CC BY
11
Научни трудове на Съюза на учените в България-Пловдив, серия Г. Медицина, фармация и дентална медицина t.XVI. ISSN 1311-9427. Научна сесия „Медицина и дентална медицина", 31 Октомври - 1 Ноември 2014. Scientific researches of the Union of Scientists in Bulgaria-Plovdiv, series G. Medicine, Pharmacy and Dental medicine, Vol.XVI, ISSN 1311-9427 Medicine and Stomatology Session, 31. October- 1. November 2014.
ЕЛЕКТРО-ОПТИЧНО ИЗСЛЕДВАНЕ НА ВЛИЯНИЕТО НА йОННАТА СИЛА ВЪРХУ МЕжДУКЛЕТЪЧНОТО ВЗАИМОДИйСТВИЕ, СТЕПЕНТА НА ОРИЕНТАЦИЯ И ВРЕМЕТО ЗА ДЕЗОРИЕНТАЦИЯ НА ЕРИТРОЦИТИ И. Дженев
Медицински университет - София, Катедра по Медицинска Физика и Биофизика, e-mail: [email protected]
Резюме
Използван е електро-оптичен (ЕО) метод за ориентация на еритроцити, като се измерват параметрите на разсеяния светлинен поток (с Х=670 nm), под ъгъл от 40 . Консервирани човешки еритроцити са отделени и ресуспендирани в: 1) фосфатен буфер (PBS) (pH=7.4±0.05, I=0.171 mol/l, п=(300±5).10-3 Osmol/kg), 2) 10% захарозен разтво^ (pH = 6.8±0.05, п=(290±6).10 Osmol/kg), с крайна обемна концентрация - Hct = 10 , 10 , 10 , 10 и 10 при 25 C. Промяната в деформируемостта на еритроцити е предизвикана чрез въздействие с глутаралдехид (GA) с нарастваща концентрация (10 mol/l, 10 mol/l и 10 mol/l).
Установено е : 1) корелативна връзка между резултатите от проведените експериментите в изотонични разтвори на захароза и PBS; 2) пропорционално намаляване на времето за дезориентация (характеризиращо относителната клетъчна деформируемост), под действие на "Брауновата бомбардировка", при нарастване на обемната клетъчна концентрация; 3) пропорционално намаляване на електричната поляризуемост с нарастване на йонната сила на суспензионната среда, вероятно дължащо се на екраниращия ефект на йоните върху повърностния електричен заряд на еритроцитите. Наблюдаваното намаляване на времето за дезориентация, може да се свърже с увеличение на междуклетъчните сили на взаимодействие.
Въведение
ЕО метод за измерване на относителна деформируемост, електрична поляризуемост и размера (диаметъра) на еритроцити е по-бърз, консумира малко кръв ( << 300 д1 ), резултатите от всяко измерване имат голяма статистическа достоверност поради едновременното, сумарно отчитане на ефекта от голям брой клетки (10 клетки) и е по-удобен, отколкото широко разпространените стандартни процедури. Оптимизирани са условията за ЕО изследване на еритроцити: дължина на светлинната вълна Х=670 nm, ъгъл на наблюдение 9=40°, честотата на приложеното електрично поле 1 kHz, интензитет на електричното поле Ер-р=10 V/m, концентрация на еритроцити 10 сеНяМ^ рН=6.8-7.4, осмотично налягане п=(289-300).10 Osmol/kg, йонна сила I=10 mol/l и температура 25 C.
Материали и методи
Използван е ЕО метод [1,2] за ориентация на еритроцити, като се измерват параметрите на разсеяния светлинен поток (с Х=670 nm), под ъгъл от 40о.
