CC BY
28
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
РЕГУЛЯТОРНЫЙ РЕВМАТОИДНЫЙ ФАКТОР ПРЕДОТВРАЩАЕТ РАЗВИТИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АТЕРОСКЛЕРОЗА, ВЫЗВАННОГО ИММУНИЗАЦИЕЙ НАТИВНЫМИ ЛИПОПРОТЕИНАМИ
Фомина К.В., Конорюкова А.А., Кузина М.А., Касимова Г.С., Богданова К.В.
ФГБОУ ВО «Удмуртский государственный университет», Ижевск, Россия
В настоящее время механизм, приводящий к развитию атеросклероза, до конца не ясен. В исследованиях, проведенных нами ранее, было показано, что однократная иммунизация крыс Wistar нативными липопротеинами низкой плотности (нЛПНП) человека или нативными липопротеинами высокой плотности (нЛПВП) человека вызывает висцеральное ожирение и изменения в стенке аорты типичные для ранних стадий атерогенеза. Однако в ответ на иммунизацию нЛПНП или нЛПВП изменения в стенке аорты и висцеральное ожирение развиваются не у всех исследованных крыс. Также нами был выявлен новый фактор регуляции ау-тореактивности, предотвращающий развитие экспериментально-вызванных аутоиммунных заболеваний, таких как коллаген-индуцированный артрит, аутоиммунный энцефаломиелит. Исследование специфичности данного фактора регуляции показало, что он представляет собой популяцию антиидиотипических антител специфичных к антигенсвя-зывающим участкам антигенраспознающих рецепторов ау-тореактивных лимфоцитов. От других антиидиотипических антител фактор регуляции отличается наличием общего паратопа специфичного к неоантигенным детерминантам шарнирной области IgG и его Fc-фрагментов. Учитывая данные о специфичности и принцип метода выявления нового фактора регуляции аутореактивности, последний был отнесен к антителам подобным ревматоидному фактору. Чтобы отличать от классического ревматоидного фактора, ассоциированного с артритом, ревматоидный фактор, сдерживающий развитие аутоиммунных заболеваний, получил название регуляторный ревматоидный фактор (регРФ). Мы предполагаем, что регРФ является универсальным фактором негативной регуляции аутореактивности и участвует в регуляции атерогенных и адипогенных иммунных реакций, предотвращая развитие атеросклероза и висцерального ожирения. Если гипотеза верна, то крысы, продуцирующие регРФ в ответ на иммунизацию нЛПНП и нЛПВП, окажутся устойчивы к атеросклерозу.
Тринадцать крыс Wistar было иммунизировано нЛПНП (Sigma), семнадцать — нЛПВП человека (Kalen Biomedical) в составе неполного адъюванта Фрейнда (НАФ) (Sigma), однократно, в дозе 200 мкг. Контрольные крысы (n = 16) получили инъекцию НАФ. Титр антител против нЛПНП и нЛПВП человека определяли методом ИФА. Для выявления эпикардиального жира сердце окрашивали суданом III. Оценивали содержание внутриабдоминального жира. Титр регРФ определяли методом агглютинации танизированных эритроцитов, нагруженных гомологичным иммуноглобулином G. Идиотип-антиидиотипические взаимодействия между популяцией регРФ и антителами к нативным липо-протеинам определяли методом конкурентного ИФА.
