CC BY
9УДК 615.9: 547.963.32+577.1
С.Д. Иванов, С.Е. Колбасов, В.А. Ямшанов, Е.Г. Кованько, А.С. Монахов, М.В. Мелихова, А.С. Иванова, О.А. Вакуненко, К.Б. Стрельников
ЭКСПРЕССНАЯ ОЦЕНКА ТОКСИКОГЕНОМНЫХ ЭФФЕКТОВ НЕСИММЕТРИЧНОГО ДИМЕТИЛГИДРАЗИНА
ФГУН Институт токсикологии ФМБА России ФГУ Российский научный центр радиологии и хирургических технологий Минздравсоцразвития России, С.-Петербург
Разработан метод экспрессной прижизненной количественной характеристики токсикогеномных эффектов при физико-химических воздействиях на организм мелких лабораторных животных путем анализа содержания и структуры ДНК нуклеоидов лейкоцитов крови с помощью флуоресцентных красителей. Данный подход был применен для выявления токсикогеномных эффектов после воздействия несимметричного 1,1-диметилгидразина (нДМГ). В ранние сроки (24 ч) после однократного в/ж введения нДМГ крысам наблюдали (независимо от дозы воздействия — 70, 140 или 200 мг/кг) биохимические изменения, отражавшие увеличение степени апоптоза белых клеток крови. Через 1 месяц после однократного введения нДМГ у крыс, несмотря на определенное восстановление показателей, были зарегистрированы дозозависимые остаточные токсикогеномные эффекты. В результате хронического ингаляционного введения нДМГ (концентрация 100 мг/м3, ежедневно по 4 ч, в течение 1 мес.) у животных было отмечено повышение апоптотических реакций и увеличение числа разрывов в ДНК лейкоцитов крови.
Ключевые слова: содержание и структура ДНК нуклеоидов лейкоцитов крови, диметилгидразин, токсикогеномные эффекты.
Введение. Несимметричный 1,1-диметилгид-разин (нДМГ) является высокотоксичным веществом 1-го класса опасности [18]. Он вызывает отравление при любом пути поступления в организм: вдыхании паров, попадании внутрь с пищей, водой и через кожу. Адсорбция происходит довольно быстро, так у собак при нанесении на кожу нДМГ появляется в крови уже в течении 30 секунд [13]. Далее токсикант распределяется по всем органам и тканям и оказывает поли-тропное действие на организм, в том числе ней-ротоксическое, гемолитическое, гепатотропное. У людей описано 6 случаев жировой печени, связанной с повышением уровня аланинамино-трансферазы среди 26 лиц, работавших с жидким ракетным топливом (включающим как компонент нДМГ) в течение 5 лет [11]. Однако достаточного числа эпидемиологических наблюдений для человека пока не опубликовано.
В экспериментах выявлены, помимо общетоксического действия, канцерогенные и мутагенные эффекты нДМГ.
Относительно опухолеобразования известно, что ежедневное введение нДМГ в дозе 0,5 мг с питьевой водой 5 раз в неделю в течение 40 недель 25-ти самкам мышей линии Swiss приводило к образованию опухолей легких у 1 из 8-ми животных (с учетом множественности новообразований — 0,25 опухолей на мышь), погибших между 40 и 45 неделями, и у 4-х из 9-ти живот-
ных (2,6 опухолей на мышь), погибших между 50 и 60 неделями [12]. У 85 контрольных животных в те же самые периоды времени опухоли легких развились лишь у 3-х из 37-ми мышей (0,05 опухолей на мышь) и у 6-ти из 42-х животных (0,2 опухолей на мышь), то есть в 5—13 раз меньше.
Введение 0,01 % нДМГ с питьевой водой 50-ти самцам и 50-ти самкам мышей линии Swiss приводило к высокой частоте образования ан-гиосарком (79 %) в различных органах. Кроме того, наблюдались опухоли легких (71 %), почек (10 %) и печени (6 %). Средний латентный период различных опухолей был в пределах 42—61 недели [15, 16].
У крыс линии BD, получавших нДМГ с питьевой водой в дозе 70 мг ежедневно в течение жизни, через 540, 806 и 1100 дней (суммарные дозы 36, 60 и 82 г/кг массы тела) карциномы печени развились у 3-х из 20-ти животных [9].
