х часов, повышение температуры тела до 37,3'С с ознобом, слабость, нарушение сна. Больна с июня 2000 г, когда появились артралгии кистей и стоп. В августе боль в этих суставах усилилась, появилась припухлость. Диагностирован РА. В стационаре начата терапия метотрексатом 7,5 мг/иед, преднизолоном 15 мг/сут. Состояние улучшилось, но с ноября 2000 г усилилась скованность, появился субфебрилитет. Госпитализирована повторно.
При поступлении состояние средней тяжести, температура тела 37,5°С.
Пониженного питания (рост-167 см, вес 59 кг). Кожа и видимые слизистые умеренно бледные, чистые. Пальпируются увеличенные подмышечные лимфоузлы. В
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ
РЕВМАТОЛОГИЯ
№ 4, 2002
легких дыхание везикулярное, хрипы не выслушиваются. Тоны сердца приглушены, ритм правильный, пульс 72 в мин. АД 130/80 мм.рт.ст. Живот мягкий, безболезненный.
Отмечалась дефигурация лучезапястных, пястнофаланговых, проксимальных межфаланговых суставов кистей, а также коленных и голеностопных суставов за счет экссудативно-пролиферативных изменений. Болезненность в пораженных суставах при пальпации. Положительный симптом сжатия стоп на уровне плюснефаланговых суставов. Ревматоидный узелок в области разгибательной поверхности правого локтевого сустава. Из-за болен в суставах с трудом себя обслуживает.
Рентгенография кистей: признаки периартикуляр-ного остеопороза, субхондральный склероз, сужение суставных щелей, краевые узуры лучезапястных суставов. Общий анализ крови: НЬ - 123 г/л, лейкоциты 9300, пя 1, с 65, э 1, лимф 32, мон 1, СОЭ S мм/час. СРБ отр, латекс-тест 1:1280, ЦИК 41 ЕД. ( норма до 50 ЕД.), АСЛ-0 менее 250 ЕД, антитела к ДНК отр, альбумины 47%, глобулины: альфа-1 5,5%, альфа-2 13%, бета 17,3%, гамма 17,2%, IgM 10,8 г/л, IgG 17,5 г/л, CD23 - 22,4%.
Таким образом, у пациентки страдающей РА в течение 6 мес, имелись клинические симптомы активности процесса, что сопровождалось значительными иммунологическими нарушениями (РФ 1:1280, CD - 22,4%). При этом общий анализ крови, уровень ЦИК,СРБ оставались в пределах нормы.
Особое внимание было уделено изучению активационных антигенов, отражающих функциональное состояние иммунной системы (табл.З).
У больных ранним РА отмечено увеличенное количество клеток с рецепторами к трансферрину (CD71) до 9,90±1,24% в отличие от здоровых людей - 6,23+0,38%. Также наблюдалось значительное, более чем в 2 раза, повышение числа лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы для Fas-зависимого апоптоза (CD95).
Достоверных отличий количества CD25+ и HLA-DR^-лимфоцитов по сравнению со здоровыми людьми не выявлено.
При оценке полученных результатов мы исходили из того, что процесс активации лимфоцитов сопровождается постадийным изменением экспрессии активационных маркеров. В начале процесса активации происходит усиленная экспрессия рецепторов для ИЛ 2 - маркеров CD25. Затем запускаются процессы пролиферации, требующие присутствия ионов железа и сопровождающиеся усиленной экспрессией рецептора к трансферрину - CD71. В последнюю очередь усиливается экспрессия поздних маркеров активации: HLA-DR, отражающего процессы дифференциации лимфоцита, или CD95 - рецептора Fas-зависимого апоптоза [7].
У обследованных больных, несмотря на выраженные клинические признаки активного заболевания и тяжелый воспалительный процесс в суставах, изменения количества лимфоцитов, экспрессирующих активационные антигены, были незначительными. Это позволяет предположить, что у больных РА уже на ранних стадиях происходят нарушения процессов активации Т-лимфоцитов.
При изучении субпопуляций лимфоцитов, экспрессирующих активационные антигены, выявлено, что у больных РА по сравнению с нормой наибольший прирост (в 4 раза) отмечается у лимфоцитов, несущих на себе рецепторы адгезии ICAM-I (CD54). Это отражает вовлеченность иммунной системы больных РА в развернутый ответ острой фазы.
