CC BY
10
Научни трудове на Съюза на учените в България-Пловдив, серия Г. Медицина, фармация и дентална медицина t.XVI. ISSN 1311-9427. Научна сесия „Медицина и дентална медицина", 31 Октомври - 1 Ноември 2014. Scientific researches of the Union of Scientists in Bulgaria-Plovdiv, series G. Medicine, Pharmacy and Dental medicine, Vol.XVI, ISSN 1311-9427 Medicine and Stomatology Session, 31. October- 1. November 2014.
ОПТИМИЗИРАНЕ НА УСЛОВИЯТА ЗА ЕЛЕКТРО-ОПТИЧНО ИЗСЛЕДВАНЕ НА ЕРИТРОЦИТИ И. Дженев
Медицински университет - София, Катедра по Медицинска Физика и Биофизика, e-mail: djenevin@abv.bg
Резюме
Електро-оптичният (ЕО) метод за измерване на относителна деформируемост, електрична поляризуемост и размера (диаметъра) на еритроцити е по-бърз, консумира малко кръв ( << 300 д1 ), резултатите от всяко измерване имат голяма статистическа достоверност поради едновременното, сумарно отчитане на ефекта от голям брой клетки (106 клетки) и е по-удобен, отколкото широко разпространените стандартни процедури. Оптимизирани са условията за ЕО изследване на еритроцити: дължина на светлинната вълна Х=670 nm, ъгъл на наблюдение 9=40°, честотата на приложеното електрично поле 1 kHz, интензитет на електричното поле Ер-р=104 V/m, концентрация на еритроцити 106 се11s/m1, рН=6.5-7.4, осмотично налягане п=289-300 mOsm°l/kg, йонна сила I=10-4 m°l/l.
Въведение и метод
Анизодиаметричните частици (такива са еритроцитите), поставени в електрично поле, под действие на индуцирания диполен момент на всяка от тях, се подреждат преобладаващо по посока на интензитета на електричното поле. Ориентацията и деформацията на частиците изменят оптичните свойства на системата, интензитета на разсеяната светлина. Относителното изменение на разсеяната светлина (ЕО ефект а) се определя от израза: а = ( 1Е - 10 ) / 10 ,където 1Е е интензитета на разсеяната светлина при наличие на електрично поле, а 10 - без електрично поле Stoylov [1]. Опитните данни за суспензия от еритроцити са получени при ъгъл на наблюдение 0=40° (фиг. 1).
Фиг. 1. Примерен запис на ориентация на еритроцитна суспензия (106 cell s/ml,
0=40°,
I = 10-4 mol/l, п=289±6 mOsmol/kg, рН=6.5, при температура 25 °C, Х=670 nm).
След изключване на електричното поле е необходимо време (т - време за дезориентация), за което клетките под действие на топлинното движение се връщат в
97
първоначалното си неподредено състояние.
Електричната поляризуемост на еритроцитите се изчислява по формулата на Schwarz [2, 3]: у = (10.2кТт) / (E2tH), където: т - време за дезориентация (1Е - 0.3681Е ); tH - време за ориентация( 10 - 0.6321Е ); Е - интензитет на ориентиращото електрично поле (ефективна стойност). Относителната деформируемост D%[4, 5]. Диаметърът на еритроцитите се изчислява по формулата на Ретп [6]: b = [3.k.T.(4.n. Dr) -1] - (1/3) .
Резултати и обсъждане
Зависимостта на ЕО ефект от концентрацията на клетъчната суспензия е представена на фиг. 2.
j XEMAIOKPIIT
ИИ irt-s in» in-з in-J inrl
ephtpouhtha к OH ue H tp A U И Я [tiih'iUj
Фиг. 2. Зависимост на ЕО ефект от концентрацията на клетъчната суспензия (
v=103 Ш, Ер-р=104 У^/т, 0=40°, 1=10-4 то1/1, п=289 ± 6 mOsmo1/kg, рН=6.5) за: 1-зайци, 2-хора.