Таким образом, имеющиеся данные свидетельствуют, что нДМГ является канцерогенным для мышей в случае орального введения препарата. Наблюдение небольшого числа опухолей печени после орального введение нДМГ в высоких дозах, имеющего место у крыс после длительного латентного периода, не позволяет должным образом оценить канцерогенный эффект у этого вида животных.
Мутагенный эффект нДМГ выражался в увеличении числа клеток с хромосомными абер-
рациями, преобладании хроматидных мостов и фрагментов. Мутации являются результатом нарушений репарации ДНК и представляют собой результат повреждающего воздействия физических, химических и биологических агентов на геном соматических и зародышевых клеток. При физико-химических воздействиях окружающей среды (относящимся, как правило, к низкодо-зовым воздействиям) нерепарированные токси-когеномные эффекты могут привести к отдаленным последствиям, связанным с нарушениями в системе кроветворения и в репродукции у человека и млекопитающих, увеличением частоты опухолеобразований, сокращению продолжительности жизни и т. д. Недавно было показано мутагенное действие нДМГ при его ингаляционном введении в высоких концентрациях — 205— 1028 мг/м3 самцам крыс различного возраста [4]. Однако выявление токсикогеномных реакций после поражающих воздействий в более низких дозах, что в перспективе может быть основанием прогнозирования отдаленных эффектов, сдерживается отсутствием подходящих методов.
Одним из часто используемых способов идентификации действия генотоксических агентов в организме мелких лабораторных животных является учет хромосомных аберраций в культивируемых лимфоцитах [5], но при массовых обследованиях использование цитогенетического метода осложняется трудоемкостью и длительностью анализа. Для статистически достоверной оценки генотоксичности какого-либо воздействия на достаточном числе тестируемых объектов желательно иметь чувствительный и вместе с тем более быстрый метод. В настоящее время для оценки токсикогеномных эффектов, наряду с давно апробированными методами (определением числа разрывов цепей ДНК, подсчётом хромосомных аберраций, микроядерным тестом), используются новые приемы: ряд показателей апоптоза, «кометный» тест, цитогенетиче-ский анализ в сочетании с флуоресцентной in situ гибридизацией (FISH-метод) и другие подходы, которые позволяют определить ранние и отсроченные повреждения в геноме на основании изменений содержания и структуры клеточной ДНК. Ранее нами было показано, что определение содержания ДНК нуклеоидов лейкоцитов крови с помощью флуоресцентных красителей может быть успешно применено для быстрой оценки генотоксичности в соматических клетках и диагностики лучевых поражений человека и животных [1-3].
Задачей настоящей работы явилось определение токсикогеномных эффектов нДМГ в крови крыс с использованием вновь разработанных способов, что даёт возможность существен-
но сократить общее время анализа после воздействия данного химического токсиканта.
Материал и методы исследования. Группа животных и их обработка. Методическая часть исследования была отработана в специально проведенном модельном эксперименте на крысах-самках (массой 160—180 г) в возрасте 4—5 мес. разводки питомника ФГУ «РНЦРХТ». Животные были разделены на 4 группы по 3—4 крысы в каждой. Контролем служили крысы, не подвергавшиеся никаким повреждающим воздействиям (1-я группа). Крыс 2 и 4-ой групп в качестве модельного повреждающего воздействия подвергали общему однократному рентгеновскому облучению в дозе — 25 сГр на аппарате РУМ-17 (напряжение 200 кВ, ток 15 мА, фильтр — 2мм Cu + 1 мм Al; мощность поглощенной дозы 0,16 Гр/мин). Крысы 3 и 4-ой групп в течение 3 мес. до рентгеновского воздействия и 1 мес. после облучения получали с питьевой водой ad libitum химический токсикант — соль ртути Hg2(NO3)2 в допустимой концентрации — 1 мкг/л в расчете на металл. Измерение цитогенетических и биохимических показателей проводили в одной и той же пробе крови через 4 мес. после начала эксперимента.
