CC BY
235
УДК 571.27:616.13-004.6(571.56)
ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ КОРОНАРНОМ И МУЛЬТИФОКАЛЬНОМ АТЕРОСКЛЕРОЗЕ
Айталина Семеновна ГОЛЬДЕРОВА1, Ирина Николаевна НИКОЛАЕВА1,
Анна Николаевна РОМАНОВА1, Владимир Александрович КОЗЛОВ2
1Якутский научный центр комплексных медицинских проблем СО РАМН 677010, г. Якутск, Сергеляхское ш., 4
2НИИ клинической иммунологии СО РАМН 630047, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14
В данном исследовании приведен сравнительный анализ экспрессии антигенных маркеров лимфоцитов периферической крови у больных с верифицированным мультифокальным (п = 44) и коронарным атеросклерозом (п = 49), выявивший существенные различия в зависимости от локализации и распространенности атеросклеротического процесса. При коронарном атеросклерозе значимо повышается экспрессия CD11b+, которая сочетается с тенденцией к повышению содержания МК-клеток (СD16+) и к снижению количества цитотоксиче-ских Т-лимфоцитов (CD8+). При мультифокальном атеросклерозе у больных наблюдается значимое увеличение относительного содержания цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+), экспрессии рецептора трансферрина CD71+, рецептора апоптоза CD95+, адгезивного рецептора CD54+ а также снижение экспрессии лимфоцитами Ь-селектина CD62L+.
Ключевые слова: атеросклероз, лимфоциты, молекулы адгезии.
Атеросклероз — системное заболевание артериальной системы — представляет собой сложный многоэтапный патологический процесс, поражающий внутреннюю оболочку артерий крупного и среднего калибра [1]. В настоящее время атеросклеротические поражения сосудов рассматриваются как воспалительный и репара-тивный ответы на хроническое и эпизодическое повреждение интимы артерий, в котором принимают участие лимфоциты, моноциты/макрофаги, цитокины, молекулы межклеточной адгезии, белки острой фазы, компоненты комплемента, активные формы кислорода, оксид азота и другие факторы, формирующие пролиферативный пул в месте повреждения [2—5]. Участие Т-лимфоцитов в атерогенезе обусловлено их ролью в антигенном распознавании, клональной экспансии, инициации клеточно-опосредованного воспалительного ответа и подтверждено результатами клинико-иммунологических исследований, демонстрирующих сопряженность манифестации клинических симптомов атеросклероза и процессов Т-клеточной активации [4]. Хроническая Т-клеточная активация, сопровождающаяся увеличением количества лимфоцитов, которые экспрессируют активационные антигены, наблюдается не только в зоне повреждения, но и в периферической крови и встречается у пациен-
тов с различными формами атеросклероза. Полагают, что активация Т-лимфоцитов и, скорее всего, СБ4+-Т-лимфоцитов происходит в Т-зоне лимфатических узлов, регионарных к поврежденным участкам сосудов, откуда активированные Т-клетки мигрируют в соответствующие участки сосудистой стенки [3].
Оценка иммунного статуса больных атеросклерозом позволила установить у них существенный дисбаланс иммунологических показателей, характеризующийся высокой активностью гуморального иммунитета, сопряженного с относительным дефицитом Т-клеточного звена иммунной системы [6]. У больных ишемической болезнью сердца с ожирением и дислипидеми-ей выявлены высокие уровни цитотоксических лимфоцитов СБ8+ и Т-клеток. Обнаружены статистически значимые корреляционные связи между экспрессией маркеров СБ95+ и индексом массы тела, показателями липидного обмена атерогенной направленности и активностью креатинфосфокиназы [7]. Учитывая, что данные о функциональном состоянии лимфоцитов при атеросклерозе сосудов немногочисленны и противоречивы, значительный интерес представляет сравнение иммунологических показателей в зависимости от локализации и распространенности атеросклеротического процесса.