В ответ на иммунизацию нЛПНП атеросклероз развился у 60% крыс, в ответ на иммунизацию нЛПВП — у 80% крыс. В качестве критерия наличия или отсутствия у крыс атеросклероза было использовано висцеральное ожирение (появление эпикардиального жира и увеличение объема
внутриабдоминального жира), так как висцеральное ожирение является надежным маркером атеросклероза у человека и легко визуализируется. Наличие висцерального ожирения было ассоциировано с ранними атеросклеро-тическими изменениями стенки аорты. Обнаружено, что у крыс, иммунизированных нЛПНП либо нЛПВП и оказавшихся устойчивыми к развитию висцерального ожирения и атеросклероза, продукции антител к липопротеинам предшествует продукция регРФ. У животных, у которых развилось висцеральное ожирение и выявлены изменения в стенке аорты, повышения уровня регРФ в период индукции иммунного ответа (т.е. в течение 14 дней после иммунизации) не обнаружено. Сравнительный анализ уровня регРФ у устойчивых и чувствительных к атеросклерозу крыс выявил достоверно высокий его уровень на 7 день после иммунизации нЛПНП и на 14 день после иммунизации нЛПВП у устойчивых крыс по сравнению с чувствительными (Манна—Уитни тест, p < 0,05). Также обнаружено, что регРФ, полученный от устойчивых к атеросклерозу крыс, иммунизированных нЛПНП, является антиидиоти-пическими антителами по отношению к антителам против нЛПНП, а регРФ, полученный от крыс, иммунизированных нЛПВП, — антиидиотипическими антителами к антителам против нЛПВП. Таким образом, продукция регРФ в ответ на иммунизацию крыс нативными липопро-теинами ассоциирована с устойчивостью крыс к развитию экспериментального атеросклероза и висцерального ожирения. Отсутствие повышения уровня регРФ в ответ на иммунизацию крыс нативными липопротеинами может служить предиктором экспериментального атерогенеза и развития висцерального ожирения у крыс, иммунизированных нативными липопротеинами.
ЭЛЕКТРОПОРАЦИЯ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК ПЛАЗМИДОЙ, КОДИРУЮЩЕЙ ИММУНОРЕГУЛЯТОРНЫЙ ЦИТОКИН IL-10
Хантакова Ю.Н., Курилин В.В., Максютов А.З., Сенников С.В.
Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии, Новосибирск, Россия
Вслед за успехами в клеточной иммунотерапии онкологических заболеваний стали разрабатываться клеточные подходы коррекции посттрансплантационных нарушений, требующих пожизненного применения иммуно-супрессивной терапии. Среди них особое место занимает использование толерогенных дендритных клеток (ДК). Однако при введении в организм в условия трансплантации такие ДК теряют толерогенные свойства и дифференцируются в зрелые клетки, способствующие развитию эффекторного иммунного ответа. Для поддержания толерантности необходимо получение стабильной популяции толерогенных ДК. Одним из подходов является использование иммунорегуляторных цитокинов, таких как IL-10, однако при введении в организм, в условиях дефицита IL-10, может происходит их созревание. В отличие от использования белков, электропорация (ЭП) ДК ДНК-конструкциями, кодирующими цитокины, будет обеспечивать стабильное толерогенное состояние ДК. Целью данной работы является оптимизация протокола ЭП ДК плазмидой, кодирующей рмГЬ-10, а также опре-
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
деление зависимости эффективности ЭП от различных показателей.
Материалы и методы. В работе использовали мышей линии C57B1/6, в возрасте от 2 до 6 месяцев, которые были предоставлены ИЦИГ (г. Новосибирск). Костный мозг (КМ) для исследования получали из бедренных костей животного. Для получения культуры ДК клетки КМ культивировали в концентрации 1 млн/мл полной среды RPMI-1640, при добавлении 20 нг/мл GM-CSF и 20 нг/мл IL-4. Через 48 часов проводилась смена полной среды с повторным добавлением цитокинов без предварительного осаждения клеток. Для проведения электропорации ДК дважды отмывали раствором PBS и разводили до концентрации 20 млн/мл в холодном растворе OptiMem. Для проведения процедуры ЭП к 100 мкл ДК, добавляли необходимое количество плазмидной ДНК-конструкции, И проводили ЭП при различных вольтажах и длительности импульса. Сразу после ЭП клетки культивировали в полной среде в 48-луночном планшете в концентрации 1-2 млн/мл. Оценка эффективности электропорации проводилась по определению GFP-позитивных клеток. Жизнеспособность клеток оценивалась по включению пропидия йодида. Определение эффективности электро-порации ДК целевой плазмидой pMax-IL-10 проводилось по оценке внутриклеточного содержания IL-10 в ДК спустя 3 часа после ЭП при добавлении монензина и брефел-дина А, а также по продукции цитокина методом ИФА. Статистическая обработка результатов производилась при помощи программы GraphPadPrism 6.0.