Для оценки токсикогеномных эффектов нДМГ препарат вводили беспородным белым крысам самцам массой 180—200 г внутрижелу-дочно (в/ж) в дозах: 1-я — 70 мг/кг (1/2 DL16), 2-я - 140 мг/кг (DL16) или 3-я - 200 мг/кг (DL50) однократно. В качестве стандарта при оценке токсикогеномных реакций применили метил-нитрозомочевину (МНМ) [19], растворённую в 50 % этаноле, в дозе 60 мг/кг массы тела.
Подострое воздействие осуществляли ин-галяционно при концентрации нДМГ равной 100 мг/м3. Эксперименты по оценке ингаляционной токсичности проводили на белых нелинейных крысах-самцах массой 160-180 г. Динамическое ингаляционное воздействие композицией осуществляли в камерах Б.А. Курляндско-го объёмом 107 л каждая. Для этого крыс-самцов помещали на промежуточный сетчатый пол камеры. В ходе экспериментов расход воздуха через камеру составлял 10 л/мин, время воздействия - 4 ч. Дозированную подачу аэрозоля с учетом сорбционных потерь на стенках камеры и в воздуховодах (40 %) осуществляли с помощью оригинального паро-аэрозольного дозирующего генератора гравиметрическим методом. В ходе эксперимента наблюдали картину интоксикации, фиксировали гибель животных в течение 14 дней после начала воздействия и проводили патологоанатомическое вскрытие погибших крыс. Среднесмертельную концентрацию ингаляционного воздействия рассчитывали ме-
тодом Литчфильда-Уилкоксона. В данных условиях она составляла 600 мг/м3.
Методы оценки токсикогеномных эффектов. Цитогенетический метод. Для определения количественных и структурных цитогенетических показателей в лимфоцитах крыс применяли по-лумикрометод культивирования цельной крови животных, как описано ранее [5]. Для этого 0,25—0,3 мл крови из хвостовой вены крыс, подвергнутых вышеупомянутым радиационно-ртут-ным воздействиям, культивировали в течение 70 ч при 37,6 °С и готовили метафазные препараты для хромосомного анализа. Визуализацию цитогенетического показателя проводили на микроскопе МБИ-15 под масляной иммерсией на метафазных пластинках при рутинном окрашивании хромосом. Учитывали клетки со всеми видимыми структурными (хромосомные и хро-матидные разрывы, транслокации, кольцевые хромосомы, ди- и трицентрики, парные и одиночные фрагменты) и количественными нарушениями (гиперанеуплоидию и полиплоидию). Анализировали не менее 100 клеток у каждого животного.
Биохимические методы анализа токсикогеномных эффектов. Другим способом оценки токсикогеномных эффектов в белых клетках крови являлся модифицированный нами метод, основанный на определении величин показателей ДНК нуклеоидов лейкоцитов крови, как описано ранее [2].
Величину показателя индекс ДНК (ИД) вычисляли как отношение концентрации ДНК (мкг/мл) к количеству лейкоцитов в 1 мл крови. Для этого пробы крови из хвостовой вены крыс объемом 0,02 мл обрабатывали в течение 3—5 мин 0,2 мл лизирующей смеси, предназначенной для получения нуклеоида. Состав смеси: 2,0 М NaCl, 0,1 М Ш2ЭДТА, 0,01 М трис, 0,5 % тритон Х-100, рН 8,0. Измерение содержания ДНК в лизированных пробах осуществляли флуориметрически с использованием 4',6-диа-мидино-2-фенилиндола (ДАФИ) (фирма «Serva» Германия) при конечной концентрации флуоро-хрома 0,1 мкг/мл. Вариации определявшегося нами ИД обусловлены изменениями количества флуорохрома, взаимодействующего с ДНК нук-леоида, который образовался в результате лизиса клеток в присутствии комплексона (Na2EDTA), в условиях высокой ионной силы (2М NaCl) и наличии детергента (тритона Х-100). Структура ДНК в нуклеоиде близка к нативной, но лишена комплексообразующих, белковых и ли-пидных компонентов, что облегчало связывание красителя с субстратом. Для учета условий измерений в лизатах крови, расчет количества ДНК в пробах осуществляли относительно введенно-
го в образец стандарта. В качестве его использовали обработанную ультразвуком ДНК тимуса теленка (фирма «Serva», Германия) в концентрации 25 мкг/мл [2].