Гольдерова А.С. — к.м.н., гл.н.с. отдела изучения механизмов адаптации; e-mail: [email protected] Николаева И.Н. — ст.н.с. лаборатории иммунопатологии; e-mail: [email protected] Романова А.Н. — к.м.н., зав. лабораторией клинико-популяционных исследований; e-mail: [email protected] Козлов В.А. — академик РАМН, директор; e-mail: [email protected]
Материал и методы
Нами было обследовано 93 больных (74 мужчины и 19 женщин), поступивших в стационарные отделения кардиологии и сосудистой хирургии Республиканской больницы № 1 Национального центра медицины г. Якутска. Возраст больных составил от 24 до 71 года (средний возраст 53,9 ± 8,6 года). В контрольную группу вошли 9 здоровых мужчин и 6 женщин, сопоставимых по возрасту и не имеющих в анамнезе ишемической болезни сердца и сосудистой патологии. Критериями исключения из исследования являлись острые воспалительные, аутоиммунные и опухолевые заболевания. Все исследования выполнены с информированного согласия испытуемых и в соответствии с этическими нормами Хельсинкской декларации (2000 г.).
По результатам ангиографических исследований (селективная коронарография, каротидная, тазово-дистальная ангиография) больные были разделены по локализации и распространенности атеросклеротического процесса на 2 группы: одну составили 44 больных кардиологического отделения (36 мужчин и 8 женщин со средним возрастом 52,6 ± 7,7 года) с различной степенью выраженности коронаросклероза, вторую — 38 мужчин и 11 женщин (средний возраст 55,1 ± 9,2 года) с мультифокальным атеросклерозом, т.е. с атеросклеротическим поражением таких сосудистых бассейнов, как экстракраниальные артерии, артерии нижних конечностей, чревного ствола, брыжеечных и почечных артерий. Забор крови производился в течение первых суток после поступления больных на стационарное обследование и лечение.
Для иммунологических исследований использовали лимфоциты, выделенные из периферической крови, которую забирали в равных условиях: утром натощак в объеме 5—7 мл. Выделение лимфоцитов из венозной крови проводили в градиенте плотности фиколла-верографина. Иммунофенотипирование лимфоцитов выполняли методом проточной цитометрии (цитофлуориметр FACSCalibur, Becton Dickinson, США) с использованием моноклональных антител с тройной меткой (CD3FITC + + CD4RPE + CD45RPE-Cy5, CD3FITC +
+ CD19-RPE + CD45RPE-Cy5, CD3FITC + + CD8RPE + CD45RPE-Cy5, CD16FITC +
+ CD19RPE + CD3RPE-Cy5) и с одной мет-
кой (CD25-RPE, CD11b-RPE, CD71-FITC (Dako, Дания), CD54-RPE, CD95-RPE (Becton Dickinson), CD62L-FITC (Сорбент, Санкт-Петербург)). Проанализированы относительные содержания лимфоцитов, экспрессирующих
следующие маркеры: CD3+ — Т-лимфоциты, CD4+ — Т-хелперы, CD8+ — цитотоксические Т-лимфоциты, CD16+— NK-клетки, CD19+—
В-лимфоциты, CD11b+ — ам-цепь интегрина, CD25+ — низкоафинная a-цепь рецептора к ИЛ-2, CD54+— адгезивный рецептор ICAM-1, CD62L+ — адгезивная молекула L-селектин, CD71+ — рецептор к трансферрину, CD95+ — проапоптотический маркер.
Статистический анализ результатов проводили с использованием пакета программ SPSS 11.5 for Windows. Данные представлены в виде: среднее арифметическое (М) ± ошибка среднего арифметического (m). Проверку нормальности распределения количественных признаков проводили с помощью W-критерия Шапиро — Уилка и критерия Колмогорова — Смирнова. Различия средних значений показателей в двух независимых группах оценивали с помощью непараметрического критерия Манна — Уитни и параметрического t-критерия Стьюдента. За пороговый уровень значимости принимали величину 0,05.
Результаты и обсуждение
Анализ полученных нами данных показывает, что средние значения относительного содержания Т-лимфоцитов ^D3+), Т-хелперов ^D4+) и В-лимфоцитов (CD19+) в исследуемых группах находятся в диапазоне физиологических норм, а уровень NK-клеток (CD16+) у больных с коронаросклерозом имеет тенденцию к повышению. Сравнительный анализ данных между исследуемыми и контрольной группами не выявил статистически значимых различий по относительному содержанию CD3+, CD4+, CD16+ и CD19+ (табл.).