Консервирани човешки еритроцити са отделени и ресуспендирани с крайна обемна концентрация - Hct = 10 , 10 , 10 , 10 и 10 при 25oC в:
- фосфатен буфер (PBS) (Merk): 0.1512 mol/l - NaCl,
5.6 10-3mol/l - KCl, 3.2 10-4
mol/l - NaH2PO4.2H2O and 5.48 10-mol/l - Na2HPO4.12H2O; pH=7.4±0.05, I=0.171 mol/l, n=(300±5).10-3 Osmol/kg),
- захароза (Merk): 10% разтвор (pH=6.8±0.05, I=10-4 mol/l, n=(290±6).10-3 Osmol/kg),
- глутаров алдехид (GA) (BDH, UK): с нарастваща концентрация (10 mol/l, 10 mol/l и 10 mol/l), предизвикващ промяна в деформируемостта на еритроцитите.
ЕО апаратура използвана при експериментите е представена на фиг. 1. 21 и 10 19 7D ffl. 29 20 2J_ 26
Фиг. 1. Принципна схема на ЕО апаратура: 1 - източник на светлина; 2 - топли-нен филтър; 3 - кондензор; (4, 13, 15) - бленди; 5 - обектив; 6 - сменяеми интерференчни светлинни филтри; 7 - плоскопаралелна пластинка; 8 - плоскопаралелна пластинка за компенсиране на поляризацията от пластинката 7; 9 - неутрални филтри с различна плътност; (10, 14, 18,19) - подвижни поляроиди; 11 - проектив; 12 - измервателна клетка от молибденово стъкло; (16, 17, 29) - фотоелектрични умножители; (20, 26) - плоски огледала; (21, 22, 30) - електромагнитни щори; 23 - температурни датчици; (24, 25) -термостатиращи кожуси.
Електричната поляризуемост на еритроцитите може да бъде изчислена по формулата на Schwarz [3, 4]: у = (10.2 .к.Т.т) / (E2.tH), където: т - време за дезориентация (1Е - 0.368. 1Е ); tH - време за ориентация( 10 - 0.632.1Е ); Е - интензитет на ориентиращото електрично поле (ефективна стойност).
Диаметърът на еритроцити се определя като използваме приближението за ротационния дифузионен коефициент на частицата: D = 0.1667.т. Съгласно формулата на Репт [5] за силно сплескан ротационен елипсоид с полуоси а и b (b >> а): D = 3.k.T.[16.n.n.b3(q-1-arctg q)] -1, където q = b / а е осевото съотношение на елипсоида и п е вискозитета на суспензията: определяме b = [3.k.T.(4.n. Dr) -1] 1/3 .
Еритроцитите не се деформират от приложеното електрично поле с нисък интензитет. При нашите експериментални условия, отговорна за дезориентацията на клетките е брауновата бомбардировка на повърхността им. Върху деформируемостта на еритроцитите оказват влияние: вискозитетът на цитоплазмата им; механичните характеристики, свързани с процеса на деформация и геометричните характеристики (размер, отношение между клетъчна повърхност и клетъчен обем) на тяхната мембрана. Обработването на клетките с GA премахва повърхностното трептене на еритроцитната мембраната. Хао-тичното ротационно движение на фиксираните клетки значително се забавя [6, 7], при
5
което се увеличава времето за дезориентация след изключване на електричното поле. По-гъвкавите клетки се дезориентират по-бързо, вероятно, защото по-голямата деформация на мембраните им се дължи на Брауновата бомбандировка [8]. Получените резултати са в съгласие с изследванията, при които намалява честотата на завъртанията на клетките, по време на седиментацията им в гравитационно поле[9]. Времето за дезориентация т се използва за количествена оценка на деформируемостта на клетките. Измерваме времето за дезориентация на фиксираните с GA клетки т и времето за дезориентация на контролата т . Ако нормираме скалата за относителна деформируемост D% , така че при концентрации над 10-4 mol/l GA, клетъчната деформируемост да е 0 %, а деформируемостта на нормалните еритроцити да е 100 %, възможно е да се определи относителното изменение на деформируемостта след въздействие с други фактори, включително ендотоксин. Тогава получаваме за D = т / т . Дефомационното съпротивление (нормираната ригидност) R
% ГА , Н
на клетките е равно на RH = т / т .
