CC BY
12УДК [615.849.5+549.49]:575.113
С.Д.Иванов, М.П.Собуцкий*, А.С.Монахов, Е.Г.Кованько
ЭКСПРЕССНАЯ ОЦЕНКА ГЕНОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ НИЗКИХ ДОЗ РАДИАЦИОННО-РТУТНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ
Центральный научно-исследовательский рентгенорадиологический институт Росздрава ФГУН«Институт токсикологии» ФМБА России, Санкт-Петербург
Разработан метод экспрессной прижизненной количественной характеристики генотоксических эффектов при радиационно-ртутных воздействиях на организм мелких экспериментальных животных путем анализа содержания и структуры ДНК нуклеоидов лейкоцитов крови с помощью флуоресцентных красителей. Данный подход предлагается для индикации воздействий в диапазоне малых доз (близких к предельно допустимым), имеющих место, как правило, в окружающей среде.
Ключевые слова:радиационно-ртутные воздействия, низкие дозы, цитогенетический анализ, содержание и структура ДНК нуклеоидов.
Введение. Сочетанное воздействие ряда факторов окружающей среды разной природы в малых дозах может привести к значимым повреждающим эффектам вследствие их аддитивности или синергизма в живых организмах. Геноток-сические эффекты при действии низких доз ра-диационно-химических воздействий окружающей среды, могут привести к увеличению частоты опухолеобразований, нарушениям в системе кроветворения и в репродукции человека и млекопитающих, сокращению продолжительности жизни и т. д. В настоящее время для оценки генотоксических эффектов, наряду с давно апробированными методами (определение числа хромосомных аберраций, разрывов цепей ДНК, микроядерный тест), используются новые приемы — «кометный» тест, цитогенетический анализ в сочетании с флуоресцентной in situ гибридизацией, ряд показателей апоптоза и другие подходы, которые позволяют более детально охарактеризовать нарушения содержания и структуры ДНК в клетках. Учет хромосомных аберраций в культивируемых лимфоцитах является одним из классических способов идентификации действия радиации на организм мелких лабораторных животных [4]. Однако при массовых обследованиях использование цитогенетического метода осложняется трудоемкостью и длительностью анализа. Для статистически достоверной оценки генотоксичности какого-либо воздействия на достаточном числе тестируемых объектов желательно иметь чувствительный и вместе с тем более быстрый метод. Ранее нами было показано, что определение содержания ДНК нуклеоидов лейкоцитов крови с помощью флуоресцентных красителей может быть успешно применено для
* Фрагмент диссертационной работы
быстрой оценки генотоксичности в соматических клетках и диагностики лучевых поражений человека и животных [1, 3]. Задачей настоящей работы явилось сопоставление отдельных цито-генетических показателей генотоксичности ра-диационно-ртутного воздействия в лимфоцитах мелких лабораторных животных с вновь разработанными способами, которые дают возможность существенно сократить время анализа.
Материалы и методы исследований. Влияние облучения на животных изучали на крысах-самках в возрасте 4—5 мес. разводки питомника «Рапполово» в двух сериях экспериментов. Перед началом опыта животные были разделены на 4 группы по 3—4 крысы в каждой. Контролем служили крысы, не подвергавшиеся никаким повреждающим воздействиям (1-я группа). Крыс 2 и 4-ой групп подвергали общему однократному рентгеновскому облучению в дозе 25 сГр на аппарате РУМ-17 (напряжение 200 кВ, ток 15 мА, фильтр — 2 мм Си + 1 мм А1; мощность поглощенной дозы 0,16 Гр/мин). Крысы 3 и 4-ой групп в течение 3 мес. до облучения и 1 мес. после рентгеновского воздействия получали с питьевой водой соль ртути Щ2^О3)2 в концентрации 1 мкг/л в расчете на металл. Измерение цитогенетических и биохимических показателей проводили через 4 мес. после начала эксперимента.
Для определения количественных и структурных цитогенетических показателей в лимфоцитах крыс применяли полумикрометод культивирования цельной крови животных. Для этого 0,25—0,3 мл крови из хвостовой вены крыс, подвергнутых вышеупомянутым радиационно-ртут-ным воздействиям, культивировали в течение 70 ч при 37,6°С и готовили метафазные препараты для хромосомного анализа, как описано ра-
нее [4]. Цитогенетическое исследование проводили на микроскопе МБИ-15 под масляной иммерсией на метафазных пластинках при рутинном окрашивании хромосом. Учитывали клетки со всеми видимыми структурными (хромосомные и хроматидные разрывы, транслокации, кольцевые хромосомы, ди- и трицентрики, парные и одиночные фрагменты) и количественными нарушениями (гиперанеуплоидию и полиплоидию). Анализировали не менее 100 клеток у каждого животного.