Результаты. Показано, что использование 60 мкг/мл ДНК-плазмиды при силе импульса в 250 V и длине импульса в 5 мс являются оптимальными условиями, обеспечивающими повышение количества GFP-позитивных клеток при минимальной общей клеточной гибели. Определение условий культивирования после ЭП показало оптимальное распределение и количество проли-ферирующих клеток наблюдается при культивировании клеток в концентрации 2 млн/мл в смеси полной и кондиционной среды, в соотношении 1:1, при добавлении 20 нг/мл GM-CSF и 20 нг/мл IL-4. Использование данного протокола приводит к увеличению количества GFP-позитивных клеток до 50% при количестве жизнеспособных клеток 95%. Увеличение времени (10 ms и 15 ms) приводит к достоверному снижению количества GFP-позитивных клеток. Для оценки эффективности транс-фекции проводили определение внутриклеточной продукции IL-10 после трансфекции плазмидой pMaxIL-10. Было показано достоверное увеличение количества CD11c+IL-10+ ДК по сравнению с контрольными группами, что указывает на эффективность разработанного протокола. Также методом ИФА показана дозозависимая продукция IL-10 при электропорации ДК разными количествами плазмиды, кодирующей рмШ-10. По сравнению с ДК без электропорации, которые продуцируют IL-10 в очень низких концентрациях (4 пг/мл), даже минимальное количество плазмидной ДНК (1 мкг/мл) способствует увеличению продукции IL-10 в 224 раза (до 896 пг/мл), а использование больших концентраций плазмиды приводит к гиперпродукции IL-10 до 45 нг/мл. В течение 3 дней не наблюдается увеличение продукции IL-10, что говорит о пике продукции цитокина уже спустя 24 часа после электропорации.
Выводы. Разработанный протокол электропорации позволяет эффективно проводить трансфекцию дендритных клеток, обеспечивающую высокий уровень продукции целевого цитокина рмГЬ-10 при высокой жизнеспособности клеток. Полученные результаты могут быть использованы в дальнейшем для индукции толерогенных ДК со стабильным фенотипом, которые станут основой для разработки подходов к индукции трансплантационной толерантности в условиях ex vivo.
Работа поддержана РНФ. Соглашение. № 16-15-00086 от 11.01.2016.
ВЛИЯНИЕ ЦИТОКИНОВ НА ИНТЕНСИВНОСТЬ ЭКСПРЕССИИ ХЕМОКИНОВОГО РЕЦЕПТОРА CD184 ЕСТЕСТВЕННЫМИ КИЛЛЕРАМИ
Хохлова Е.В.1, Михайлова В.А.1, 2, Соколов Д.И.1, 2, Сельков С.А.1
1ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург, Россия 2 ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, Россия
Введение. Трансэндотелиальная миграция NK-клеток периферической крови является основным механизмом их пополнения в децидуальной ткани, где они играют важную роль с самых ранних этапов беременности. В миграции NK-клеток в децидуальную оболочку важную роль играет CXCL12 (SDF-1, stromal cell-derived factor-1). SDF-1 — хемоатрактант, который продуцируется клетками трофобласта и способствует привлечению NK-клеток в зону маточно-плацентарного контакта за счет связывания с рецептором CXCR4 (CD184), экспрессированным на NK-клетках. Целью исследования являлся анализ экспрессии рецептора CD184 клетками линии NK-92MI в присутствии цитокинов (TNFa, TGF-P).
Материалы и методы. Клетки линии NK-92MI культивировали с цитокинами TNFa, TGF-P в течение 24 часов при 37 °С в атмосфере 100% влажности, 5% СО2, после чего окрашивали антителами против рецептора CD184 (BD, США). Экспрессию рецептора оценивали при помощи проточного цитофлюориметра FacsCantoII (BD, США). Статистический анализ проводили в компьютерной программе Statistica 10, используя параметрический критерий Стьюдента (p < 0,05).
Результаты. Установлено, что при обработке клеток противовоспалительным цитокином TGF-P интенсивность экспрессии рецептора CD184 снижалась во всех исследуемых концентрациях по сравнению со спонтанным уровнем. Обработка провоспалительным цитокином TNFa увеличивала интенсивность экспрессии рецептора CD184 по сравнению со спонтанным уровнем.
Выводы. Провоспалительный цитокин TNFa и противовоспалительный цитокин TGF-P изменяют чувствительность NK-клетки к воздействию SDF-1 за счет изменения интенсивности экспрессии рецептора CD184, тем самым регулируя миграцию NK-клеток в ткани.