Все измерения флуоресценции осуществляли в буфере - 0,01 М трис, 0,1 М NaCl, 0,01 М №2ЭДТА, рН 7,2-7,4 на спектрофлуориметре «Model 850» фирмы «Hitachi», Япония, или другом, имеющим для ДАФИ длину волны возбуждения — А,возб. = 350 нм и длину волны эмиссии — ^эм. = 450 нм.
Значение ИД лейкоцитов периферической крови интактных крыс (выраженные в пг/кл) принимали соответствующим диплоидному (2с) содержанию ДНК белых клеток крови. Если значение ИД было меньше 2с, то считали, что число клеток, имеющих количество ДНК меньше диплоидного, было увеличено за счет апоп-тозной гибели ДНК содержащих клеток крови. Такие изменения величин ИД были верифицированы путем параллельного анализа отдельных проб с помощью проточной цитометрии [1].
Увеличение величины ИД было обусловлено повышением количества клеток с анеупло-идным и тетраплоидным содержанием ДНК, что было определено путём цитогенетического анализа тех же проб [2]. Количественные изменения суммарного числа хромосомных аберраций в лимфоцитах после радиационно-ртутных воздействий, определённые в одной и той же пробе крови крыс с помощью хромосомного анализа лимфоцитов, и результаты определения ИД вышеописанным методом, основанным на флуо-риметрии ДНК нуклеоидов лейкоцитов, достаточно хорошо совпадали. Регрессионный анализ индивидуальных значений числа лимфоцитов с хромосомными аберрациями (%) и соответствующих значений ИД лейкоцитов крови позволил установить достоверную взаимосвязь между этими показателями:
ХрАб (%) = -2,03 + 0,39 • ИД (пг/кл); R = 0,820; p < 0,01.
Следовательно, предлагаемый способ определения суммарного числа хромосомных аберраций в лимфоцитах крови крыс после радиа-ционно-ртутных воздействий дает возможность оценить уровень генетических повреждений подобно цитогенетическому тесту.
Регрессионный анализ индивидуальных значений числа анеуплоидных и полиплоидных лимфоцитов (%) и соответствующих значений ИД лейкоцитов крови крыс позволил обнаружить более значимую (R = 0,992; p < 0,001) взаимосвязь между этими показателями:
ХрАбанеу+полипл (%) = 0,1 + 0,14 • ИД (пг/кл) Таким образом, вышеописанный способ определения ИД в лейкоцитах крови крыс после
модельных радиационно-ртутных воздействии даёт возможность определить как увеличение числа апоптотически гибнущих лейкоцитов, так и процент анеуплоидных и полиплоидных лимфоцитов.
Кроме того, для характеристики изменений структуры ДНК в пробах, лизированных в условиях получения нуклеоида, применили двух-параметровый критерий: один параметр был связан со степенью суперспирализации поли-нуклеотида, а другой отражал общее количество зондируемой ДНК. Для этого использовали специфические флуоресцентные зонды: этидий бромид - интеркалятор, у которого свечение в комплексе с ДНК зависит от степени сверхскрученности зондируемого субстрата [7], и ДА-ФИ — лиганд, при низких концентрациях связывающийся вдоль цепи ДНК неинтеркалирую-щим образом [8]. Ранее было показано, что изменения числа молекул этидий бромида, взаимодействующего с ДНК нуклеоида, обусловлены релаксацией суперспиральной структуры полинуклеотида, которая связана с разрывами его пентозофосфатных цепей после облучения [6]. Рабочая концентрация этидий бромида составляла 4,0 мкг/мл. Измерения интенсивности флуоресценции проб, окрашенных этидий бромидом, осуществляли при длине волны возбуждения — А,возб. = 510 нм и длине волны эмиссии — ^эм.= 590 нм, при окраске ДАФИ — как описано выше на флуоресцентном спектрофотометре «Model-850» («Hitachi», Япония).
Структурное состояние ДНК, зондируемой двумя флуорохромами, оценивали с помощью коэффициента относительной флуоресценции (КОФ), который рассчитывали по формуле:
КОФ = К • ИФбэ / ИФдафи,
где: ИФБЭ и ИФдАФИ — величины интенсив-ностей флуоресценции проб, окрашенных этидий бромидом и ДАФИ, соответственно, с вычетом фоновой флуоресценции; К — коэффициент, учитывающий разбавление проб и стандартной ДНК в кювете измерения, а также величины интенсивностей флуоресценции раствора стандарта.
