CC BY
29
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
ство этих клеток возрастает. Есть данные о тесной TCR клональной гомологии между Tregs и CD4+Т-клетками памяти, что может указывать на то, что популяции Tregs пополняются из пула Т-клеток памяти. Это особенно интересно при аутоиммунных процессах, когда антигенные стимулы к образованию Т-клеток памяти могут быть регулярными. Целью исследования стало изучение популяций Tregs и Т-клеток памяти по уровню экспрессии молекулярных маркеров (CD4, CD25, FoxP3, CD45RO) на лимфоцитах периферической крови больных РА.
Материалы и методы. Обследовано всего 23 образца периферической крови больных ревматоидным артритом в возрасте от 33 до 72 лет. Контрольную группу составили 17 образцов крови здоровых доноров в возрасте от 25 до 67 лет. Иммунофенотипирование лимфоцитов проводили методом проточной цитометрии на приборе Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США). Для оценки экспрессии молекул использовали моноклональные антитела CD4-FITC, CD25-PC5, CD45RO-PC7 (Beckman Coulter, Франция), а также FoxP3-PE (eBioscience, США). Для оценки внутриклеточных маркеров выполняли пер-меабилизацию с использованием коммерческих наборов и согласно инструкции производителя. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Statistica 6.0, достоверность различий между группами рассчитывали по критерию Манна—Уитни, для выявления и оценки характера связи между признаками использовали коэффициент корреляции Спирмена. Данные представлены в виде M±SD.
Результаты. В работе было проанализировано содержание Treg-клеток с фенотипами CD4+FoxP3+, CD4+CD25+FoxP3+, CD4+FoxP3+CD45RO+ в периферической крови больных РА (n = 27) и здоровых доноров (n = 17). Было отмечено, что у больных РА количество CD4+FoxP3+ (9,8±3,0) и CD4+FoxP3+CD45RO+T-лимфоцитов (8,1±2,4) было повышено по сравнению с донорами (7,1±1,6; 6,0±1,3 соответственно, p < 0,05). Интересно отметить, что у этих больных содержание лимфоцитов с фенотипом CD4+CD45RO+ (73,2±13,1) также отличалось от показателей в контрольной группе (62,5±10,5, p < 0,05). При этом число CD4+CD25+FoxP3+Treg-клеток у больных было на уровне контроля.
Также в группе больных обнаружена положительная корреляция между уровнем CD4+FoxP3+CD45RO+ клеток и с Treg-ассоцироваными фенотипами: CD4+CD25+FoxP3+, CD4+FoxP3+ (r = 0,54, p < 0,02; r = 0,7, p < 0,01 соответственно).
Заключение. Повышенное содержание клеток памяти, вероятно, может указывать на антигенспецифическую экспансию клеток в ответ на повторяющиеся, системные воздействия антигена у больных РА. Обнаружена четкая положительная корреляция между клетками памяти и фенотипами, ассоциированными с Tregs. Возможно, Т-клетки памяти при РА характеризуются хроническим состоянием активации и представляют собой постоянный источник конверсии в Treg, что позволяет считать эти клетки перспективной мишенью для иммунотерапии.
Финансирование проекта осуществлялось на средства федерального бюджета на выполнение государственного задания № 0221-2014-0040 и при поддержке гранта РФФИ а № 16-04-00567.
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ СЕМЕЙСТВА IL-1 У БОЛЬНЫХ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИМ ЯЗВЕННЫМ КОЛИТОМ
Сташкевич Д.С.1, Петрова Е.О.1, Василенко А.Г.2, Суслова Т.А.3, Бурмистрова А.Л.1
1ФГБОУ ВО «Челябинский государственный университет», Челябинск, Россия
2 ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница», Челябинск, Россия
3 ГБУЗ «Челябинская областная станция переливания крови», Челябинск, Россия
Введение. Неспецифический язвенный колит (НЯК) — хроническое мультифакторное заболевание толстой кишки, характеризующееся иммунным воспалением ее слизистой оболочки и повышенной экспрессией основных провоспалительных цитокинов TNFa, IL-1, IL-6 (Lakatos P.L., 2006). Генами-кандидатами НЯК могут выступать гены про/противовоспалительных цитокинов, прежде всего гены семейства IL-1 (Воробьев Г.И., 2008). Однако результаты геном-ассоциированных исследований, посвященных оценке генетической составляющей НЯК носят противоречивый характер (Nemetz A., 1999; Воробьев Г.И., 2008; Lopez-Hernandez R., 2015). В связи с вышеизложенным, целью исследования явился сравнительный анализ распределения частот встречаемости аллельных вариантов, генотипов и гаплотипов полиморфизма генов IL-ф +3953C/T и IL-1ra VNTR у больных неспецифическим язвенным колитом и здоровых лиц русской популяции Челябинской области.