Другим способом оценки генотоксических эффектов в белых клетках крови являлся модифицированный нами метод, основанный на определении индекса ДНК (ИД), который вычисляли как отношение концентрации ДНК (мкг/ мл) к количеству лейкоцитов в 1 мл крови (число клеток определяли с помощью камеры Горяева и окраски метиленовым синим). Для этого пробы крови из хвостовой вены крыс объемом 0,02 мл обрабатывали в течение 3—5 мин 0,2 мл лизи-рующей смеси, предназначенной для получения нуклеоида. Состав смеси: 2,0 М NaCl, 0,1 М три-лон Б, 0,01 М трис, 0,5% тритон Х-100, рН 8,0.
Измерение содержания ДНК в лизирован-ных пробах осуществляли флуориметрически с использованием 4' ,6-диамидино-2-фенилиндо-ла (ДАФИ) (фирма «Serva» Германия) при конечной концентрации флуорохрома 0,1 мкг/мл. Для определения концентрации ДАФИ спектро-фотометрическим способом применяли коэффициент е344 = 23000 М-1см-1. Вариации определявшегося нами ИД обусловлены изменениями количества флуорохрома, взаимодействующего с ДНК нуклеоида, который образовался в результате лизиса клеток в присутствии ЭДТА, 2 М NaCl и детергента. Структура ДНК в нуклеоиде близка к нативной, но лишена комплексообра-зующих, белковых и липидных компонентов, что облегчало связывание красителя с субстратом.
Все измерения флуоресценции осуществляли в буфере - 0,01 М трис, 0,1 М NaCl, 0,01 М трилон Б, рН 7,2-7,4 на спектрофлуориметре «Model 850» фирмы «Hitachi» Япония или другом, имеющим для ДАФИ длину волны возбуждения — А,возб = 350 нм и длину волны эмиссии —
= 450 нм, что может быть установлено в зависимости от конструкции конкретного прибора как с помощью аттенюаторов, так и с помощью фильтров.
Для учета условий измерений в лизатах крови, расчет количества ДНК в пробах осуществляли относительно введенного в образец стандарта. В качестве его использовали обработанную ультразвуком ДНК тимуса теленка (фирма «Serva» Германия) в концентрациях 5—10 мкг/мл.
При флуориметрическом определении концентрации ДНК в пробе анализируемого образца измеряли фоновую интенсивность флуоресценции — ИФ0, затем интенсивность флуоресценции после добавления красителя — ИФ1 и, наконец, интенсивность флуоресценции после добавления раствора стандартной ДНК в эту же пробу — ИФ2. Расчет концентрации ДНК в исследуемых пробах осуществляли по формуле:
С (мкг/мл) = К
(
ДИФ, ДИФП
ДИФ, ДИФП
)
(1)
где: К — коэффициент, зависящий от концентрации ДНК, использованной в качестве стандарта (мкг/мл) и разбавления пробы и стандартной ДНК в кювете измерения; ДИФ1 ДИФ2, ДИФ01 и ДИФ02 — интенсивность флуоресценции пробы (ДИФ1 = ИФ1 — ИФ0) и стандартной ДНК (ДИФ2 = ИФ2 - ИФ1 в кювете измерения, соответственно, с учетом влияния компонентов лизирующей смеси, для которой, аналогично исследуемому образцу, определялись ДИФ01 и ДИФ02. Расчет величины индекса ДНК (ИД) осуществляли по формуле:
ИД (пг/кл) = Спр/Л (2)
где: Спр — концентрация ДНК в пробе (мкг/мл); Л — число лейкоцитов в пробе (106 кл/мл). Для характеристики структуры ДНК в пробах, лизированных в условиях получения нуклеоида, применили двухпараметровый критерий: один параметр был связан со степенью суперспирализации полинуклеотида, а другой отражал общее количество зондируемой ДНК. Для этого использовали специфические флуоресцентные зонды: этидий бромид — интеркаля-тор, у которого свечение в комплексе с ДНК зависит от степени сверхскрученности зондируемого субстрата [6], и ДАФИ — лиганд, при низких концентрациях связывающийся вдоль цепи ДНК неинтеркалирующим образом [7]. Ранее было показано, что изменения числа молекул красителя, взаимодействующего с ДНК нуклеоида, при окрашивании его этидий бромидом обусловлены релаксацией суперспиральной структуры полинуклеотида, которая связана с разрывами его пентозофосфатных цепей после облучения [6]. Рабочая концентрация этидий бромида составляла 4,0 мкг/мл; при определении концентрации этидий бромида спек-трофотометрическим методом принимали е480 = 5680 М-1см-1. Измерения интенсивности флуоресценции проб, окрашенных этидий бромидом, осуществляли при длине волны возбуждения — А,возб = 510 нм и длине волны эмиссии — = 590 нм. Структурное состояние ДНК, зондируемой двумя флуорохромами, оценивали с помощью коэффициента относительной флуорес-
ценции (КОФ), который рассчитывали по формуле:
КОФ = К ■ ИФбэ / ИФдафи (3)
где: ИФбэ и ИФДАФИ — величины интенсив-ностей флуоресценции проб, окрашенных эти-дий бромидом и ДАФИ, соответственно, с вычетом фоновой флуоресценции; К — коэффициент, учитывающий разбавление проб и стандартной ДНК в кювете измерения, а также величины интенсивностей флуоресценции раствора стандарта. Определяли взаимосвязь изменений этих биохимических параметров с вариациями цито-генетических показателей в тех же пробах.
