CC BY
16
УДК 577.338
ЭЛЕКТРОННЫЕ СТЕРИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ В АКТИВНОМ ЦЕНТРЕ МЕТАЛЛО-р-ЛАКТАМАЗЫ И РЕАКЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ ЦЕФАЛОСПОРИНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ
М.Г. Хренова1'2*, А.В. Томилко3, В.Г. Цирельсон1,3
(1ФИЦ Биотехнологии Российской академии наук; 2Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева; *e-mail: [email protected])
Представлены результаты изучения взаимосвязи электронных стерических факторов в активном центре металло-0-лактамазы и реакционной способности антибиотиков цефалоспоринового ряда. Стерическая энергия атома кислорода, образующего временную ковалентную связь в структуре переходного состояния лимитирующей стадии, характеризует реакционную способность соединений. Предложена линейная зависимость между этой величиной и макроскопическим параметром стационарной кинетики Михаэлиса-Ментен - каталитической константой кс^ (увеличение константы скорости связано с увеличением стерической энергии). Проанализированы распределения стерического потенциала и плотности стерической энергии электронов.
Ключевые слова: цефалоспориновые антибиотики, металло-р-лакгамазы, гидролиз, КМ/ММ, электронные стерические эффекты, стерическая энергия.
Изучение механизмов ферментативных реакций в рамках суперкомпьютерного моделирования комбинированным методом квантовой механики и молекулярной механики (КМ/ММ) становится все более доступным. Расчеты позволяют определить порядок следования элементарных стадий реакции, их энергетические барьеры и относительные энергии интермедиатов. В качестве основной характеристики рассматриваемой системы используется ее полная энергия, состоящая из вкладов квантово-механической (КМ), молекулярно-меха-нической (ММ) подсистем и энергии их взаимодействия. К настоящему моменту не проведено систематического изучения возможных ошибок в оценке энергетических барьеров, связанных с двумя последними членами. Ошибка определения энергии КМ подсистемы при изучении процессов на поверхности основного электронного состояния составляет порядка 2-5 ккал/моль для современных гибридных функционалов теории функционала плотности [1]. Переводя эти значения в шкалу констант скорости, получаем разброс в 304000 раз при комнатной температуре. Безусловно, при молекулярном моделировании выбираются те функционалы, которые лучше описывают именно интересующий тип реакции. В рамках изучения механизма химической реакции одного субстрата с одним ферментом также происходит частичная компенсация ошибок. На практике зачастую это
приводит к результатам, близким к экспериментальным данным [2-4]. Однако при изучении набора похожих реакций, например для серии родственных соединений в активном центре одного фермента, возникают сложности, вызывающие необходимость использования других критериев оценки реакционной способности. Ферментативные реакции с этой точки зрения практически не изучены, однако существует хорошо разработанный понятийный аппарат для того, чтобы характеризовать реакционную способность малых молекул в газовой фазе. Один из таких подходов основан на количественной оценке стерического эффекта - широко распространенного и интуитивно понятного термина в химии. Это явление связано с тем, что каждый атом занимает определенный объем и при образовании молекул, молекулярных комплексов и кристаллов возникают стерические затруднения, приводящие к изменению формы, энергии и реакционной способности взаимодействующих частиц.
В работе [5] предложен способ количественной оценки стерической составляющей энергии на основе перегруппировки членов в выражении для полной энергии системы в методе функционала плотности в виде:
Е[р] = Е,[р] + £>] + £[р],
где ЕГр], Е ,[р] и ЕГр] - компоненты энергии,
описывающие вклады стерических, электростатических и квантовых эффектов. Квантовые эффекты складываются из обменно-корреляционного энергетического члена Ехс[р\ и энергии Паули
ЕРаиМ = - ТШ[Р1
представляющей собой разность положительно определенной кинетической энергии невзаимодействующих электронов Т5[р\ и кинетической энергии Вайцзаккера Тж[р\.
