Энантиоселективный синтез (1R)-1-гидрокси-1-фенилпропанона с использованием дрожжей Pichia sp. Yar-52 и Saccharomyces cerevisiae g-22 Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

УДК 547.451

Я. В. Ковригин (магистрант), М. Г. Игнатишина (магистрант), А. Ш. Сунагатуллина (к.х.н., доц.), Р. Н. Шахмаев (к.х.н., доц.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)

ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНЫЙ СИНТЕЗ (1Д)-1-ГИДРОКСИ-1-ФЕНИЛПРОПАНОНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДРОЖЖЕЙ PICHIA SP. YAR-52 И SACCHAROMYCES CEREVISIAE G-22

Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, Уфа, ул. Космонавтов, 1; email: biochem@rusoil.net

Ya. V. Kovrigin, M. G. Ignatishina, A. Sh. Sunagatullina, R. N. Shakhmaev, V. V. Zorin

AN ENANTIOSELECTIVE SYNTHESIS OF (1R)-1-HYDROXY-1-PHENYLPROPANONE USING YEASTS PICHIA SP. YAR-52 AND SACCHAROMYCES

CEREVISIAE G-22

Ufa State Petroleum Technological University 1, Kosmonavtov Str, 450062 Ufa, Russia; e-mail: biochem@rusoil.net

Исследованы условия проведения эффективной биотрансформации бензальдегида в (1Л)-1-гид-рокси-1-фенилпропанон с использованием различных штаммов дрожжей. Максимальные выходы продукта (45 и 49 %) в сочетании с высокой энантиомерной чистотой (99% ее) были получены с помощью штаммов БассНатошусеБ сетею1$1ае 0-22 и Р1сЫа Бр. УЛЕ-52 при использовании сахарозы в качестве предшественника пирувата, рН=5.0, температуре 30—32 оС и порционном введении смеси бензальдегида и ацетальдегида к ферментирующим дрожжам.

Ключевые слова: биокатализ; (1Л)-1-гидрокси-1-фенилпропанон; Р1сЫа Бр.; БассНатошусеБ ceтevisiae; энантиоселективный синтез.

Стереоселективное создание углерод-углеродной связи относится к наиболее важным задачам органического синтеза. Хотя в последние годы данная проблема успешно решается с использованием энантиоселективного метал-локомплексного катализа, все большее значение приобретают ферменты и живые клетки микроорганизмов 1-3. Энзиматические трансформации часто обладают более высокой хемо-, регио- и энантиоселективностью, осуществляются в мягких условиях и часто в водных средах. Эти качества биокаталитических систем позволяют избежать затратной и трудоемкой химии защитных групп, а также минимизиро-Дата поступления 10.04.17

The conditions for effective biotransformation of benzaldehyde to (1R)-1-hydroxy-1-phenylpropa-none using different strains of yeasts are investigated. The maximum yields of the product (45 and 49%) in combination with high enantiomeric purity (99% ee) were obtained with using strains of Saccharomyces cerevisiae G-22 and Pichia sp. YAR-52 in the presence of sucrose as the precursor of pyruvate, pH = 5.0, temperature 30—32 0C and portionwise addition of the mixture of benzaldehyde and acetaldehyde to fermenting yeasts.

Key words: biocatalysis; enantioselective synthesis; (1R)-1-hydroxy-1-phenylpropanone; Pichia sp.; Saccharomyces cerevisiae.

вать токсичные отходы. Более того, использование клеточных культур является экономически более привлекательным для промышленности, учитывая высокую стоимость платиновых металлов и хиральных лигандов 4-6.

Биокатализируемая ацилоиновая конденсация относится к одному из наиболее эффективных методов энантиоселектвного создания углерод-углеродной связи. Так, реакция бензальдегида 1 c пируватом 2 под действием пируватдекарбоксила-зы пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) (схема 1) служит промышленным методом получения (Ш)-1-гидрокси-1-фенилпропанона (3) — важ нейшего хирального строительного блока в синтезе лекарственных препаратов 7-10.

о

о

о

он

Пируватдекарбоксилаза

-со2

он

Схема 1

Основным недостатком данного метода является параллельное восстановление бензальдегида под действием алкогольдегидрогеназы, приводящее к значительному снижению выхода целевого продукта и образованию трудноотделяемого побочного бензилового спирта 4 (схема 2).