Экспериментальные данные обрабатывали с использованием непараметрического и-кри-терия Вилкоксона-Манна-Уитни, а также стандартных программ корреляционного и регрессионного анализа.
Результаты и обсуждение. Результаты определения цитогенетических показателей через 1 месяц после облучения в группах крыс, подвергнутых различным видам повреждающих воздействий, представлены в табл. Как можно видеть из приведенных данных, допустимая концентрация химического токсиканта и низкая доза облучения, примененные изолированно, не приводили к существенным изменениям цитогенетических показателей в группах подопытных животных по сравнению с уровнем показателей в группе крыс интактного контроля. Вместе с тем, в результате сочетанного воздействия наблюдалась выраженная тенденция увеличения относительного числа анеуплоидных и полиплоидных клеток, а также снижения процента лимфоцитов с хромосомными и хроматидными разрывами.
Тенденция повышения плоидности в лимфоцитах согласуется с известными данными других авторов [8] о том, что соединения ртути часто оказывают кластогенные эффекты у эукариот, опосредованные путем связывания 8Н-групп, и действуя как ингибиторы веретена, приводят к анеуплоидии и/или полиплоидии. Некоторое снижение количества клеток с хромосомными и хроматидными разрывами к концу 30 суток после облучения, возможно, обусловлено активацией пострадиационных восстановительных и
репарационных процессов, происходящих в организме облученных животных в этот период времени, в результате чего в кровотоке частично уменьшается число поврежденных клеток.
Результаты определения суммарного числа хромосомных аберраций в лимфоцитах после выше-примененных радиационно-ртутных воздействий в малых дозах в одной и той же пробе крови крыс с помощью метафазного хромосомного анализа лимфоцитов [4] и результаты определения ИД вышеописанным методом, основанным на флуориметрии ДНК нуклеоидов лейкоцитов, достаточно хорошо совпадали (рис.1). Регрессионный анализ индивидуальных значений числа лимфоцитов (%) с хромосомными аберрациями и соответствующих значений ИД лейкоцитов крови крыс позволил установить достоверную взаимосвязь между этими показателями, описывающуюся функцией: ХрАб (%) = -2,03 + 0,39 ■ ИД (пг/кл)
R = 0,820, р < 0,01.
Следовательно, предлагаемый способ определения суммарного числа хромосомных аберраций в лимфоцитах крови крыс после радиа-ционно-ртутных воздействий дает возможность оценить уровень генотоксических повреждений подобно цитогенетическому тесту.
Дополнительный регрессионный анализ индивидуальных значений числа анеуплоидных и полиплоидных лимфоцитов (%) и соответствующих значений ИД лейкоцитов крови крыс позволил обнаружить существенно значимую (R = 0,992; р < 0,001) взаимосвязь между этими показателями, описывающуюся функцией: ХрАбанеу+_ (%) = 0,1 + 0,14 ■ ИД (пг/кл).
Подобный статистический анализ между количеством лимфоцитов с хромосомными и хроматидными разрывами и величиной КОФ в лейкоцитах также выявил достоверную (R = 0,827; р < 0,05) взаимосвязь между измеренными параметрами:
ХрАбхром. разрывы (%) = -5,3 + 7,4 ■ КОФ (отн. ед.).