Статистически значимое различие между исследуемыми группами выявлено по относительному содержанию цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+). Так, у больных с мультифокальным атеросклерозом он оказался выше, чем у лиц контрольной группы (в 1,31 раза, p < 0,01) и больных коронаросклерозом (в 1,54 раза, p < 0,001). При этом следует отметить, что у больных с коронаросклерозом уровень CD8+-Т-клеток имеет тенденцию к снижению по сравнению с контрольной группой. Известно, что CD8+ могут проявлять свою цитотоксическую активность в отношении антигенпрезентирующей клетки, экспрессирующей чужеродные пептиды в комплексе с молекулами MHd, а также несут функции уничтожения собственных клеток, тем самым отрицательно влияя на течение заболевания посредством разрушения клеток-мишеней или индукции хронического воспалительного состояния. Выявленное нами повышение содержания в крови цитоток-сических Т-лимфоцитов (CD8+) свидетельствует об активации эффекторного звена клеточного иммунитета у больных с мультифокальным атеросклерозом и может быть ассоциировано с распространенностью и со степенью тяжести атеросклеротического процесса. Иммунорегуляторный
Таблица
Фенотипическая характеристика лимфоцитов периферической крови, М ± т (%)
Показатель Контрольная группа (п = 13) Пациенты с коронарным атеросклерозом (п = 44) Пациенты с мультифокальным атеросклерозом (п = 49)
Т-лимфоциты (СБ3+) 72,15 ± 1,41 71,11 ± 1,59 74,04 ± 1,73
Т-хелперы (СБ4+) 41,84 ± 3,8 40,9 ± 1,84 41,97 ± 1,62
Цитотоксические лимфоциты (СБ8+) 26,76 ± 2,13 22,8 ± 1,49 34,85 ± 1,41*#
ИРИ (СБ4+/СБ8+) 1,84 ± 0,34 2,27 ± 0,22 1,34 ± 0,91#
МК-клетки (СБ16+) 13,69 ± 1,45 18,9 ± 1,52 16,61 ± 1,50
В-лимфоциты (СБ19+) 7,15 ± 0,75 8,43 ± 1,00 8,66 ± 1,41
Рецептор к ИЛ-2 (СБ25+) 13,4 ± 1,54 16,76 ± 1,67 18,6 ± 1,63
ам-цепь интегрина (СБ11Ь+) 23,85 ± 2,11 40,2 ± 2,65* 26,21 ± 2,14#
Рецептор ІСАМ-1 (СБ54+) 27,38 ± 3,49 29,85 ± 2,86 45,95 ± 2,96*-#
Ь-селектин (СБ62Ь+) 66,75 ± 5,11 50,32 ± 2,67* 40,58 ± 2,62*’#
Рецептор к трансферрину (СБ71+) 2,33 ± 0,55 5,14 ± 0,56* 7,29 ± 0,91*
Рецептор апоптоза (СБ95+) 37,3 ± 4,3 41,6 ± 3,52 55,35 ± 3,39*'#
— достоверное (р < 0,01) отличие от величины соответствующего показателя контрольной группы,
Примечание: *
# — группы 2.
индекс ИРИ (CD4+/CD8+) у больных с коронаросклерозом имеет тенденцию к повышению по сравнению с контрольной группой, а у больных с мультифокальным атеросклерозом это соотношение оказалось статистически значимо сниженным (р < 0,001) по сравнению с группой больных коронаросклерозом.
Миграция лимфоцитов, их активация и эф-фекторные функции зависят от молекул клеточной адгезии, которые связаны с плазматической мембраной белков и обеспечивают высокоселективное межклеточное взаимодействие. Во многих случаях отдельная молекула межклеточной адгезии способна взаимодействовать не с одним, а с несколькими лигандами, для чего служат разные участки связывания [8]. Экспрессия адгезивных молекул на эндотелии и лейкоцитах является начальным этапом их рекрутирования в очаг воспаления, что сопровождается возникновением широкого спектра реакций, имеющих в своей основе защитный характер, но приводящих при чрезмерной длительности или интенсивности к дополнительному развитию дистрофических и некротических изменений. Такой процесс характерен для локального воспаления в стенке сосудов, лежащего в основе развития атеросклероза.