^^т ^о Алкогольдегидрогеназа

ыдон

он

1 4

Схема 2

Нами проведены исследования, направленные на повышение эффективности данного ферментативного процесса с использованием различных штаммов дрожжей (Saccharomyces cerevisiae, Hansenula sp., Pichia sp. и Rhodotorulla sp.). Изменяемыми параметрами биотрансформации были температурный режим, рН среды, порядок добавления реагентов, введение различных добавок. В качестве предшественника пирувата апробировались глюкоза, сахароза, меласса и глицерин. Контроль за протеканием процесса осуществляли методами тонкослойной, газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) и хромато-масс-спектро-метрии (ХМС). Энантиомерный состав целевого продукта определяли при помощи хи-ральной ГЖХ.

Установлено, что при одноразовом добавлении бензальдегида 1 к ферментирующим дрожжам наблюдался низкий выход (^)-1-гидрокси-1-фенилпропанона (3) независимо от используемого штамма, источника углерода и рН среды, вследствие интенсивного образования бензилового спирта 4 и, вероятно, довольно высокой токсичности бензальдегида. Порционное добавление последнего вместе с аце-

'о ПеЫа зр. УАК-52 сахароза, СН3СНо

тальдегидом (эффективным ингибитором ал-когольдегидрогеназы) способствует резкому повышению эффективности процесса. Максимальные выходы продукта 3 (45 и 49 %) в сочетании с высокой энантиомерной чистотой (99% ее) были получены с помощью штаммов Saccharomyces cerevisiae G-22 и Pichia sp. YAR-52, соответственно, при использовании сахарозы в качестве предшественника пирувата, рН=5.0, температуре 30—32 оС и порционном добавлении смеси бензальдегида и аце-тальдегида к ферментирующим дрожжам. Кроме основных компонентов — (^)-1-гидро-кси-1-фенилпропанона (3) и бензилового спирта 4 — в реакционной среде методом ХМС были идентифицированы минорные продукты — (1R,2S)-1-фенилпропан-1,2-диол (5) и бензойная кислота (схема 3).

Структура (^)-1-гидрокси-1-фенилпро-панона (3) подтверждена данными спектров ЯМР и 13С, в которых присутствуют сигналы метильной группы [2.08 (синглет) и 25.23 м.д.], метиновой группы [5.10 (синглет) и 80.09 м.д.], а также сигналы ароматической и карбонильной групп. Абсолютная конфигурация ацилоина 3 подтверждена анализом его оптических характеристик.

Экспериментальная часть

Спектры ЯМР 1Н и С записаны в СЭС13 на приборе Вгикег АУ-500 (рабочая частота 500.13 и 125.76 МГц соответственно), внутренний стандарт — ТМС. Хроматографический и масс-спектральный анализ полученных соединений проводили на хроматомасс-спектромет-ре ОСМ5-ОР20105 БЫшаёги (электронная ионизация при 70 эВ, диапазон детектируемых масс 33—350 Да). Использовали капиллярную

он

он

он

Схема 3

+

1

+

+

1

3

4

5

колонку HP-1MS (30 м х 0.25 мм х 0.25 мкм), температура испарителя 280 °С, температура ионизационной камеры 200 °С. Анализ проводили в режиме программирования температуры от 50 до 300 оС со скоростью 10 оС/мин, газ-носитель — гелий (1.1 мл/мин). Энантио-мерный анализ осуществляли с использованием хиральных капиллярных колонок Chiraldex (30 м х 0.25 мм х 0.25 мкм) и BetaDEXTM 110 (30 м х 0.25 мм х 0.25 мкм).

(1R ) -1 -Гидрокси-1 -фенилпропанон ( 3 ). Раствор 20 г сахарозы, 0.25 г KH2PO4, 0.125 г MgSO4-7H2O, 0.8 г (NH4)2SO4 в 200 мл воды доводили до рН=5.0 50 %-ным раствором фосфорной кислоты. Добавляли 8.2 г сухих дрожжей (Pichia sp. YAR-52 или Saccharomyces cerevisiae G-22) и перемешивали в течение 3040 мин при температуре 32 оС до начала фер-

Литература

1. Brovetto M., Gamenara D., Saenz-Mendez P., Seoane G.A. C—C bond-forming lyases in organic synthesis // Chem. Rev.- 2011.- V.111.-P.4346-4403.

2. Drauz K., Groger H., May O. Enzyme catalysis in organic synthesis.- Weinheim: Wiley-VCH Verlag & Co. KGaA, 2012.- 2038 p.