Определение анеуплоидии в циркулирующих лейкоцитах крови с помощью показателя ИД ранее нами было верифицировано также при од-
Таблица
Изменения плоидности, хромосомных и хроматидных разрывов в лимфоцитах крыс после радиационно-ртутных воздействий в низких дозах
Вид повреждения хромосом Интактный контроль Введение соли ртути Облучение Введение соли ртути + облучение
Клетки с гиперанеуплоидией и полиплоидией(%) 1,0±0,3 0 1,0±0,3 2,0±0,7
Клетки с хромосомными и хроматидными разрывами (%) 7,4±5,5 6,0±2,6 2,7±2,2 2,0±1,0
£
£ 10-
~~Г" 15
20
25
~1 30
Индекс ДНК, пг/кл
Рис. Зависимость между хромосомными аберрациями и индексом ДНК в лейкоцитах крови крыс
новременном анализе отдельных проб крови животных вышеописанным способом и на проточном цитометре [2]. Количественное определение разрывов в ДНК лейкоцитов с использованием флуоресцентной индикации, включающей применение интеркалятора — этидий бромида, ранее также было осуществлено другими авторами [5], однако их подход требует несколько больше материала для анализа и более длителен, чем предлагаемый нами для определения КОФ. Следовательно, вышеописанные способы определения ИД и КОФ в лейкоцитах крови крыс после радиационно-ртутных воздействий дают возможность определить процент как ане-уплоидных и полиплоидных лимфоцитов, так и числа клеток с хромосомными и хроматидными разрывами и таким образом оценить уровень соответствующих генотоксических повреждений.
Новизна предлагаемого подхода заключается в использовании лизирующей смеси для обработки проб крови перед измерением показателя, технологии определения параметра, применении формул для расчета и критериях геноток-сичности.
Важным достоинством разработанного нами метода анализа является то, что требуется гораздо меньше материала — 0,01—0,02 мл цельной крови для исследования по сравнению со способами, применявшимися ранее. Это позволило использовать его для прижизненного анализа на мелких лабораторных животных.
Большинство генотоксических тестов, используемых для характеристики повреждающих воздействий, требует достаточно длительного времени для определения соответствующих показателей. Так, общее время, необходимое для определения уровня хромосомных аберраций составляет несколько дней. Для получения результатов оценки генотоксичности в тестах in vitro (тест Эймса с использованием сальмонелл/мик-росом; микроядерный тест на культуре первич-
ных гепатоцитов крысы или клеток растений) согласно данным литературы [9] требуется не менее 48 ч только для инкубации клеток. Время определения показателя кометного теста и метода щелочного раскручивания ДНК составляет от 8 ч до 1 суток. Для определения ИД и КОФ необходимо примерно 10—15 мин, следовательно, использование этих показателей позволяет более оперативно осуществлять генотоксический контроль. Поскольку измерение предлагаемых биохимических показателей существенно быстрее, чем определение числа хромосомных аберраций или длины хвоста «комет», можно рекомендовать новые способы в качестве экспресс-метода оценки генотоксических эффектов радиацион-но-ртутного воздействия в соматических клетках млекопитающих с использованием 0,01—0,02 мл цельной крови. Метод может широко использоваться для серийной прижизненной оценки ге-нотоксичности в лейкоцитах крови у мелких лабораторных животных (крыс, мышей), у сельскохозяйственных и домашних животных при контроле состояния окружающей среды. Он был апробирован на моделях при сочетанном действии малых доз ионизирующего излучения и других тяжелых металлов (свинца, кадмия, цинка, железа), а также при экспертизе ряда водоемов Ленинградской области в г. Тихвине.
Заключение. На основании флуоресцентного анализа содержания и структуры ДНК нуклео-идов лейкоцитов крови разработан способ прижизненной экспрессной оценки анеуплоидии и полиплоидии, а также хромосомных и хрома-тидных разрывов в лимфоцитах мелких лабораторных животных после радиационно-ртутных воздействий в низких дозах. По сравнению с известными методами, способ имеет ряд существенных преимуществ:
1. Способ позволяет значительно уменьшить материалоемкость для осуществления анализа крови — в 10—20 раз в сравнении с известными (в частности, цитогенетическим) методами.
2. Значительно сокращается время выполнения процедуры — до 10—15 мин, в то время как известные методы требуют от одних до нескольких суток, что может быть решающим в случае чрезвычайных ситуаций.
3. Способ значительно проще всех известных и требует только флуориметра, который может быть портативным.
Предлагаемый метод имеет достаточно высокую степень воспроизводимости, погрешность составляет ±20%. Методика может быть использована специалистами, работающими в области медицинской экологии, токсикологии, радиобиологии, санэпиднадзора и чрезвычайных ситуаций с целью экспрессного выявления гено-токсических эффектов малых доз радиационно-химических воздействий.