В соответствии с классификацией адгезивные молекулы подразделяются на селектины, инте-грины, суперсемейство иммуноглобулинов и кад-герины [9].
Нами оценены уровни экспрессии следующих адгезивных молекул: СD54+ (ІСАМ-1, молекула межклеточной адгезии 1 типа, принадлежащая к суперсемейству иммуноглобулинов), CD11b+ (ам-цепь интегрина СЯ3) и CD62L+ (Ь-селектин).
Сравнительный анализ адгезивных молекул в исследуемых группах показал статистически значимое превышение экспрессии CD54-позитивных лимфоцитов у больных с мультифокальным атеросклерозом по сравнению с контрольной группой в 1,68 раза, р < 0,001) и с больными коронарным атеросклерозом (в 1,54 раза, р < 0,001). Следует отметить, что экспрессия этих молекул на эндотелии сосудов имеет постоянный характер, но значительно усиливается при его стимуляции провоспалительными цитокинами и модифицированными липопротеинами. На покоящихся лейкоцитах периферической крови CD54 экспрессирован слабо, но экспрессия возрастает при активации Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов и моноцитов. Растворимые молекулы CD54+ действуют как инги-
биторы иммунных реакций между NK-клетками, цитотоксическими Т-лимфоцитами.
CD11b+ (ам-цепь) в комбинации с р-цепью (CD18+) образует специфичный для лейкоцитов интегрин, обозначаемый как Мас-1 (macrophage receptor-1) или рецептор инактивированного комплемента CR3, он экспрессируется на миело-идных клетках и естественных киллерах [10]. При анализе полученных данных оказалось, что содержание этого адгезивного маркера, в отличие от других, значительно повышено у лиц с коронарным атеросклерозом по сравнению с контрольной группой (в 1,68 раза, p < 0,001) и с больными мультифокальным атеросклерозом (в 1,53 раза, р < 0,001). Учитывая то, что у больных с коронаросклерозом, в отличие от пациентов с мультифокальным атеросклерозом, также наблюдается тенденция к повышению NK-клеток (CD 16+), мы провели корреляционный анализ, который указывает на прямую взаимосвязь между количеством клеток CD11b+ и CD16+ (r = 0,383, р < 0,001). Известно, что CD16+ способны реализовывать прямую и антителозависимую цитотоксичность, обеспечивая первый уровень защиты против опухолей и внутриклеточных инфекций до включения специфических иммунных механизмов и вызывая лизис определенных типов клеток-мишеней без предварительной их сенсибилизации.
CD62L+ ^^еле^ин) обеспечивает прикрепление лимфоцита к эндотелиальной клетке. При активации лимфоцитов часто возникает «смывание» L-селектина, что сопровождается активацией р2-интегринового комплекса (CD11/CD18) лимфоцитов и моноцитов [11]. В результате гидролиза пептидной связи (Lys321-Ser322) в при-мембранной области селектина L (74 кДа) и образования его растворимой формы (68 кДа) нарушается контакт между лимфоцитом и эндоте-
лиальной клеткой. Потеря адгезионных молекул с поверхности клеток может быть одной из форм негативной регуляции воспаления [12]. В нашем исследовании уровень CD62L+ у больных мультифокальным атеросклерозом оказался значимо сниженным (р < 0,001) по сравнению с контрольной группой (в 1,63 раза), с группой больных коронарным атеросклерозом (в 1,32 раза). Полученные результаты свидетельствуют о наиболее выраженных нарушениях регуляции опосредованной L-селектином адгезии у больных мультифокальным атеросклерозом.
CD71+ (рецептор к трансферрину) является ранним активационным маркером лимфоцитов, обнаруживается на большинстве делящихся клеток [10]. Содержание лимфоцитов с высокой пролиферативной активностью, экспрессирующих CD71+, при мультифокальном атеросклерозе оказалось значимо выше, чем в контроле (в 3,11 раза, р < 0,001) и при коронарном атеросклерозе (в 1,35 раза, р < 0,01). Увеличение числа CD71-позитивных лимфоцитов с высокой пролиферативной активностью отражает процессы активации иммунной системы, появление ранних предшественников (лимфобластов), нарушение нормального процесса созревания иммуноцитов.