Сравнивая такое представление полной электронной энергии с традиционной записью
Е[р\ = ад + Ее1[р\ + £>],
получаем, что стерическая энергия равна кинетической энергии Вайцзаккера [6\:
е[р]=т*[р]=8 ^т"
Стерическая энергия в таком представлении имеет следующий физический смысл. Величина Тш[р\ определяет кинетическую энергию электронов в гипотетическом бозонном состоянии с электронной плотностью реального фер-мионного состояния. Этот член представляет собой энергетическую меру собственного размера системы в случае, когда квантовые и электростатические взаимодействия полностью исключены. Концепция стерического потенциала и стерической энергии электронов успешно применяется для описания конформационных
изменений в небольших молекулах [7\, реакций 8^2-типа в газовой фазе [8\, взаимодействий атомных групп в кристаллах [9\ и др.
В данной работе рассматривается реакция гидролиза соединений цефалоспоринового ряда в активном центре Ь1 металло-Р-лактамазы (МрЬ) из бактерии маЬорЫИа. Задача поиска надежного способа оценки констант скорости этого процесса имеет прикладное значение. Цефалоспориновые антибиотики связываются с пенициллин-связыва-ющими белками и блокируют их функцию строительства клеточной стенки бактерии, что приводит к ее разрушению. Однако Р-лактамазы способны гидролизовать антибиотики, а образующиеся продукты гидролиза не проявляют себя как ингибиторы пенициллин-связывающих белков. Возникает задача разработки новых соединений, которые медленно гидролизуются или не гидролизуются Р-лактамазами. Реакция гидролиза цефалоспори-новых соединений Ь1 МрЬ проходит через три элементарные стадии [2\. Последняя стадия (лимитирующая), согласно экспериментальным данным [10\, определяет скорость всего процесса. Она включает в себя перенос протона с аспарагиновой кислоты активного центра на атом азота субстрата, а в структуре переходного состояния образуется временная ковалентная связь атома кислорода субстрата и переносимого протона (рис. 1). Экспериментальные значения каталитических констант изменяются в пределах двух порядков, т. е. их различия попадают в коридор ошибок метода КМ/ММ.
Рис. 1. Слева молекулярная модель для расчетов методом КМ/ММ. КМ-подсистема показана Ван-дер-Ваальсовыми сферами, молекулы воды - линиями, белковая макромолекула - схематично прозрачными лентами и цилиндрами; во врезке показана структура антибиотика в переходном состоянии лимитирующей стадии. Справа рассчитанные методом КМ/ММ энергетические барьеры (квадраты) и экспериментальные значения энергетических барьеров (ромбы), полученные из кса4 по теории переходного состояния. Коридор ошибок для рассчитанных значений взят из работы [1\
и составляет 4,76 ккал/моль
Цель работы - определение ключевых взаимодействий и свойств атомов в молекулярных системах в рамках концепции стерического потенциала и стерической энергии электронов. Под ключевыми взаимодействиями и свойствами следует понимать те из них, которые определяют макроскопические свойства системы; в данном случае это каталитическая константа стационарной кинетики Михаэ-лиса-Ментен (kcat).
На основании результатов изучения механизма реакции окрашенного цефалоспорино-вого субстрата нитроцефина в активном центре L1 MßL [2] построены молекулярные модели еще пяти комплексов фермент-антибиотик. В качестве антибиотиков были выбраны цефок-ситин (kcat = 1,1 с-1), CGP-17520A (kcat = 8,5 с-1), CGP-31523A (kcat = 38 с-1), цефалоспорин C (kcat = 62 с-1) и цефуроксим (kcat = 80 с-1) [10, 11]. Для каждой из модельных систем проводили замену нитроцефина на один из изучаемых антибиотиков. Так были получены 6 модельных систем (рис. 1), в которых с помощью метода КМ/ММ в варианте PBE0-D3/cc-pvdz/AMBER проводили поиск переходного состояния лимитирующей стадии реакции (TS), аналогично проведенному в работе [2]. Далее проводили спуск в минимум, соответствующий интермедиату (Int) реакции, предшествующему лимитирующей стадии.
