CC BY
23
УДК 577; 504; 547; 61
В. С. Сибирцев, канд. хим. наук, А. В. Гарабаджиу, д-р хим. наук,
Санкт-Петербургский государственный технологический институт
Новые методы биотестирования и анализа ДНК с помощью флуорофоров
Ключевые слова: анализ ДНК, биотестирование, флуорофор. Key words: DNA analysis, biotesting, fluorescent dyes.
Описана новая схема анализа нуклеиновых кислот, в сочетании с использованием системы из двух нуклеотид-специфичных флуорофоров со взаимодополняющими свойствами позволяющая проводить оценку не только общего содержания ДНК в пробе, но и степени изменения структуры генома в клетках. Рассмотрен ряд новых методов анализа состояния генома «стандартных» биосистем, предназначенных для быстрого выявления генотоксического воздействия различных угнетающих факторов окружающей среды, продуктов питания, лекарственных и иных препаратов (в т.ч. при сочетанном их действии) на живые организмы. Рассмотрены также новые методы, позволяющие осуществлять быструю предварительную оценку индивидуальной радиочувствительности организма и экспрессную оценку микробной обсемененности жидких сред по результатам анализа ДНК с помощью специфичных флуорофоров.
Введение
В последнее время в связи с увеличением объемов производства и потребления различных фармакологических субстанций и биотехнологической продукции, а также повышением общего уровня антропогенной нагрузки на окружающую среду все более актуальной становится проблема быстрого выявления возможных негативных свойств новых и генетически или иным способом модифицированных пищевых продуктов, биологически активных веществ, лекарственных и иных препаратов. Причем речь идет не только об их изолированном действии на живой организм, но и о действии в сочетании с другими продуктами, препаратами и факторами окружающей среды, специфическими для того или иного региона.
Кроме того, нередко важна и сама по себе проблема достаточно быстрой и комплексной оценки степени экологического неблагополучия того или иного региона. Причем даже в том случае, когда
стандартные методы не позволяют выявить превышение установленных норм ни по одному из возможных угнетающих факторов, однако в сочетанном виде они способны оказывать значимое негативное воздействие на людей и другие живые организмы.
Решение вышеупомянутых проблем может быть осуществлено разными способами. Но наиболее приемлемым и адекватным нам представляется использование для этой цели стандартных биосистем, таких, например, как крысы, достаточно адекватно моделирующих человеческий организм, но притом дешевых, доступных и имеющих сравнительно короткий жизненный цикл, что позволяет формировать на их основе статистически значимые выборки, а также осуществлять достаточно экспрессное моделирование даже хронического воздействия тех или иных факторов на живые организмы.
Одним из важнейших параметров, характеризующих состояние организма, являются изменения в структуре его генома (в отношении «степени су-перспирализации ДНК» [1], в частности, наблюдающиеся даже вследствие обычных суточных изменений физиологического и психологического состояния человека), которые весьма просто и экспрессно могут быть выявлены, например, с помощью синтетических низкомолекулярных флуорофоров, чувствительных даже к достаточно небольшим изменениям как в составе, так и в структуре внутриклеточной ДНК. Кроме того, нуклеотид-специфичные флуоро-форы могут быть использованы в качестве лекарственных препаратов, радиопротекторов, в исследовательских, диагностических целях и т. д.
В связи с вышесказанным в настоящей работе поставлена задача достигнуть следующих целей:
• разработать с помощью ДНК-специфичных флуорофоров достаточно простой, быстрый и чувствительный метод оценки не только общего содержания нуклеиновых кислот (НК), но и изменений в структуре генома клетки;
• на основе применения вышеупомянутого метода к анализу генома стандартных биосистем разработать метод для быстрого выявления геноток-
биотехносфера
| № 3(15)/2Ш
Биомедицинская инженерия (553400)
сического воздействия на человеческим и другие живые организмы различных угнетающих факторов окружающей среды, продуктов питания, лекарственных и иных препаратов, в том числе при со-четанном действии на эти организмы других продуктов, препаратов или факторов окружающей среды, специфических для того или иного региона;
• рассмотреть возможности применения синтетических низкомолекулярных ДНК-специфичных флуорофоров в других методах диагностики и мониторинга, основанных на количественном и качественном анализе клеточного генома.
Анализ ДНК с помощью системы из нескольких флуорофоров
При всем разнообразии вышеупомянутых потенциальных возможностей для использования флуорофоров, специфических к определенным участкам НК, набор методов конкретного, практического применения таких соединений до сих пор еще далеко не так велик, как хотелось бы. И связано это, в частности, с тем, что сильное избирательное связывание с субстратом, как правило, требует от лиганда одних структурных особенностей, а наличие пригодных для регистрации свойств — других.