Статистический анализ между количеством лимфоцитов с хромосомными и хроматидными разрывами и величиной КОФ ДНК лейкоцитов выявил достоверную взаимосвязь между измеренными параметрами (R = 0,827; p < 0,05):
ХрАбхром. разрывы (%) = -5,3 + 7,4 • КОФ (отн. ед.).
Количественное определение разрывов в ДНК лейкоцитов с использованием флуоресцентной индикации, включающей применение интеркалятора — этидий бромида, ранее также было осуществлено другими авторами [6], одна-
ко их подход требует гораздо больше материала для анализа, чем предлагаемый нами для определения КОФ. Для разработанного нами анализа необходимо всего 0,01—0,02 мл цельной крови, что позволяет использовать его для прижизненного анализа мелких лабораторных животных. Таким образом, определение величины КОФ позволяет определить число клеток с хромосомными и хроматидными разрывами и таким путём оценить уровень соответствующих токсикогенотомных эффектов.
Большинство тестов, используемых для выявления повреждающих воздействий в геноме, требует достаточно длительного времени для определения соответствующих показателей. Так, общее время, необходимое для цитогенети-ческого определения хромосомных аберраций, составляет несколько дней. Для получения результатов оценки генотоксичности в тестах in vitro (тест Эймса, микроядерный тест на культуре первичных гепатоцитов крысы или клеток растений) согласно литературным данным [10] требуется не менее 48 ч только для инкубации клеток. Время определения показателя кометного теста и метода щелочного раскручивания ДНК составляет от 8 ч до 1 суток. Недавно разработанный метод оценки генотоксичности с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени также требует не менее одного рабочего дня для своего выполнения [14]. В предлагаемом нами подходе для определения величин ИД и КОФ ДНК необходимо примерно всего 10—15 мин. Следовательно, использование этих показателей позволяет гораздо более оперативно осуществлять контроль и можно рекомендовать их для экспрессной оценки геном-повреждающих эффектов в соматических клетках млекопитающих после физико-химических воздействий.
Гематологические методы. Общее количество лейкоцитов и их отдельных фракций в крови крыс были исследованы с помощью рутинных гематологических методов (камерно-меланжерно-го, окраски и анализа мазков крови на стеклах).
Методы статистической обработки результатов. Экспериментальные данные обрабатывали с использованием непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни и стандартных программ корреляционного и регрессионного анализа.
Результаты и обсуждение. Результаты оценки ранних токсикогеномных реакций — через 24 ч после однократного действия нДМГ с использованием разработанного экспрессного метода представлены в табл. 1.
Как можно видеть из приведенных в табл. 1 данных, введение МНМ, использованной в ка-
Таблица 1
Изменения числа лейкоцитов, содержания и структуры их ДНК через 24 ч после однократного введение препаратов
Группа животных (число крыс) Число лейкоцитов • 109 кл/л ИД (отн. ед.) КОФ (отн.ед.)
Интактный контроль (4) 11,0±0,5 7,14+0,70 1,30+0,12
Введение этанола (10) 17,1±1,2 4,67±0,32 1,36+0,08
Введение МНМ (8) 9 7+0 7*** 3,69+0,31* 1,61+0,19
Введение 1-й дозы нДМГ (8) 14,7+1,4* 3,92+0,40* 1,51+0,11
Введение 2-й дозы нДМГ (5) 15,7+1,1* 4,75+0,49* 1,20+0,09
Введение 3-й дозы нДМГ (6) 16,5+1,6* 4,04+0,34* 1,38+0,14
Примечания: знаками * и *** помечены величины, достоверно (р < 0,05 и р < 0,001) отличающиеся от показателей в группе с введением этанола; знаком * помечены величины, достоверно (р < 0,05) отличающиеся от показателей в группе интактных животных.
честве стандарта, приводило как к значимой ранней гематотоксической реакции — число лейкоцитов снижалось до 57 % по сравнению с соответствующим контролем, так и к токсикоге-номному эффекту — величина ИД снижалась до 79 % относительно контроля. Эти результаты согласуются с известными литературными данными [17]. Анализ лейкоцитарных формул показал, что гематотоксичность МНМ была обусловлена, в основном, лимфоцитарной фракцией белых клеток крови (число лимфоцитов снижалось до 41,4±8,9 % по сравнению с контролем).