Для полученных систем проводили расчет энергетических барьеров. Из рис. 1 видно, что монотонная зависимость между экспериментальными значениями констант скорости (kcat) и рассчитанным барьерами лимитирующей стадии отсутствует. Прямое сопоставление эффективного параметра kcat с константами скорости элементарных стадий - задача в общем случае не тривиальная. Однако в работе [2] показано, что для данной реакции эффективная константа скорости всего процесса в целом определяется исключительно константой скорости лимитирующей стадии в прямом направлении. Поэтому правомерно определение барьера лимитирующей стадии из экспериментальной константы скорости по теории переходного состояния. Из рис. 1 видно, что диапазон изменения энергетических барьеров, полученных из kcat, значительно уже, чем для рассчитанных значений. Часть экспериментальных значений попадает в коридор ошибок рассчитанных величин, взятых из работы [1], часть - нет. Однако на основании этого нельзя считать метод КМ/ММ неправильным, полученные результаты лишь указывают на необходимость их более тщательного анализа. В частности, для систем с наибольшими различиями между экспериментальны-
ми и рассчитанными энергетическими барьерами наблюдается значительное изменение энергетического вклада от ММ части между стационарными точками, что вносит дополнительную неконтролируемую ошибку. В случае, когда изучается одна химическая реакция, проводится множество расчетов с варьированием и выбором оптимальной КМ-подсистемы. Тщательно контролируются все энергетические вклады в полную энергию системы и проводится множество дополнительных расчетов для полной релаксации системы, в том числе и шапки из молекул воды, окружающей белок. В этом случае удается получить рассчитанные параметры, которые хорошо согласуются с экспериментом. Так, например, в случае гидролиза нитроцефина экспериментально оцененный энергетический барьер составляет 15,7 ккал/моль, а рассчитанный - 16,8 ккал/моль [2].
Перейдем к детальному анализу микроскопических свойств активного центра в структуре переходного состояния в области водородной связи 0-Н...Н (рис. 1): плотности стерической энергии, стерического потенциала и значений стерической энергии, рассчитанных для отдельных атомов, определяемых по рецепту квантовой теории атомов в молекулах Бейдера [13]. Согласно работе [5], стерический потенциал определяется как производная стерической энергии по электронной плотности р(г):
(r ) =
Щ [р] = 1 |Vp(r)2 _ 1 V2p(r) 5р 8 р2 (r) 4 p(r) .
Градиент стерического потенциала, взятый с обратным знаком, определяет стерическую силу, действующую на инфинитезимальный объем электронной плотности в точке г, а силовое поле показывает пространственное распределение напряжения в молекулярной системе, вызванное сте-рическим (т.е. объемным) фактором.
На рис. 2 представлены двумерные карты электронного стерического потенциала и соответствующие векторные силовые поля для структур переходного состояния с самым быстрым (цефуроксим) и медленным (цефокситим) из рассматриваемых субстратов. Из карт видно, что стерические силы действуют на электроны в направлении ядер, просматриваются межатомные границы, где направление сил меняется. Положительные значения стерического потенциала показывают области, где электрон может находиться в классическом смысле. Отрицательные области стерического потенциала отвечают потенциальным барьерам, где электрон проявляет квантовое поведение.