3. Grogan G. Biotransformations // Ann. Rep. Prog. Chem., Sect. B.- 2008.- V.104.- P.211-233.

4. Organic Synthesis Using Biocatalysis. Ed. Goswami A., Stewart J.D.- Elsevier, 2016.- 438 p.

5. Fesko K., Gruber-Khadjawi M. Biocatalytic methods for C-C bond formation // ChemCatChem.- 2013.- V.5.- P.1248-1272.

6. Seoane G. Enzymatic C-C bond-forming reactions in organic synthesis // Curr. Org. Chem.- 2000.- V.4.- P.283-304.

7. Rosche B., Sandford V., Breuer M., Hauer B., Rogers P.L. Enhanced production of R-phenylacetylcarbinol (R-PAC) through enzymatic biotransformation // J. Mol. Catal. B: Enzym.- 2002.- V.19-20.- P.109-115.

8. Kostraby M.M., Smallridge A.J., Trewhella M.A. Yeast-mediated preparation of L-PAC in an organic solvent // Biotechnol. Bioeng.- 2002.-V.77.- P.827-831.

9. Zhang W., Wang Z., Li W., Zhuang B., Qi H. Production of L-phenylacetylcarbinol by microbial transformation in polyethylene glycol-induced cloud point system // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 2008.- V.78.- P.233-239.

10. Tripathi C.M., Agarwal S.C., Basu S.K. Production of L-phenylacetylcarbinol by fermentation // J. Ferment. Bioeng.- 1997.-V.84.- P.487-492.

ментации. Затем в реакционную массу четырьмя порциями в течение 60 мин вводили смесь 1.6 г бензальдегида (1) и 2.4 мл 50%-ного водного раствора ацетальдегида, интенсивно перемешивали в течение 6 ч и отделяли биомассу дрожжей центрифугированием. Фугат многократно экстрагировали этил ацетатом, объединенные органические слои сушили над безводным MgSO4 и концентрировали. Продукт очищали методом колоночной хроматографии (SiO2, гексан-этилацетат, 8:2). Спектр ЯМР 1Н, 5, м. д.: 2.08 c (3H, CH3), 5.10 c (1H, CHOH),7.31-7.41 м (5Н, СНаром ). Спектр ЯМР 13С, 5, м.д.: 25.23 (CH3), 80.09 (CHOH), 127.31 (2С^ром), 128.71 (CHаром), 128.99 ^ОТаром.), 137.90 (Саром.), 207.07 (C=O). Масс-спектр, m/z (1отн, %): 150 ([M]+, 2), 108 (8), 107 (100), 105 (12), 80 (7), 79 (94), 78 (8), 77 (55), 51 (16), 50 (5), 43 (17).

References

1. Brovetto M., Gamenara D., Saenz-Mendez P., Seoane G.A. [C—C bond-forming lyases in organic synthesis]. Chem. Rev., 2011, vol.111, pp.43464403. doi: 10.1021/ cr100299p.

2. Drauz K., Groger H., May O. [Enzyme catalysis in organic synthesis]. Weinheim, Wiley-VCH Verlag & Co. KGaA, 2012, 2038 p.

3. Grogan G. [Biotransformations]. Ann. Rep. Prog. Chem., Sect. B., 2012, vol.108, pp.202227. doi: 10.1039/C2OC90012B.

4. [Organic synthesis using biocatalysis]. Ed. Goswami A., Stewart J. Elsevier, 2016, 438 p.

5. Fesko K., Gruber-Khadjawi M. [Biocatalytic methods for C—C bond formation]. Chem Cat Chem, 2013, vol.5, pp.1248-1272. doi: 10.1002/ cctc.201200709.

6. Seoane G. [Enzymatic C—C bond-forming reactions in organic synthesis]. Curr. Org. Chem., 2000, vol.4, pp.283-304. doi: 10.2174/ 1385272003376283.

7. Rosche B., Sandford V., Breuer M., Hauer B., Rogers P.L. [Enhanced production of R-phenylacetylcarbinol (R—PAC) through enzymatic biotransformation]. J. Mol. Catal. B: Enzym., 2002, vol.19-20, pp.109-115. doi: 10.1016/S1381-1177(02)00157-1.

8. Kostraby M.M., Smallridge A.J., Trewhella M.A. [Yeast-mediated preparation of L-PAC in an organic solvent]. Biotechnol. Bioeng., 2002, vol.77, pp.827-831. doi: 10.1002/bit.10117.

9. Zhang W., Wang Z., Li W., Zhuang B., Qi H. [Production of L-phenylacetylcarbinol by microbial transformation in polyethylene glycol-induced cloud point system]. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2008, vol.78, pp.233-239. doi: 10.1007/s00253-007-1304-2

10. Tripathi C.M., Agarwal S.C., Basu S.K. [Production of L-phenylacetylcarbinol by fermentation]. J. Ferment. Bioeng., 1997, vol.84, pp.487-492. doi: 10.1016/S0922-338X(97)81900-9