Материалы и методы. Группа больных НЯК — пациенты ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница» (139 человек). Группа сравнения — потенциальные доноры стволовой клетки крови русской популяции (213 человек) ГБУЗ «Челябинская областная станция переливания крови». Принадлежность к популяционной группе определялась по данным генеалогического анамнеза до третьего поколения (согласно рекомендациям Международного Симпозиума, 1980 г., Лос-Анджелес). Методы исследования: выделение ДНК из образцов периферической крови с использованием реагентов PROTRANS DNA Box 500. Прямая ПЦР-амплификация для VNTR во втором интроне гена IL-1ra (реактивы ИХБФМ СО РАН, г. Новосибирск), аллель-специфическая ПЦР для SNP в полиморфном сайте +3953C/T IL-1P (реактивы ООО НПФ «Литех», Москва), с последующей УФ-детекцией результатов в 3% агарозном геле. Статистическая обработка. Критерии для анализа: частота аллеля, генотипа, частоты гаплотипов (H) и параметры неравновесного сцепления (D, p). Подсчет частот гаплотипов проводился в программе Arlequin 3.5 (Excoffier L., 2010). Достоверность различий оценивалась с помощью критерия Пирсона (%2), точного двустороннего критерия Фишера. Во всех случаях различия считали статистически значимыми при р < 0,05.
Результаты. Наблюдаемые в исследовании частоты аллелей и генотипов в выборках больных НЯК и условно здоровых лиц соответствуют ожидаемым согласно закону Харди—Вайнберга.
На первом этапе был проведен анализ распределения частот встречаемости аллелей и генотипов генов IL-1P, IL-1ra. В группе больных НЯК отмечено незначительное снижение частоты встречаемости аллеля с заменой+3953*Т IL-1P (20% vs 24% p = 0,27) за счет снижения носителей гомозиготного генотипа (2,8% vs 6,6% p = 0,096, тенденция). Распределение частот аллелей и генотипов IL- 1ra не разли-
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Аутоиммунные заболевания Autoimmune diseases
чалось между исследуемыми группами. В группе больных представлены носители аллелей с 4-кратным, 2-кратным, 5-кратным повторами, но не встречались носители редкого аллеля с 3-кратным повтором, тогда как частота этого аллеля в контроле составила 0,5 %.
На втором этапе был проведен анализ распределения гаплотипов +3953 ГЬ-1р — Ш-1га и параметров сцепления. В группе больных НЯК было выявлено 6 гаплотипов, в группе сравнения — 8. Согласно параметрам сцепления аллель с заменой +3953*Т Ш-1р сцеплен с аллелем 4г Ш-1га (в группе НЯК D = 0,046; х2 = 17,6; р < < 0,01; в группе сравнения D = 0,039; х2 = 16,7; р < < 0,01), а предковый аллель +3953*С Ш-1р — с мутантным аллелем 2г Ш-1га (в группе НЯК D = 0,043; х2 = 15,4; р < < 0,01; в группе сравнения D = 0,039; х2 = 17,5; р < < 0,01). В обоих группах наиболее часто встречающимися были гаплотипы +3953*С — 2г (в группе НЯК Н = 0,25; в группе сравнения Н = 0,21), +3953*С — 4г (в группе НЯК Н = 0,52; в группе сравнения Н = 0,53), +3953*Т -4г (в группе НЯК Н = 0,19; в группе сравнения Н = 0,18). Отмечено незначительное снижение частоты встречаемости гаплотипа +3953*Т — 2г в группе больных НЯК, не имеющее прогностической значимости для восприимчивости к НЯК (Н = 0,022 ^ Н = 0,06; р = 0,14). В группе больных НЯК не было отмечено носителей редкого га-плотипа +3953*С — 3г.
Заключение. Проведенное исследование позволяет считать, что формирование предрасположенности/ устойчивости к неспецифическому язвенному колиту у русских Челябинской области, вероятно, не связано с исследуемыми генами.
ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО ОТВЕТА, ВЫЗВАННОГО Fc-ФРАГМЕНТАМИ ДО, НЕСУЩИМИ АНТИГЕННЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ ДЛЯ РЕГУЛЯТОРНОГО РЕВМАТОИДНОГО ФАКТОРА
Столярова Е.Ю., Сидоров А.Ю., Падерина Л.А., Чалый И.А.