Рис. 2. Двумерные карты электронного стерического потенциала и соответствующие силовые поля в плоскости 0-Н...М для структур переходного состояния с самым быстрым (цефуроксим, справа) и медленным (цефокситим, слева) субстратами. Изолинии -0,8; -0,2; -0,08; -0,02 показаны пунктиром; 0,002; 0,008; 0,02; 0,08; 0,2; 0,8 - сплошными, контурные линии -0,525 и -0,415 выделены фигурными линиями. Стрелками показаны стерические силы, действующие на электроны. Здесь и на следующем рисунке все значения приведены в атомных единицах
Я, А Я, А
Рис. 3. Двумерные карты плотности стерической энергии в плоскости 0-Н...М для структур переходного состояния с самым быстрым (цефуроксим, справа) и медленным (цефокситим, слева) субстратами. Изолинии 0,008; 0,02; 0,08; 0,2; 0,8; 2, 8 показаны сплошными линиями, контурные линии 0,0015 и 0,0025 выделены фигурными
линиями
Соответственно, области более отрицательного При сравнении карт стерического потенциала бы-потенциала создают стерические затруднения строго и медленного субстратов отчетливо видны (барьеры), препятствуя движению электрона. различия в области водородной связи. Для медлен-
Рис. 4. Взаимосвязи наблюдаемой каталитической константы kcsí и стерической энергии атомов О (справа), N (слева внизу) и Н (слева вверху) в структуре переходного состояния лимитирующей стадии для шести модельных систем
Ь1 Мрь - цефалоспориновое соединение
ного субстрата характерны менее отрицательные барьеры в районе связи ^..Н и область взаимодействия между этими атомами со значениями потенциала, превышающими -0,415 а. е. Для быстрого субстрата водородная связь слабее, о чем свидетельствуют более отрицательные значения стерического потенциала. В частности, «канал» стерического взаимодействия характеризуется более отрицательными значениями потенциала, превышающими -0,525 а. е.
На рис. 3 представлены двумерные карты плотности электронной стерической энергии
и
(, 1 Мт!
(Г)_ 8 Р(г)
Для быстрого субстрата в области водородной связи ^..Н наблюдаются более низкие значения плотности стерической энергии, чем для медленного субстрата, что свидетельствует о более слабых взаимодействиях в более реакционноспособных системах.
Критерием реакционной способности соединения может служить стерическая энергия атома [9]. Поэтому для всех рассматриваемых систем в структурах переходного состояния лимитирующей стадии и предшествующего интермедиата рассчитывали стерические энергии для каждого из атомов, для этого интегрировали плотность стериче-ской энергии по атомным бассейнам. Последние в рамках квантово-топологической теории атомов в
ства, ограниченные поверхностью нулевого потока градиента электронной плотности [13]. Ни для одного из атомов в структурах интермедиата не найдено зависимости каталитической константы от значения стерической энергии. Для структуры переходного состояния на рис. 4 приведены значения стерической энергии атомов водорода, кислорода и азота, формирующих водородную связь, обсуждаемую в работе. Видно, что только для атома кислорода наблюдается такая зависимость. Ее можно трактовать следующим образом: увеличение стерической энергии атома кислорода свидетельствует об увеличении на нем стерического напряжения. В результате ковалентная связь рвется с большей готовностью, что приводит к увеличению каталитической константы.
Таким образом, в работе показано, что стери-ческие эффекты, количественно представленные в терминах электронной стерической энергии атома О, плотности стерической энергии и сте-рического потенциала, характеризуют реакционную способность цефалоспориновых соединений в активном центре Ь1 металло-р-лактамазы. Для более реакционноспособных соединений в структуре переходного состояния лимитирующей стадии наблюдаются области менее выгодные для нахождения электронов в области водородной связи N.. .Н. Стерическая энергия атома кислорода, формирующего водородную связь О-Н .. N выступает мерой реакционной способности в рассматриваемом процессе.
молекулах представляют собой области простран-
Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект № 18-74-10056) с использованием оборудования Центра коллективного пользования сверхвысокопроизводительными вычислительными ресурсами МГУ имени М.В. Ломоносова [14].
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Mardirossian N., Head-Gordon M. // Mol. Phys. 2017. Vol. 115. N 19. P. 2315.
