CC BY
27
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
продукция которого обеспечивает устойчивость к развитию экспериментальных аутоиммунных заболеваний, а также ассоциирована с ремиссией последних и завершением нормального иммунного ответа (Beduleva, 2015; Sidorov, 2017). Однако механизм действия регуляторного ревматоидного фактора остается не ясен. Мы предполагаем, что регРФ предотвращает развитие экспериментально-вызванных аутоиммунных заболеваний и вызывает их ремиссию посредством сдерживания экспансии Т-хелперов специфичных к антигенам-индукторам аутоиммунных заболеваний и аутореактивных Т-хелперов, активирующихся в ответ на иммунизацию.
Цель и задачи. Проверить гипотезу о том, что регРФ сдерживает экспансию активированных Т-хелперов, специфичных к антигенам-индукторам аутоиммунных заболеваний, вызывая их гибель по механизму апоптоза.
Материалы и методы. Крыс Wistar иммунизировали основным белком миелина морской свинки (ОБМ) (Sigma). На 7 день после иммунизации забирали регионарные лимфатические узлы (л/у) и кровь. Измеряли цитофлуориметрически количество CD4+ и CD4+CD95+ лимфоцитов в периферической крови и л/у. В крови измеряли регРФ методом агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов. Клетки л/у иммунизированных крыс культивировали в течение 5 дней в присутствии ОБМ, затем клетки обрабатывали регРФ-содержащей сывороткой и определяли количество погибших клеток в том числе несущих маркеры апоптоза с помощью Annexin V Apoptosis Detection Kit FITC.
Результаты. Было показано, что у иммунизированных ОБМ крыс с относительно высоким уровнем регРФ в крови (регРФ+ крысы)относительное количество CD4+ лимфоцитов в л/у достоверно ниже (p < 0,05, критерий Манна-Уит-ни), чем у иммунизированных ОБМ крыс с низким уровнем регРФ (регРФ- крысы) (табл.). В крови исследуемых групп крыс уровень CD4+ лимфоцитов не отличается. Мы предполагали, что мишенью регРФ являются активированные CD4+ лимфоциты, несущие маркер CD95, опосредующий апоптоз, через взаимодействие с которым регРФ реализует свое цитотоксическое действие, и ожидали обнаружить у крыс с относительно высоким уровнем регРФ достоверное снижение количества CD4+CD95+ лимфоцитов по сравнению с крысами с относительно низким уровнем регРФ. Однако количество CD4+CD95+ лимфоцитов в л/у и крови у крыс с относительно высоким и относительно низким уровнем регРФ не отличается. Полученные факты свидетельствуют о том, что регРФ сдерживает экспансию активированных CD4+ лимфоцитов, но CD95 молекула не является мишенью для регРФ.
Обработка лимфоцитов л/у, культивированных 5 дней в присутствии ОБМ, сывороткой содержащей регРФ, полученной от крыс иммунизированных ОБМ, вызвала гибель лимфоцитов, но доля клеток, связывающих аннексин V, была незначительной. Сыворотка, содержащая регРФ, не вызывала гибель не активированных лимфоцитов.
Заключение.Таким образом, регуляторный ревматоидный фактор вызывает некроз активированных CD4+ лимфоцитов. CD95 не является мишенью для регуляторного ревматоидного фактора.
Работа поддержана грантом РФФИ 16-34-01154 мол_а.
ХАРАКТЕРИСТИКА ПОПУЛЯЦИЙ И КЛОНОВ NK-КЛЕТОК, ПОЛУЧЕННЫХ ПУТЕМ СТИМУЛЯЦИИ ИНТЕРЛЕЙКИНОМ 2 И ГЕНЕТИЧЕСКИ-МОДИФИЦИРОВАННЫМИ ФИДЕРНЫМИ КЛЕТКАМИ К562, ЭКСПРЕССИРУЮЩИМИ МЕМБРАНОСВЯЗАННЫЙ ИНТЕРЛЕЙКИН 21
Стрельцова М.А., Ерохина С.А., Каневский Л.М., Коваленко Е.И.
ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, Москва, Россия
Стимуляция NK-клеток фидерными клетками К562, экспрессирующими на своей поверхности Ш-21 (К562-тЬШ21) в сочетании с Ш-2 индуцирует интенсивную пролиферацию натуральных киллеров, что может быть использовано для накопления NK-клеток в иммуно-терапевтических целях. Однако величина экспансии NK-клеток, полученных от разных индивидов, значительно варьирует. Одна из причин таких вариаций может быть связана с тем, что данная комбинация стимулов по-разному действует на клетки различной степени диф-ференцировки и активации. Чтобы ответить на этот вопрос, в настоящей работе указанный метод стимуляции был применен к индивидуальным NK-клеткам, предварительно охарактеристизованным по уровню экспрессии молекул CD56, CD57 и HLA-DR, с целью получения клонов NK-клеток из субпопуляций, различающихся по степени дифференцировки и активации. С помощью ци-тометрического анализа были дискриминированы субпопуляции наименее дифференцированных NK-клеток CD56Ьгight, промежуточных CD56dimCD57- и наиболее дифференцированных CD56dimCD57bright. В кластерах CD56Ьгight и CD56dimCD57- были дополнительно выделены субпопуляции клеток с фенотипом HLA-DR- и HLA-DR+. Единичные NK-клетки из пяти указанных субпопуляций были отсортированы в лунки 96-луночного планшета, содержащего Ш-2 и облученные клетки К562-тЬШ-21. Частота образования клонов NK-клеток, которую определяли через 3 недели культивирования, оказалась выше в субпопуляциях CD56Ьnsht, по сравнению с субпопуляциями CD56dim, а наименьшая частота оказалась в субпопуляции NK-клеток, высоко экспрессирующих маркер терминальной дифференцировки CD57. Существеной связи экспрессии маркера «поздней» активации HLA-DR с эффективностью генерации клонов из данной субпопуляции не было выявлено. Фенотипический анализ полученных клонов показал, что, как правило, описанная стимуляция приводит к экспансии менее зрелых клеток, экспрессирующих рецептор NKG2A с низким уровнем экспрессии CD57. Часть клеток клонов из субпопуляции CD57+ при культивировании утрачивало экспрессию этого маркера. Доля клонов, экспрессирующих ингиби-рующие рецепторы KIR2DL2/DL3, оказалась наиболее низкой в субпопуляции HLA-DR+, при этом экспрессия этих рецепторов значительно не менялась при культивировании клонов.
Таким образом, на клональном уровне охарактеризованы NK-клеточные культуры, полученные путем стимуляции с помощью Ш-2 и K562-mЬIL-21 №К-клеток с разным уровнем зрелости и активации. Показано, что в ответ на такую стимуляцию лучше пролиферируют менее дифференцированные клетки, а хуже — более дифференцированные. Полученные результаты могут помочь
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
в селекции NK-клеток, наиболее подходящих для потенциальной адоптивной иммунотерапии.
Работа выполнена при поддержке РНФ (грант № 1615-00309).
ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДНОЙ ТЕРАПИИ НА АКТИВНОСТЬ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ПРОЦЕССА В ЛЕГКИХ (НА МОДЕЛИ ХОБЛ У КРЫС)
Суркова Е.А., Лебедева Е.С., Кузубова Н.А.
ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, Россия
Введение. Согласно современным представлениям, эпителиоциты бронхов являются ключевыми эффектор-ными клетками в патогенезе хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), инициируя иммунную и воспалительную реакции, гиперсекрецию слизи и продукцию активных форм кислорода. Стимулирование эндогенных регенеративных возможностей для восстановления поврежденного эпителия при ХОБЛ может обеспечить длительный терапевтический эффект по сравнению с использованием традиционных кортикостероидов.
Цель. Оценить противовоспалительный и регенеративный эффект низкомолекулярной пептидной терапии на модели ХОБЛ у крыс.
Материалы и методы. Модель формирования ХОБЛ выполнена на крысах-самцах линии Вистар с помощью ингаляционного воздействия диоксида азота. Пептидную терапию проводили в течение месяца, используя препарат Бронхоген (ООО ХБО при РАН «Фирма Вита») — синтезированный тетрапетид, соответствующий полипептиду из слизистой бронхов животных. В пробах бронхоальве-олярной лаважной жидкости (БАЛЖ) определяли содержание TNFa, IL-8, нейтрофильной эластазы, матрикс-ной металлопротеиназы-12 (ММР-12), химазы тучных клеток, секреторного иммуноглобулина А (sIgA), сурфак-тантного протеина В (SP-B) методом ELISA.