ФГБОУ ВО «Удмуртский государственный университет», Ижевск, Россия
Введение. В недавно проведенных нами исследованиях, нацеленных на выяснение механизмов регуляции ауто-реактивных лимфоцитов был выявлен новый, ранее не известный, фактор негативной регуляции аутореактивности, препятствующий развитию экспериментально вызванных аутоиммунных заболеваний. Было показано, что данный фактор представляет собой антиидиотипические антитела к лимфоцитам против антигенов-индукторов экспериментально вызванных аутоиммунных заболеваний и в тоже время обладает специфичностью к неоантигенным детерминантам на Fc-фрагментах гомологичного IgG. Способность взаимодействовать с Fc-фрагментами IgG позволила отнести антиидиотипические антитела с регуляторными свойствами к ревматоидному фактору, который получил название регуляторный ревматоидный фактор (регРФ) (Beduleva, 2017). Было показано, что иммунизация Fc-фрагментами гомологичного IgG, стимулирующая продукцию регРФ, редуцирует симптомы артрита, подавляет продукцию аутоантител к коллагену в модели коллаген-индуцированного артрита крыс (Beduleva, 2017; МешЫко^ 2015), что, в свою очередь, позволяет рассматривать Fc-
фрагменты IgG, несущие антигенные детерминанты для регРФ, как основу принципиально новой перспективной вакцины для лечения артрита. Для разработки схемы иммунизации вакциной важно знать механизм активации лимфоцитов, продуцирующих регРФ, Fc-фрагментами IgG. Исследование кинетики продукции регРФ является подходом, позволяющим частично раскрыть механизм активации В-лимфоцитов, продуцирующих регРФ, предположить роль Т-хелперов в активации регРФ-продуцирующих лимфоцитов, вызываемой Fc-фрагментами IgG.
Цель и задачи. Провести сравнительный анализ кинетики регРФ в ответ на введение Fc-фрагментов IgG, несущих неоантигенные детерминанты для регРФ, и антител к аутологичным и гетерологичным Т-зависимым антигенам.
Материалы и методы. Кинетику продукции регРФ у крыс, вызванную Fc-фрагментами IgG крыс, сравнивали с кинетикой продукции антител к гетерологичным антигенам и аутоантигенам. Крыс "%1аг иммунизировали Fc-фрагментами IgG, несущими антигенные детерминанты для регРФ, в дозе 300 мкг, бычьим коллагеном II типа в дозе 400 мкг, основным белком миелина морской свинки в дозе 25 мкг, человеческим сывороточным альбумином в дозе 200 мкг, IgG человека в дозе 150 мкг. Все белки вводили внутрикожно, в составе эмульсии содержащей неполный адъювант Фрейнда (НАФ), кроме ОБМ, который вводили в составе полного адъюванта Фрейнда. Мышей иммунизировали аутоэритроцитами (4,5 х 108 клеток/мышь) внутрибрюшинно. РегРФ определяли методом агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов. Антитела к белкам определяли методом иммуноферментного анализа. Аутонтитела к эритроцитам мыши определяли в реакции Кумбса.
Результаты. Обнаружено, что при иммунизации крыс Fc-фрагментами IgG крыс, несущими антигенные детерминанты для регРФ, титр регРФ достигает максимума на 7 день после иммунизации, на 14 день снижается до исходного уровня. Титр антител к гетерологичным белковым антигенам (бычий коллаген II типа, основный белок миелина морской свинки, человеческий сывороточный альбумин, IgG человека) достигает максимума на 21-35 дни. Все исследованные антигены являются Т-зависимыми антигенами, что объясняет достижение максимума продукции антител против антигенов к 21-35 дню после иммунизации. Поскольку Fc-фрагменты IgG, несущие неоантигенные детерминанты для регРФ, могут рассматриваться как аутоантиген, была исследована также скорость нарастания аутоантител в крови мышей в ответ на введение аутоэри-троцитов. Титр аутоантител мыши к аутоэритроцитам достигал максимума на 15 день. В отличие от всех исследованных антигенов Fc-фрагменты, несущие антигенные детерминанты для регРФ, индуцируют быстрый и короткий иммунный ответ, что позволяет предполагать, что Fc-фрагменты, несущие антигенные детерминанты для регРФ, являются Т-независимым антигеном и активируют регуляторные, продуцирующие ревматоидный фактор В-лимфоциты без участия Т-хелперов.
Заключение. Продукция регРФ в ответ на введение Fc-фрагментов IgG, несущих антигенные детерминанты для регРФ, носит транзиторный характер с максимумом продукции на 7 день после иммунизации, что позволяет