После введения нДМГ также наблюдались ранние токсикогеномные реакции, судя по снижению величин ИД в сравнении с интактным контролем, независимо от величины подведенной дозы, однако гематотоксических реакций, связанных с лейкопенией, не наблюдалось. Более того, можно отметить даже некоторое повышение числа циркулирующих лейкоцитов в
сравнении с контролем. Таким образом, в ранние сроки после введение нДМГ происходило увеличение количества апоптотически гибнущих лейкоцитов, но в организме животных наблюдались компенсаторные реакции, возможно связанные с ускоренным выходом белых клеток крови из депо на периферию.
Результаты определения числа лейкоцитов и показателей содержания и структуры ДНК лейкоцитов крови через 1 мес. после однократного введения токсикантов представлены в табл. 2. Из приведенных в табл. 2 данных можно видеть, что через 1 мес. после введения токсического стандарта — МНМ наблюдалось восстановление измерявшихся гематологических и биохимических показателей до контрольных значений.
В случае введения нДМГ в 1-й дозе не наблюдалось значимых отличий измерявшихся показателей в сравнении с показателями в группе ин-тактных животных, то есть в течение 1 мес. про-
Таблица 2
Изменения числа лейкоцитов, содержания и структуры их ДНК через 1 месяц после однократного введение препаратов
Группа животных (число крыс) Число лейкоцитов • 109 кл/л ИД (отн. ед.) КОФ (отн.ед)
Интактный контроль (7) 12,4+1,3 7,14+1,25 1,01+0,06
Введение этанола (11) 13,5+1,7 7,31+1,37 1,32+0,15
Введение МНМ (7) 13,7+2,2 6,30+1,74 1,10+0,11
Введение 1-й дозы нДМГ (8) 10,7+1,3 9,47+1,30 1,03+0,10
Введение 2-й дозы нДМГ (5) 17,8+2,0* 4,09+0,75** 1,03+0,14
Введение 3-й дозы нДМГ (6) 15,8+2,9 5,21+0,58* 1,21+0,02*
Примечание: знаками * и ** — помечены величины, достоверно отличающиеся от показателей в группе интактных животных (р < 0,05 и р < 0,01, соответственно)
Таблица 3
Изменения числа леикоцитов, содержания и структуры их ДНК через 1 месяц после хронического введения нДМГ
Группа животных (число крыс) Число лейкоцитов • 109 кл/л ИД (отн. ед.) КОФ (отн. ед.)
Интактный контроль (7) 12,4±1,3 7,14+1,02 0,93+0,03
Введение нДМГ (10) 16,7+1,3* 3,99+0,61* 1,19+0,11*
Примечание: знаком # помечены величины, достоверно отличающиеся от показателей в группе интактных животных (р < 0,05)
исходило восстановление общего числа лейкоцитов и измерявшихся биохимических параметров до контрольных уровней. Вместе с тем в этой группе подопытных крыс следует отметить достоверное (р < 0,01) снижение числа лимфоцитов до 70 % по сравнению с величиной, определенной в группе интактного контроля. После введения нДМГ во 2-й дозе следует отметить снижение величины ИД и повышение числа лейкоцитов (возможно компенсаторное) относительно показателей в группе интактного контроля. В случае введение нДМГ в 3-й дозе не было отмечено подобного возрастания числа лейкоцитов, но при этом наблюдалось снижение величины ИД и повышение показателя КОФ (отражающего увеличение числа разрывов в ДНК) в сравнении с показателями контрольной группы. Таким образом, увеличение дозы повреждающего агента — нДМГ приводило к повышению уровня генетических нарушений у самок крыс, что согласуется с данными других авторов, полученных на половозрелых самцах [4].