СD95+ — мембранный белок типа I суперсемейства фактора некроза опухолей — содержит домен смерти, широко распространен на клетках разных тканей. После активации на Т-лимфоцитах повышается экспрессия СD95+. Помимо функции индуктора клеточной смерти, CD95+ может участвовать в запуске пролиферативных сигналов в Т-лимфоцитах [10]. Нами обнаружено, что у больных с мультифокальным атеросклерозом статистически значимо увеличено содержание в периферической крови лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы индукции апоптоза CD95+, по сравнению с контрольной
□ контроль
□ коронарный атеросклероз
■ мультифокальный атеросклероз
80 і 70 60 50 40 30 20 10 0
: ■
CD8+ CD11b+ CD62L+ CD54+ CD95+ CD71+
Рис. Значимые различия экспрессии лимфоцитов при коронарном и мультифокальном атеросклерозе у сравниваемых групп (%)
группой (в 1,48 раза, p < 0,01) и с больными коронарным атеросклерозом (в 1,33 раза, p < 0,01). Известно, что с участием CD95+ удаляются Т-клетки, которые активируются неспецифически и неполноценно. Выявленное нами увеличение экспрессии CD95+, свидетельствующее об усилении апоптоза лимфоцитов, возможно, связано с процессами активации иммунной системы и нарушением процессов нормального созревания иммуноцитов. Значимое повышение пролиферативной активности у лиц с мультифокальным атеросклерозом по сравнению с пациентами с коронарным атеросклерозом подтверждается выявленным увеличением экспрессии маркера ранней активации Т-лимфоцитов CD71+.
Заключение
Проведенная нами фенотипическая характеристика лимфоцитов периферической крови больных с верифицированным атеросклеротическим поражением сосудов выявила существенные различия в зависимости от локализации и распространенности атеросклеротического процесса (рис.). Так, у больных с атеросклерозом коронарных сосудов выявлено значимое повышение экспрессии CD11b+ (ам-цепи интегрина), которое сочетается с тенденцией к увеличению содержания NK-клеток (CD 16+) и к снижению количества цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+). При мультифокальном атеросклерозе у больных наблюдается значимое повышение относительного содержания цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+) и экспрессии рецепторов к трансферрину (CD71+), апоптоза CD95+, ICAM-1 (CD54+), а также значимое снижение экспрессии L-селектина (CD62L+). Полученные результаты требуют дальнейшего углубленного изучения и анализа.
Список литературы
1. Акберов Р.Ф., Шарафаев А.З., Михайлов М.К. и др. Прогрессирующий мультифокальный атеросклероз: этиология, клинико-лучевая диагностика, современные аспекты лечения. Казань: Идеал-Пресс, 2008. 214 с.
Akberov R.F., Sharafaev A.Z., Mikhailov М.К. et al. A progressing multifocal atherosclerosis: aetiology, clinical radiodiagnostics, modern aspects of treatment. Kazan’: Ideal-Press, 2008. 214 p.
2. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М.: Медицина, 1999. 608 с.
Yarilin A.A. Immunology bases. М: Medicine,
1999. 608 p.
3. Пигаревский П. В. Морфометрическое исследование клеток иммунорегуляторного и эф-фекторного звеньев иммунитета в аорте и параа-ортальных лимфатических узлов при атерогенезе у человека // Цитокины и воспаление. 2002. (4). 21-26.
Pigarevsky P. V. Morphometric research of cells of immunoregulatory and effector components of immune system in aorta and paraaortic lymph nodes at human atherogenesis // Tsitokiny i vospalenie. 2002. (4). 21 - 26.
4. Czyz A., Kotacz E, Angerer D. et al. Expression of activation antigens on lymphocyte surface and circulating platelet-leukocyte aggregates in ischaemic heart disease // Kardiol. Pol. 2005. 62. 189-200.
5. Wu R. Induction of human cytotoxic T-lymp-hocytes by oxidized low density lipoproteins // Scand. J. Immunol. 1996. 43. 381-384.