В качестве дополнительного критерия, отражающего соотношение процессов дифференциации и апоптоза лимфоцитов, можно использовать соотношение поздних маркеров разной направленности - НЬА-ОВ и С095. Повышение соотношения HLA-DR/CD95 свидетельствует о преобладании процессов развития иммунно-
Таблица 3
Содержание лимфоцитов, экспрессирующих основные активационные маркеры в периферической крови больных ранним РЛ (в %).
Оцешгеаемый показатель Больные ранним РА п=14 Здоровые п=19
CD25 7,36±0,69 6,02Ю,47
CD71 9,90±1,24 6,2310,38
HLA-DR 14,57±1.57 12,0410,53
CD54 20,0412,51 5,49Ю,97
CD95 10.58+1,54 4,6010,33
го ответа, а снижение - о преобладании процессов апоптоза. Соотношение С025/С095 позволяет оценить взаимоотношение процессов запуска активации иммунной системы и апоптоза.
У больных ранним РА соотношение HLA-DR/ С'Э95 было снижено более чем в 2 раза по сравнению со здоровыми донорами (рис.). Аналогичным образом уменьшено и соотношение С025/СЭ95. Эти изменения евиде-
Рисуиок
Изменение соотношения лимфоцитов, экспрессирующих активационные антигены
3.5 32,5
2
1.5 1
0,5
О
□ CD25/CD95
□ HLA-DR/CD95
Здоровые Больные РА
тельствуют об усилении индукции апоптоза лимфоцитов у больных ранним РА.
Полученные результаты позволяют предложить следующую концепцию иммунопатогенеза РА. При раннем РА наблюдается резкое снижение количества Т-лимфоцитов, сопровождающееся значительным увеличением в периферической крови лимфоцитов с фенотипом СОЗ+4*8+. Клетки с таким фенотипом в норме практически не покидают тимус, и их появление можно расценить как признак гиперстимуляции вилочковой железы. В свою очередь, лимфоциты с фенотипом СОЗ+4’8> вне тимуса быстро подвергаются апоптозу, что объясняет выявленную нами повышенную склонность лимфоцитов периферической крови больных ранним РА к индукции апоптоза, с одной стороны, и развитию выраженной 'Г-лимфоцитопении, с дру-
ХАРАКТЕРИСТИКА СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ И АКТИВАЦИОННЫХ ПРОЦЕССОВ В ИММУННОЙ СИСТЕМЕ БОЛЬНЫХ РАННИМ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ.
Г.В. Порядин, Л.Ю. Семенова, А.Н. Казимирскнй, H.A. Шостак, Т.К. Логинова, Ж.М. Салмасн, А.Ю. Потанин. 25
гой. В связи с нарушением контроля Т-лимфоцитов над В-клеточным звеном иммунной системы происходит резкое усиление активации В-лимфоцитов с последующей дифференциацией и усиленной продукцией иммуноглобулинов. Возможно, существенную роль в поражении суставов при РА играют и активированные >)К - клетки.
Определенная корреляция между клиническими и иммунологическими показателями подтверждает концепцию агрессивного течения РА в раннем периоде и определяет необходимость применения высокоактивных базисных препаратов уже на начальных стадиях заболевания.
ЛИТЕРАТУРА.
1. Бобков В.А., Брьшенкова Т.Н., Монсеенко P.C. Показатели кислотно-основного состояния енновнальной жидкости у больных ревматоидным артритом в ранней стадии. Ревматол., 2000, 12, 35- 38.
2. Железникова Г.Ф. Иммуиомодулнрующседействневакцнн: новые аспекты известной проблемы. Иммунол., 2000, 4, 20 - 24.
3. Кирикова С.Ф., Ширинскнн B.C. Иммуноиатогенетические механизмы различий серопозитивного и серонегативного ревматоидного артрита. Иммунол., 1993, 3, 44 - 47.
4. Кузнецова С.А., Косицкая Л.С., Фрейдлин И.С., Тихомиров И.И. Влияние иммунных комплексов, выделенных из плазмы больных ревматоидным артритом, на секрецию провоспали-тельных и противовоспалительных цитокинов клетками крови здоровых доноров. Иммунол., 2000,4, 48 - 52.
5. Насонов Е.Л. Глюкокортикоиды: 50 лет применения в ревматологии. Тер. арх.., 1999, 5, 5 - 9.
6. Насонов Е.Л., Самсонов М.Ю., Тилз Г.П. и др. Растворимые молекулы адгезии (Р-селектин,1САМ-1, ICAM-3) при ревматоидном артрите. Тер. арх., 1999, 5, 17 -20.
7: Порядии Г.В., Санина Н.П., Макарков А.И. и др. Динамическая характеристика поверхностного фенотипа лимфоцитов периферической крови у больных миокардитом. Russian J. Immunol., 1999, 4, 165- 170.