Результаты определения числа лейкоцитов и показателей содержания и структуры ДНК лейкоцитов крови после хронического введения токсиканта в течение 1 мес. представлены в табл. 3. Как можно видеть из представленных данных, хроническое введение нДМГ в 1-й дозе в течение 1 мес. приводило к значимому снижению величины ИД и увеличению числа лейкоцитов и показателя КОФ. Вместе с тем, значительных изменений в лейкоцитарной формуле обнаружено не было. Это свидетельствовало об увеличении доли апоптотически гибнущих лейкоцитов, повышении числа разрывов в ДНК лейкоцитов самок крыс, что сопровождалось, по-видимому, компенсаторным повышением числа белых клеток крови. Полученные нами результаты согласуются с данными других авторов о значимом увеличении аберраций хроматидного типа в клетках костного мозга после воздействия нДМГ половозрелым самцам крыс в высоких концентрациях — 205—1028 мг/м3 [4]. В отличие от этих авторов мы выявили токсикогеномные нарушения в лейкоцитах при воздействии более низкой концентрации нДМГ — 100 мг/м3.
Заключение. На основании флуоресцентного анализа содержания ДНК нуклеоидов белых клеток крови разработан способ прижизненной экспрессной оценки степени апоптоза или анеуп-лоидии, а на основании флуоресцентного анализа структуры ДНК — метод определения хромосомных и хроматидных разрывов в ДНК лейкоцитов крови мелких лабораторных животных после физико-химических воздействий в низких дозах.
По сравнению с цитогенетическим методом, способ имеет ряд существенных преимуществ — значительно сокращается время выполнения процедуры (до 10—15 мин, тогда как известные методы требуют от одних до нескольких суток, что может быть решающим в случае чрезвычайных ситуаций), кроме того, в 10—20 раз (до 0,02— 0,05 мл) уменьшается материалоемкость для осуществления анализа крови.
В ранние сроки (через 24 ч) однократного после в/ж введения нДМГ самцам крыс наблюдались (независимо от дозы воздействия — 70, 140 или 200 мг/кг) биохимические эффекты, выражавшиеся в увеличении степени апоптоза белых клеток крови.
Через 1 мес. после однократного введения нДМГ в дозе 70 мг/кг у крыс было зарегистрировано восстановление биохимических показателей, но при этом было снижено число лимфоцитов крови, после действия нДМГ в дозе 140 мг/кг у животных было повышено число апоптотически гибнущих лейкоцитов, а после действия нДМГ в дозе 200 мг/кг повышалась как степень апоптоза белых клеток крови, так и число разрывов в их ДНК.
В результате подострого хронического ингаляционного воздействия нДМГ (концентрация 100 мг/м3 ежедневно 4 ч в течение 1 мес.) у животных было отмечено повышение апоптоти-ческих реакций и увеличение числа разрывов в ДНК лейкоцитов крови.
Список литературы
1. Иванов С.Д., Кованько Е.Г., Попович И.Г. и др. Оценка генотоксичности и отдаленных эффектов радиационно-химических воздействий. // Ра-диац. биология. Радиоэкология, 1999. — Т. 39. — № 4. - С. 418-424.
2 Иванов С.Д., Собуцкий М.П., Монахов А.С. и др. Экспрессная оценка генотоксических эффектов низких доз радиационно-ртутных воздействий.// Токсикол. вестник, 2008. - № 1. - С. 21-25.
3. Иванов С.Д., Ямшанов В.А., Кованько Е.Г. и др. Сравнительная оценка пострадиационных генотоксических эффектов в клетках млекопитающих биохимическими и цитогенетическим методами // Бюл. экспер. биол., 2006. - Т. 142. -№ 12. - С. 635-638.
4. Колумбаева С.Ж., Шалахметова Т.М., Бе-гимбетова Д.А и др. Мутагенное действие компонента ракетного топлива несимметричного диме-тилгидразина на крыс разного возраста // Генетика, 2007. - Т. 43. - С. 742-746.
5. Монахов А.С. Методические рекомендации по прижизненному цитогенетическому исследованию мутагенеза у мелких лабораторных животных (крыс и кроликов). - Л., 1984. -15 с.
6. Birnboim H.C., Jevcak J.J. Fluorometric method for rapid detection of DNA strand breaks in human white blood cells produced by low doses radiation // Cancer Res., 1981. - V. 41. - P. 1889-1892.
7. Cook P.R., Brazell I.A. Spectrofluorometric measurement of the binding of ethidium to superhelical DNA from cell nuclei // Eur. J. Biochem., 1978. - V. 84. - P. 465-477.