2. Khrenova M.G., Nemukhin A.V. // J. Phys. Chem B. 2018. Vol. 122. N 4. P. 1378.
3. Khrenova M.G., Grigorenko B.L., Kolomeisky A.B., Nemukhin A.V. // J. Phys. Chem B. 2015. Vol. 119. N 40. P. 12838.
4. Khrenova M.G., Kulakova A.M., Nemukhin A.V. // Org. Biomol. Chem. 2018. Vol. 16. N 40. P. 7518.
5. Liu S.B. // J. Chem. Phys. 2007. Vol. 126. 244103: 1-5.
6. von Weizsäcker C.F. // Z. Phys. 1935. Vol. 96. P. 431.
7. Liu S.B. // J. Phys. Chem. A. 2013. Vol. 117. N 5. P. 962.
8. Wu W.J., Wu Z.M., Rong C.Y., Lu T., Huang Y., Liu S.B. // J. Phys. Chem. A. 2015. Vol. 119. N 29. P. 8216.
9. Tsirelson V.G., Stash A.I., Liu S. // J. Chem. Phys. 2010. Vol. 133. 114110: 1-6.
10. McManus-Munoz S., Crowder M.W. // Biochemistry. 1999. Vol. 38. N 5. P. 1547.
11. Crowder M.W., Walsh T.R., Banovic L., Pettit M., Spencer J. // Antimicrob. Agents Chemother. 1998. Vol. 42. N 4. P. 921.
12. Felici A., Amicosante G. // Antimicrob. Agents Chemother. 1995. Vol. 39. N 1. P. 192.
13. Bader R.W.F. Atoms in Molecules: A Quantum Theory. Oxford, 1990.
14. Sadovnichy V., Tikhonravov A., Voevodin V., Opanas-enko V. "Lomonosov": Supercomputing at Moscow State University. Contemp. High Perform. Comput. From Petascale Towar. Exascale. 2013. P. 283.
Поступила в редакцию 08.12.2018 Получена шсле доработки 15.12.2018 Принята к публикации 15.01.2019
ELECTRONIC STERIC FACTORS IN THE ACTIVE SITE OF METALLO-P-LACTAMASE AND REACTIVITY OF CEPHALOSPORIN ANTIBIOTICS
Khrenova M.G.1,2, Tomilko A.V.3, Tsirelson V.G.1,3
(1 Federal Research Centre "Fundamentals of Biotechnology" of the Russian Academy of Sciences; 2 Lomonosov Moscow State University;3 Dmitry Mendeleev University of Chemical Technology of Russia; *e-mail: [email protected])
The paper presents the results of the study of the relationship of electronic steric factors in the active site of metallo-p-lactamase and reactivity of cephalosporin antibiotics. The steric energy of the oxygen atom forming a temporary covalent bond in the structure of the transition state of the limiting stage characterizes the reactivity of the compounds. A linear relationship between this value and the macroscopic parameter of the stationary kinetics of Michaelis-Menten - catalytic constant Acat is proposed: the increase in the rate constant is associated with an increase in steric energy. Two-dimensional maps of steric potential and steric energy density are analyzed.
Key words: cephalosporin antibiotics, metallo-p-lactamases, hydrolysis, QM/MM, electronic steric effects, steric energy.
Сведения об авторах: Хренова Мария Григорьевна - вед. науч. сотр. лаборатории химической кибернетики кафедры физической химии химического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова; руководитель группы молекулярного моделирования ФИЦ Биотехнологии РАН, докт. физ.-матем. наук ([email protected]); Томилко Анастасия Викторовна - студентка кафедры квантовой химии Института химии и проблем устойчивого развития РХТУ имени Д.И. Менделеева ([email protected]); Цирельсон Владимир Григорьевич - профессор, зав. кафедрой квантовой химии Института химии и проблем устойчивого развития РХТУ имени Д.И. Менделеева, докт. физ.-матем. наук ([email protected]).