Результаты. В БАЛЖ животных, не получавших пептидную терапию (контрольная группа), содержание нейтрофилов в 5 раз превышало интактное значение (25,9±4,1 и 5,2±0,5% соответственно, р < 0,05), а число лимфоцитов было в 2 раза больше, чем у интактных крыс (18,5±2,4 и 9,1±1,9% соответственно, р < 0,05). В лаважной жидкости контрольных крыс определялись повышенные концентрации провоспалительных цитокинов (TNFa и IL-8) нейтрофильной эластазы, ММР-12 и химазы тучных клеток, действие которой значительно усиливает деструктивный эффект на легочные структуры. Под влиянием применения Бронхогена происходило восстановление цитологического профиля БАЛ, который незначительно отличался от интактной группы: процентное содержание нейтрофилов снижалось по сравнению с контролем и составляло 9,0±1,2% (р < 0,05), возрастала доля макрофагов (76,5±2,02%, р < 0.05). Концентрации TNFa, IL-8, а также нейтрофильной эластазы и ММР-12 практически не отличались от показателей интактной группы, а уровень хи-мазы тучных клеток оказался в 2 раза ниже интактного. Нормализовалось содержание SP-B, что могло быть отражением восстановления секреторной функции альве-олоцитов 2-го типа. Значительно возрастала интенсив-
ность синтеза sIgA, превышая аналогичный показатель и в контрольной, и в интактной группе.
Заключение. Под влиянием пептидной терапии наблюдалось снижение активности нейтрофильного воспаления, которое сопровождалось восстановлением функциональной активности бронхиального эпителия, предупреждением аномального ремоделирования легочной ткани и связанных с ним тяжелых осложнений ХОБЛ.
АЛЬВЕОЛЯРНЫЕ МАКРОФАГИ И СУРФАКТАНТ ЛЕГКИХ ПРИ ДИСБАЛАНСЕ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКОЙ НЕЙРОТРАНСМИССИИ
Тимофеева М.Р., Лукина С.А.
ФГБОУ ВО «Ижевская государственная медицинская академия», Ижевск, Россия
Введение. Дисфункция дофаминергической системы является основой патогенеза нейродегенеративных и нервно-психических заболеваний, висцеропатий, сопровождающихся изменениями иммунного статуса организма (Крыжановский Г.Н. и соавт., 2010) и метаболических функций легких (Тимофеева М.Р. и соавт., 2015). Установлено, что альвеолярные макрофаги участвуют в реализации механизмов врожденного и адаптивного иммунитета, в катаболизме сурфактанта легких (Череш-нев В.А. и соавт., 2002). Вместе с тем, фосфолипиды сурфактанта стимулируют фагоцитарную активность альвеолярных макрофагов (Грачева Л., 1996; Ипатова О.М., 2005), а сурфактант-ассоциированные протеины модулируют их участие в иммунном ответе и секреции провос-палительных цитокинов (Sano H. et al., 2005).
Цель. Изучение фагоцитарной активности альвеолярных макрофагов и фосфолипидов сурфактанта при дисбалансе дофаминергической нейротрансмиссии, моделируемой введением допамина в боковой желудочек мозга и активацией стриатума без и при введении амантадина.
Материалы и методы. Опыты выполнены на наркотизированных крысах-самцах в соответствии с этическим кодексом (n = 77), в том числе ложнооперированных, с церебровентрикулярным введением допамина (в дозе 1,6 мкМ, через день, три недели) посредством канюль: P = 0,8; L = 1,5; V = 3,6, с имплантацией нанокобальта в стриатум: А = 1,7; L = 2,5; V = 5,5 и в сочетании с введением амантадина (ПК-Мерц, Германия; 1 мг/кг, через день, 2 недели, в/брюшинно). После окончания экспериментов определяли содержание фосфолипидов (Комаров Ф.И. и соавт., 1981) в бронхоальвеолярных смывах (БАС) и их поверхностную активность (метод Вильгельми), клеточный состав смывов и фагоцитарную активность альвеолярных макрофагов (АМ) по поглощению частиц монодисперсного латекса (01,5 мкм) с расчетом фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа. Фракционирование фосфолипидов проводили методом тонкослойной хроматографии. Статистический анализ выполнен в программе SPSS 17 с использованием критерия Шапиро— Уилка и U-критерия Манна—Уитни.
Результаты. Дисбаланс допаминергической системы, индуцированный введением допамина в боковой желудочек мозга, сопровождался повышением продукции фосфолипидов (p = 0,03) за счет фракции лизофос-фатидилхолина (p = 0,001), и фосфатидилэтаноламина (p = 0,02), фосфатидной кислоты (p = 0,001), что привело к снижению поверхностной активности сурфактанта (p = 0,001), но стимулировало фагоцитарную активность