Условието за еднократно пречупване на светлината, както и за еднократно разсейване на светлината от всяка частица, за подбраната от нас концентрация на еритроцити (106 ce11s/m1) е изпълнено (фиг. 2). И двете зависимости са линейни в областта на използваната от нас концентрация.
Избор на дължина на светлинната вълна (фиг. 3).
Фиг. 3. Спектрофотометрични абсорбционни спектри: 1 - оксихемоглобин, 2 - метахемоглобин, 3 - дезоксихемоглобин, 4 -10% захарозен разтвор.
От абсорбционните спектри на оксихемоглобин, метахемоглобин и дезоксихемоглобин можем да определим две области на измерване в зависимост от типа на експериментите: независима област от преобразуванията на хемоглобина (X > 670 пт) и конфомационна област. От абсорбционния спектър на захарозния разтвор (за използвания от нас честотен диапазон) се вижда, че абсорбцията му е приблизително равна на нула.
Избраният ъгъл на наблюдение 9=40° е оптимален, отговаря на следните изисквания: * - приближението на Релей-Дебай-Ганс за големи обекти е приложимо в по-голяма степен при избор на ъгли на наблюдение по-малки от 90°;
** - максимално различие между интензитетите на разсеяната светлина от захарозен разтвор 10% и еритроцитната суспензия при изотонични условия (фиг. 4);
*** - максимално различие между ЕО ефекти от захарозен разтвор и от еритроцитна суспензия.
Фиг. 4. Зависимост на интензитета на разсеяната светлина I от ъгъла на наблюдение 9 за: 1-бидестилирана вода, 2-захарозен разтвор (10%, 1=10-4 т°1/1, п=289±6 mOsmol/kg, рН=6.5), 3-еритроцитна суспензия 106 сеШ/т1, 1=10-4 т°1/1, п=289±6 mOsm°l/kg, рН=6.5).
Изследвана е зависимостта на ЕО ефект от честотата на приложеното
Фиг. 5. Дисперсионна зависимост на ЕО ефект за суспензии (106 cells/ml, I=10-4 mol/l, п=289±6 mOsmol/kg, рН=6.5) от: 1-заешки еритроцити; 2-човешки еритроцити.
99
Работната честота на полето 1 kHz е избрана от платото на дисперсионната зависимост и при нея имаме максимален ЕО ефект а.
Избор на интензитет на ориентиращото електрично поле. За човешки и заешки еритроцитни суспензии е изследвана зависимостта на ЕО ефект от квадрата на
Фиг. 6. Полева зависимост на ЕО ефект (v=103 Hz , 106 cells/ml, I=10-4 mol/l, n=289±6 mOsmol/kg, рН=6.5, 0=40°) за еритроцитни суспензии от: 1-зайци, 2-хора.
За експериментите ни бе избрана стойност на интензитета на електричното поле, лежаща в линейната област на полевата зависимост - Е = 104 V /m (Е _ =
7 р-р р-р v ей
0.71 . 104 V/m) . Изборът се определя от съображения за максимален ЕО ефект от изследваната суспензия.
Суспензионната среда трябва да отговаря на следните изисквания: * - малка проницаемост на молекулите през клетъчната мембрана. Това условие се изпълнява в голяма степен от избрания от нас разтвор на захароза (10%) ;
** - изотоничност на разтвора (п=260-320 mOsmol/kg). В нашият случай суспензионната среда има осмотично налягане п=289±6 mOsmol/kg;
*** - ниска йонна сила (поради апаратурните проблеми, свързани е естеството на метода на измерване) - I=10-4 mol/1; **** - рН=6.5 -7.4.
Цитирана литература
1. Stoylov S. P. (1971) Adv. Coll. Interface Sci., 3, 45
2. Okagawa A., S. G. Mason (1977) J. Chem., 55, 4243-4256
3. Schwarz, G., Neumann, E. (1996) Biophys. Chem., 58, 1-210
4. Bitbol M. (1986) Biophys. J., 49, 1055-1068
5. Dzhenev I., R. Petrova, S. Stoylov (1990) Cell Biophys., 16, 3, 160-168
6. Perrin F. (1934) J. Phys. Radium, 5, 497-511