8. Тимофеев В.Т., Шостак H.A., Логинова Т.К. и др. Иммунологические аспекты диагностики ранней стадии ревматоидного артрита. Тер. арх., 2000, 5, 19 - 21.
9. Федосеева В.H., Порядии Г.В., Ковальчук Л. В. и др. Руководство по иммунологическим и аллергическим методам в гигиенических исследованиях. Промсдэк,, 1993, 320.
К) Ширинский B.C., Кирикова С.Ф. Иммунологические нарушения при различных клинических вариантах ревматоидного артрита. Тер. арх,. 1992. 5, 64. 14-7.
11. Шостак H.A., Тимофеев В.Т. Иммунные нарушения и принципы патогенетической терапии при ревматических заболеваниях. Аллерг. и нммунопатол., М, 1999, 282.
12. Шостак H.A., Логинова Т.К. Ранний ревматоидный артрит. Вопросы диагностики. Вестник РГМУ, М, 1999, 5,15 - 20.
13. Шостак Н.А., Порядин Г.В., Логинова Т.К. и др. Ранний ревматоидный артрит - клинико-иммунологические аспекты. В сб. «Проблемы диагностики и лечения ревматических заболеваний». М., 1998, 5-8.
14. Яршшна А.А., Никонова М.Ф., Литвинова М.М. и др. Влияние а2Ь-интерферона in vivo и in vitro на функциональную активность Т-лимфоцитов больных ревматоидным артритом. Тер. арх., 2000, 5,9-17.
15. AarvakT,, Chabaud M.,Thoen J. et al. Changes in LlieThl orTh2 cytokine dominance in the synovium of rheumatoid arthritis (RA): a kinetic study of the Th subsets in one unusual RA. Rheumatol. (Oxford), 2000, 39, 5. 513-522.
16. Bond A., Hay F.C. L-selectin expression on the surface of perepheral blood leucocytes from rheumatoid arthritis patients is linked to disease activity. Scand. J. Immunol., 1997, 46, 3, 312 -316.
17 Breedveld F.C. New insights in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. J. Rcumatol., suppl., 1998, 57, 8,480 - 486.
18. Elewaut D., De Keyser F., De Wever N. et al. A comparative phenotypical analysis of rheumatoid nodules and rheumatoid synovium with special reference to adhesion molecules and activation markers. Ann. Rheum. Dis., 1998, 57, 8, 480 - 4S6.
19. Feldman М., Brennan F.M., Miani R.N. Role of cytokines in rheumatoid arthritis. Ann. Rev. Immunol., 1996, 14. 397 - 440.
20. Gerli R., Lunardi C., Vinante F. et al. Role ol‘CD30+ T cells in rheumatoid arthritis: a counter-regulatory paradigm for Th I -driven diseases. Trends in Immunol., 2001, 22, 72 - 77.
21. Hayashida K., Shimaoka Y„ Ochi T., Lipsky P.E. Rheumatoid arthritis synovial stromal cells inhibit apoplosis and up-regulate Bcl-xL expression by В cells in a CD49/CD29-CD 106-dependent mechanism. J. Immunol., 2000, 164, 2, 1110 - 1116.
22. Maini R.N,. Eliott М., Brennan F.M. et al. TNF blockade in rheumatoid arthritis: implications for therapy and pathogenesis. A PM IS, 1997, 105, 4, 257 - 263,
23. Warrington K.J,,TakemuraS.,GoronzyJJ., WeyandC.M CD4+, CD28- T cells in rheumatoid arthritis patiens combine fearutes of the innate and adaptive immune systems. Arthr. Rheum., 2001,44, 1, 13-20.
Abstract.
Objective. Determining of immune profile in pts with early RA and clinical-immunological associations. Material and methods. 14 pts with early RA were examined. Peripheral blood was analyzed for lymphocytes expressing antigens CD3, CD4, CDS, CD56, CD20, CD72, CD38, CD25, CD7I, HLA-DR, CD95, CD22, CD54, mlgM, mlgG. Clinical- immunological parameters were assessed.
Results: Pts with eariy RA demonstrated inhibition of T-cell chain of immune system manifested by dropping of total T-lymphocyle level in peripheral blood and by appearing of immature T-cells with phenotype CD3+
4+ 8+ combined with expressed activation of В-cell chain of immune system. There was correlation between clinical and immunological indices.
Key words: rheumatoid arthritis, subpopulations of lymphocytes.
Поступила 15.01.2002