6. Дзяк Г.В., Коваль Е.А. Клиникоиммунологические критерии оценки прогноза и лечения атеросклероза и ревматизма // Журн. АМН Украши. 1998. (1). 78-87.
Dzyak G.V., Koval’ E.A. The clinical and immunological criterions of an assessment of the forecast and treatment of atherosclerosis and rheumatism // Zhurn. AMN Ukraini. 1998. (1). 78-87.
7. Миролюбова О.А., Добродеева Л.К., Сень-кова Л.В., Зыков Н.И. Особенности иммунного статуса у больных ишемической болезнью сердца с ожирением и атерогенной дислипиде-мией // Проблемы эндокринологии. 2000. (4). 14-16.
Mirolyubova O.A., Dobrodeeva L.K., Senko-va L. V., Zykov N.I. The immune status features at patients with ischemic heart disease and adiposity and aterogenic dyslipidemia // Problemy endokrinologii.
2000. (4). 14-16.
8. Jourdan J.E., Zhao Z.-Q., Vinten-Johansen J. The role of neutrophils in myocardial ischemia -reperfusion injury // Cardiovasc. Res. 1999. 43. (4). 860-878.
9. Талаева Т.В. Механизмы взаимодействия клеток крови и сосудистой стенки в реализации воспалительного и иммунного ответов // Украшський ревматол. журн. 2001. (3-4). 45-52.
Talaeva T. V. The mechanisms of interaction between blood cells and vascular wall in realization of inflammatory and immune response // Ukrainskiy revmatol. zhurn. 2001. (3-4). 45-52.
10. Ковальчук Л.В. Антигенные маркеры клеток иммунной системы человека CD (Claster differentiation) система: Учебно-методическое пособие для студентов, ординаторов, аспирантов медицинских ВУЗов. М., 2003. 76 с.
Kovalchuk L. V. The antigenic markers of cells human immune system of CD (Claster differentiation) system: Manual for students, interns, post-graduate students of medical high schools. М., 2003. 76 p.
11. Lefer A.M. Selectins: vital vasculotropic vectors involved in vascular remodeling // Circulation. 1997. 96. 3258-3260.
12. Bazil V. Physiological enzymatic cleavage of leukocyte membrane molecules // Immunol. Today. 1995. 16. 135-140.
THE PHENOTYPIC CHARACTERISTIC OF PERIPHERAL BLOOD LYMPHOCYTES AT THE CORONARY AND MULTIFOCAL ATHEROSCLEROSIS
Aitalina Semenovna GOL’DEROVA1, Irina Nikolaevna NIKOLAEVA1, Anna Nikolaevna ROMANOVA1, Vladimir Aleksandrovich KOZLOV2
Yakutsk Research Centre for Integrated Medical Problems SB RAMS 677010, Yakutsk, Sergelyakhskoe h., 4
2Institute of Clinical Immunology SB RAMS 630047, Novosibirsk, Yadrintsevskaya str., 14
In the research the comparative analysis of an expression of antigenic markers of peripheral blood lymphocytes at patients with verified multifocal (n = 44) and a coronary atherosclerosis (n = 49) is resulted, which revealed essential distinctions depending on localization and prevalence of atherosclerotic process. At the coronary atherosclerosis the expression CD11b+ combined with the tendency to increase percentage of NK cells ^D16+) and to decrease cytotoxic ^lymphocytes (CD8+) significantly raises. The significant increase in abundance ratio of cytotoxic T-lymphocytes (CD8+), expression of trasferrin (CD71+) receptor, receptor of apoptosis (CD95+), adhesive receptor (CD54+) as well as the decrease in an expression by lymphocytes L-selectin CD62L+ has been revealed at patients with multifocal atherosclerosis.
Key words: atherosclerosis, lymphocytes, adhesion molecules.
Gol’derova A.S. — candidate of medical sciences, chief researcher of the department for adaptation mechanisms investigation; e-mail: [email protected]
Nikolaeva I.N. — senior researcher of the laboratory of immunology; e-mail: [email protected]
Romanovа A.N. — candidate of the medical sciences, head of the laboratory of clinical and population researches;
e-mail: [email protected]
Kozlov V.A. — academician of RAMS, director; e-mail: [email protected]