Авторы выражают благодарность К.В.Ковань-ко за помощь в проведении экспериментов.
Список литературы
1. Иванов С.Д., Кованько Е.Г., Попович И.Г. и др. Оценка генотоксичности и отдаленных эффектов радиационно-химических воздействий // Ра-диац. биология. Радиоэкология, 1999. - Т. 39. - № 4. - С. 418-424.
2. Иванов С.Д., Кованько Е.Г., Ямшанов В.А. и др. Радиобиологические эффекты олипифата при лучевых воздействиях // Бюлл. экспер. биол, 2005.
- Т. 140. - № 10. - С. 429-432.
3. Иванов С.Д., Ямшанов В.А., Кованько Е.Г. и др. Сравнительная оценка пострадиационных ге-нотоксических эффектов в клетках млекопитающих биохимическими и цитогенетическим методами //Бюлл. экспер. биол., 2006. - Т. 142. - № 12.
- С. 635-638.
4. Монахов А. С. Методические рекомендации по прижизненному цитогенетическому исследованию мутагенеза у мелких лабораторных животных (крыс и кроликов). - Л., 1984. - 15 с.
5. Birnboim Н.С., Jevcak J.J. Fluorometric method for rapid detection of DNA strand breacks in human white blood cells produced by low doses radiation // Cancer Res., 1981. — V 41. — P. 1889-1892.
6. Cook P.R., Brazell L.A. Spectrofluorometric measurement of the binding of ethidium to superhelical DNA from cell nuclei // Eur. J. Biochem., 1978. — V. 84. — P. 465-477.
7. Daxhelet G.A., Coene M.M., Hoet P.P. et al. Spectrofluorometry of dyes with DNA's of different base composition and conformation //Anal. Biochem., l989. — V. 179. — № 2. — P. 410-413.
8. DeFlora S., Beunicelli C., Bagnasco M. Genoto-xicity of mercury compounds. A review // Mutat. Res., 1994. — V. 317. — № l. — P. 57-79.
9. Helma C, Eckl P., Gottmann E.J. et al. Genoto-xic and ecotoxic effects of groundwarers and their relation to routinely measured chemical parameters // Environ. Sci. Technol., 1998. — V. 32. — P. 1799-1805.
Материал поступил в редакцию 23.01.07.
S.D.Ivanov, M.P.Sobutskiy, A.S.Monakhov, Ye.G.Kovanko
EXRESS-ASSESSMENT OF GENOTOXIC EFFECTS PRODUCED BY RADIOACTIVE AND MERCURY
EXPOSURES IN LOW DOSES
Central Research Institute for Roentgenology and Radiology, RF Ministry of Health and Social Development, St.Petersburg
A new method was developed for the in-life-time quantitative express evaluation of genotoxic effects on small laboratory animals at radioactive and mercury exposure using fluorescent dyes to analyse nucleoid DNA content and structure in blood leukocytes. This approach is recommended for identifying exposures within a low doses range (close to permissible ones) which as a rule take place in the environment.
УДК 612-086: 613.633:616-092.4
Л.Т.Базелюк
МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК КРОВЕТВОРНОЙ СИСТЕМЫ КРЫС ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ УГОЛЬНО-ПОРОДНОЙ ПЫЛИ И ФИЗИЧЕСКОЙ НАГРУЗКИ
Национальный центр гигиены труда и профзаболеваний Минздрава Республики Казахстан,
Караганда
На белых крысах изучали кроветворную систему при интратрахеальном введении угольно-породной пыли и одновременное воздействие средней физической нагрузки в течение 1 месяца; цитохимическими методами исследования обнаружили наиболее выраженные нарушения в клетках костного мозга, тимуса, селезенки и периферической крови — проявляющиеся в увеличении содержания фосфолипидов, снижении лизосомально-катионных белков, а также активности моноаминоксидазы, эстеразы, РНК и катехоламинов, приводящие к развитию дистрофических изменений с последующей гибелью клеток.
Ключевые слова: пыль, физическая нагрузка, клетки кроветворной системы.
Введение. Клеточная фаза самоочищения легких от ингалированных частиц является саморегулируемым процессом, контролируемым количеством образующих продуктов разрушения
макрофага (ПРМ) [1, 2]. Наряду с местной активацией и аттракцией фагоцитоспособных клеток и мобилизацией их из депо ПРМ активируют гранулоцитомоноцитопоэз [3], что можно рас-