8. Daxhelet G.A., Coene M.M., Hoet P.P. et al. Spectrofluorometry of dyes with DNA's of different base composition and conformation // Anal. Biochem., 1989. - V 179. - № 2. - P. 410-413.
9. Druckrey H., Preussman R., Ivankowic S. et al. Organotrope carcinogenic Wirkungen bei 65 verschiedenen N-Nitroso- Verbindungen an BD Ratten // Z. Krebsforsch, 1967. - Bd. 69. - S. 103-120.
10. Helma C, Eckl P., Gottmann E. et al. Genotox-ic and ecotoxic effects of groundwaters and their relation to routinely measured chemical parameters // Environ. Sci. Technol., 1998. - V 32. - P. 1799-1805.
11. Petersen P., Bredahl E, Lauritsen O. et al. Examination of the liver in personnel working with liquid rocket propellant //Brit. J. Industr. Med., 1970. — V. 27. - P. 141-143.
12. Roe F.J., Grant G.A., Millican D.M. Carcinogenicity of hydrazine and 1,1-dimethylhydrazine for mouse lung//Nature, 1967. - V. 216. - P. 375-376.
13. Smith E.B., Clark D.A. Absorption of unsym-metrical dimethylhydrazine (UDMH) through canine skin // Toxicol. Appl. Pharmacol., 1971. — V. 18. — P. 649-652.
14. Soberon N., Martin R., Suarez J.E. New method for evaluation of genotoxicity, based on the use of real-time PCR and lysogenic gram-positive and gramnegative bacteria//Appl. Environ. Microbiol., 2007. — V. 73. - P. 2815-2819.
15. Toth B. Comparative studies with hydrazine derivatives. Carcinogenicity of 1,1-dimethylhydrazine, unsymmetrical (1,1-DMH) in the blood vessels, lung, kidneys, and liver of Swiss mice // Proc. Amer. Assoc. Cancer Res., 1972. - V 13. - P. 34-37.
16. Toth B. 1,1-Dimethylhydrazine (unsymmetrical) carcinogenesis in mice. Light microscopic and ultrastructural studies on neoplastic blood vessels // J. Nat. Cancer Inst., 1973. - V. 50. - P. 181-185.
17. Tronov V.A., Kramarenko L.I., Kozlova A.D. et al. Sensitivity of human lymphocytes to genotoxic effect of N-methyl-N-nitrosourea: possible relation to gynecological cancers // Experim. Oncology, 2006. -V. 28. - № 4. - P. 314-318.
18. U.S. Environmental Protection Agency. Integrated risk information system (IRIS) on 1,1-dimethyl-hydrazine. Environmental Criteria and Assessment Office, Office of Health and Environmental Assessment, Office ofResearch and Development. Cincinnati, 1993.
Переработанный экземпляр статьи поступил в редакцию 10.03.09.
S.D. Ivanov, S.Ye. Kolbasov, V.A. Yamshanov, Ye.G. Kovanko, A.S. Monakhov, M.V. Melikhova, A.S. Ivanova, O.A. Vakunenko, K.B. Strelnikov
EXPRESS ASSESSMENT OF TOXICOGENOMIC EFFECTS POSED BY ASYMMETRIC DIMETHYLHYDRAZINE
Institute of Toxicology Russian Research Center for Radiology and Surgical Technologies, St. Petersburg
A method for an express life-time quantitative evaluation of toxicogenomic effects from physico-chemical exposure to small laboratory animals was worked out by analyzing the content and structure of leukocyte nucleoides DNA with the use of fluorescent dyes. This approach was applied to find out toxicogenomic effects after the exposure to asymmetric 1,1-dimethylhydrazine (aDMH). Biochemical alterations reflecting an increased incidence of white cell apoptosis in blood and not relating to the dose (70, 140 or 200 mg/kg) were observed in the early period (24h) after a single intragastric administration of aDMH to rats. Despite a certain recovery of indices, a month after a single administration of aDMH to rats residual dose-dependent toxicogenomic effects were observed. As a result of the chronic inhalation exposure to aDMH (concentration of 100 mg/m3, 4h every day for a month), the rise in apoptotic responses and leukocyte DNA breaks in blood were registered.
