CC BY
14
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
деление зависимости эффективности ЭП от различных показателей.
Материалы и методы. В работе использовали мышей линии C57B1/6, в возрасте от 2 до 6 месяцев, которые были предоставлены ИЦИГ (г. Новосибирск). Костный мозг (КМ) для исследования получали из бедренных костей животного. Для получения культуры ДК клетки КМ культивировали в концентрации 1 млн/мл полной среды RPMI-1640, при добавлении 20 нг/мл GM-CSF и 20 нг/мл IL-4. Через 48 часов проводилась смена полной среды с повторным добавлением цитокинов без предварительного осаждения клеток. Для проведения электропорации ДК дважды отмывали раствором PBS и разводили до концентрации 20 млн/мл в холодном растворе OptiMem. Для проведения процедуры ЭП к 100 мкл ДК, добавляли необходимое количество плазмидной ДНК-конструкции, И проводили ЭП при различных вольтажах и длительности импульса. Сразу после ЭП клетки культивировали в полной среде в 48-луночном планшете в концентрации 1-2 млн/мл. Оценка эффективности электропорации проводилась по определению GFP-позитивных клеток. Жизнеспособность клеток оценивалась по включению пропидия йодида. Определение эффективности электро-порации ДК целевой плазмидой pMax-IL-10 проводилось по оценке внутриклеточного содержания IL-10 в ДК спустя 3 часа после ЭП при добавлении монензина и брефел-дина А, а также по продукции цитокина методом ИФА. Статистическая обработка результатов производилась при помощи программы GraphPadPrism 6.0.
Результаты. Показано, что использование 60 мкг/мл ДНК-плазмиды при силе импульса в 250 V и длине импульса в 5 мс являются оптимальными условиями, обеспечивающими повышение количества GFP-позитивных клеток при минимальной общей клеточной гибели. Определение условий культивирования после ЭП показало оптимальное распределение и количество проли-ферирующих клеток наблюдается при культивировании клеток в концентрации 2 млн/мл в смеси полной и кондиционной среды, в соотношении 1:1, при добавлении 20 нг/мл GM-CSF и 20 нг/мл IL-4. Использование данного протокола приводит к увеличению количества GFP-позитивных клеток до 50% при количестве жизнеспособных клеток 95%. Увеличение времени (10 ms и 15 ms) приводит к достоверному снижению количества GFP-позитивных клеток. Для оценки эффективности транс-фекции проводили определение внутриклеточной продукции IL-10 после трансфекции плазмидой pMaxIL-10. Было показано достоверное увеличение количества CD11c+IL-10+ ДК по сравнению с контрольными группами, что указывает на эффективность разработанного протокола. Также методом ИФА показана дозозависимая продукция IL-10 при электропорации ДК разными количествами плазмиды, кодирующей рмШ-10. По сравнению с ДК без электропорации, которые продуцируют IL-10 в очень низких концентрациях (4 пг/мл), даже минимальное количество плазмидной ДНК (1 мкг/мл) способствует увеличению продукции IL-10 в 224 раза (до 896 пг/мл), а использование больших концентраций плазмиды приводит к гиперпродукции IL-10 до 45 нг/мл. В течение 3 дней не наблюдается увеличение продукции IL-10, что говорит о пике продукции цитокина уже спустя 24 часа после электропорации.
Выводы. Разработанный протокол электропорации позволяет эффективно проводить трансфекцию дендритных клеток, обеспечивающую высокий уровень продукции целевого цитокина рмГЬ-10 при высокой жизнеспособности клеток. Полученные результаты могут быть использованы в дальнейшем для индукции толерогенных ДК со стабильным фенотипом, которые станут основой для разработки подходов к индукции трансплантационной толерантности в условиях ex vivo.
Работа поддержана РНФ. Соглашение. № 16-15-00086 от 11.01.2016.
ВЛИЯНИЕ ЦИТОКИНОВ НА ИНТЕНСИВНОСТЬ ЭКСПРЕССИИ ХЕМОКИНОВОГО РЕЦЕПТОРА CD184 ЕСТЕСТВЕННЫМИ КИЛЛЕРАМИ
Хохлова Е.В.1, Михайлова В.А.1, 2, Соколов Д.И.1, 2, Сельков С.А.1
1ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург, Россия 2 ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, Россия
Введение. Трансэндотелиальная миграция NK-клеток периферической крови является основным механизмом их пополнения в децидуальной ткани, где они играют важную роль с самых ранних этапов беременности. В миграции NK-клеток в децидуальную оболочку важную роль играет CXCL12 (SDF-1, stromal cell-derived factor-1). SDF-1 — хемоатрактант, который продуцируется клетками трофобласта и способствует привлечению NK-клеток в зону маточно-плацентарного контакта за счет связывания с рецептором CXCR4 (CD184), экспрессированным на NK-клетках. Целью исследования являлся анализ экспрессии рецептора CD184 клетками линии NK-92MI в присутствии цитокинов (TNFa, TGF-P).
Материалы и методы. Клетки линии NK-92MI культивировали с цитокинами TNFa, TGF-P в течение 24 часов при 37 °С в атмосфере 100% влажности, 5% СО2, после чего окрашивали антителами против рецептора CD184 (BD, США). Экспрессию рецептора оценивали при помощи проточного цитофлюориметра FacsCantoII (BD, США). Статистический анализ проводили в компьютерной программе Statistica 10, используя параметрический критерий Стьюдента (p < 0,05).
Результаты. Установлено, что при обработке клеток противовоспалительным цитокином TGF-P интенсивность экспрессии рецептора CD184 снижалась во всех исследуемых концентрациях по сравнению со спонтанным уровнем. Обработка провоспалительным цитокином TNFa увеличивала интенсивность экспрессии рецептора CD184 по сравнению со спонтанным уровнем.
Выводы. Провоспалительный цитокин TNFa и противовоспалительный цитокин TGF-P изменяют чувствительность NK-клетки к воздействию SDF-1 за счет изменения интенсивности экспрессии рецептора CD184, тем самым регулируя миграцию NK-клеток в ткани.