Резултати и обсъждане
Установена е корелативна връзка между резултатите от проведените експериментите в изотонични разтвори на захароза (фиг. 2) и PBS (фиг. 3). Върху деформируемостта на еритроцитите оказват влияние: вискозитетът на цитоплазмата им, геометричните им характеристики (размер, отношение между клетъчна повърхност и клетъчен обем). Времето за дезориентация под действие на "Брауновата бомбардировка", характеризира относителната клетъчна деформируемост. Намаляването му може да се свърже с увеличение на междуклетъчните сили на взаимодействие при нарастване на обемната клетъчна концентрация.
10г» NEMrtTOKrHT 1011 10 1 1 О'1
■с н ai
■с
10 %
О КОТТ^ОЛА □ - <1А 10 'tftOH
О о Л ID"- molj
О - OA lit HlLïH
iûc lû' nû* lüT
BÏUTIDQI1HA KOI1ULK] РЛЦ11.Ч [ctUi.-jril
Фиг. 2. Зависимост на ЕО ефект от концентрацията на клетъчната суспензия (при 25oC, Х=670 nm, v=103 Hz, 0=40°, I=10-4 mol/l, n=(290±6).10-3 Osmol/kg, pH=6.8±0.05) за хора при въздействие с GA с нарастваща концентрация (контрола - 0 mol/l, 10 mol/l, 10 mol/l и 10-2 mol/l). Wilcoxon test, p=0.005.
Фиг. 3. Зависимост на ЕО ефект от концентрацията на клетъчната суспензия (при
25oC, Х=670 nm, v=103 Hz, 0=40°, I=0.171 mol/l, n=(300±5).10-3 Osmol/kg, pH=7.4±0.05) за
хора при въздействие с GA с нарастваща концентрация (контрола - 0 mol/l, 10 mol/l, 10 -2
mol/l и 10 mol/l). Wilcoxon test, p=0.005.
Електричната поляризуемост на еритроцитите (при 25 C, Х=670 nm, v=10 Hz, 0=40, ефективна стойност на интензитета на ориентиращото електрично поле Е = 0.78 . 10 V/m)
-4 -27 2 eff -28 2
е изчислена; при йонна сила I=10 mol/l —> y = 2.68 . 10 F.m , у = 2.61 . 10 F.m
и I=0.171 mol/l
28 Contrl
-> у = 1.5 . 10- F.m, y
Contrl PBS
= 1.64 . 10 F.m . Намалението
на електричната поляризуемост с нарастване на ионната сила на суспензионната среда, вероятно се дължи на екраниращия ефект на Ионите върху повърностния електричен заряд на еритроцитите.
За изчисления среден диаметър на еритроцитите се получава 6.9 . 10 m.
Различията между експериментално измерените и изчислени стоИности може да бъде обяснено с приближения свързвани с различия на експерименталните методи на измерване и пресмятане на времето за дезориентация т и формата на еритроцита. Следователно решенията за т тук не могат да бъдат разглеждани като абсолютни величини.
.HHTeparypa
1. Stoylov S. P. (1971) Adv. Coll. Interface Sci., 3, 45
2. Stoylov S. P. (199l) Colloid Science, v. 5, Academic Press, London, p. 280.
3. Okagawa A., S. G. Mason (1977) J. Chem., 55, 4243-4256
4. Schwarz, G., E. Neumann, (1996) Biophys. Chem., 58, 1-210
5. Perrin F. (1934) J. Phys. Radium, 5, 497-511
6. Jay, A.W.L., P.B.J. Canham, , E. Tilsworth (1971) J. Cell. Physiol. 78, 319-332
7. Jay, A.W.L., P.B.J. Canham, (1972) J. Cell. Physiol. 80, 367-372
8. Dzhenev I., R. Petrova, S. Stoylov (1990) Cell Biophys., 16, 3, 160-168
9. Bitbol M. (1986) Biophys. J., 49, 1055-1068