На первый взгляд, к числу лучших способов разрешения этого противоречия принадлежит конструирование комплексных соединений, одна из частей которых отвечала бы за связывание с субстра-
том, а другая — за наличие спектральных или иных, пригодных для регистрации свойств. Кроме того, если конструируемое комплексное соединение состоит из нескольких субъединиц, способных специфически связываться с субстратом, то было бы логично ожидать достаточно значительного увеличения у него как сродства к субстрату, так и специфичности по отношению к нему, по сравнению с «мономерными» составляющими указанного соединения. Аналогично, если конструируемое комплексное соединение содержит несколько субъединиц, способных увеличивать свое свечение при сорбции на субстрате, то для него можно ожидать увеличения его чувствительности регистрации такого субстрата также при сопоставлении с вышеуказанными «мономерными» составляющими.
Однако результат конструирования такого рода комплексных соединений далеко не всегда однозначно предсказуем, поскольку входящие в состав единой молекулы, жестко связанные между собой субъединицы способны не только дополнять, но и мешать друг другу как стерически, так и в результате более тонких механизмов взаимодействия не только с субстратом, но и между собой [2].
С учетом вышесказанного более перспективным представляется использование для анализа НК систем, включающих в себя несколько нуклеотид-спе-цифических флуорофоров, не связанных между собой непосредственно, но имеющих согласованные комплексообразующие и спектральные свойства. В настоящей работе в качестве примера такой сис-
а)
V
N.
0
1
ро2 I
V ^
I н—с
сн3 х
сн
\ /
НС—сн
I А
\
0
1
ро2
I
о
Аденин н
Тимин
----Г
I /3
Л I 0,3 нм с й \ ^ н
N
1,1 нм
--□
.с н ■
0
1
РОэ
И-/ Н ?
м х н9 не—сн
-►V / / V
НС
□ ^СК \
СН-
я-
//
1 Н—С СН3 " Ч
сн сн
\ / сн—сн
н
"Ы—н
V I
" н
Гуанин
Чц-Н----
0
1
ро2
□
/
-сн
\
сн НС
"\п/ \
СН-а
Цитозин I 2
-Н—Ич, С—
// \\
_ _ — Ц НС
V / н
Рис. 1
Схемы различных уровней структурной организации ДНК. а — пример первичной структуры ДНК:
1,2 — первая и вторая цепи ДНК; 3 — водородные связи между их комплиментарными азотистыми основаниями;
б — пример вторичной структуры ДНК и взаимодействия с ней типичных интеркалятора (этидий бромид) и внешнесвязывающегося соединения (Хехст-33258):
1,2 — первая и вторая цепи ДНК; 3 — этидий бромид; 4 — Хехст-33258; 5 — водородные связи между комплиментарными азотистыми основаниями;
в — третичная структура ДНК прокариота (на примере Е.СоИ): 1 — двуспиральная ДНК (как на рис. б); 2 — РНК-белковый каркас (КОР)
№ 3(15)/,-~~Р
биотехносфера
темы были выбраны два широко распространенных коммерческих нуклеотид-специфичных флуорофора: этидий бромид (I) и НоесЬв!-33258 (II).
При специфическом взаимодействии с полинук-леотидом каждый из этих красителей увеличивает интенсивность своей флуоресценции в 10-20 раз. Соединение I является интеркалятором, молекула которого располагается между двумя парами оснований двойной спирали полинуклеотида с большим тяготением к участкам последнего, обогащенным парами «гуанин — цитозин», но в основном специфичным ко вторичному и более высоким порядкам организации молекулы ДНК. Соединение II присоединяется к молекуле ДНК «снаружи» и проявляет специфичность к участкам двойной спирали полинуклеотида, содержащим три последовательно расположенных аденино-тиминовых пары оснований и одну гуанино-цитозиновую.
Кроме того, при совместной сорбции на поли-нуклеотиде между молекулами этих красителей может происходить флуоресцентный резонансный перенос энергии, а именно явление, когда при возбуждении флуоресценции молекул донора энергии
н
6 ^у-Т—Т—А—С—С—С— 1 :■:
| | В
^А—А—Т—С—С—С—
II
(в нашем случае — Hoechst-33258) светиться начинают не только они, но и молекулы акцептора энергии (в нашем случае — этидия бромида), область длин волн флуоресцентной эмиссии которого в значительной мере пересекается с областью длин волн возбуждения флуоресценции донора (рис. 1, 2). Причем эффективность такого переноса энергии весьма значительно будет зависеть от расстояния между молекулами донора и акцептора энергии [2].
Таким образом, очевидно, что при совместном использовании вышеупомянутых ДНК-специфичных флуорофоров I и II можно оценивать не только общее количество ДНК в пробе, но и степень изменения структуры клеточного генома. Далее представлен практический пример одной из возможных схем анализа генетического материала с помощью флуорофоров I и II.
Материалы и методы
Использовались флуорофоры 2,7-диамино-10-этил-9-фенил-фенантридиниумбромид (ethidium bromide) (I), 2-[2-(4-гидроксифенил)бензимидазол-5(6)-ил]-5(6)-(4-метилпиперазин-1-ил)бензимидазол (Hoechst-33258) (II) и 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) (III) (Serva, Германия). В качестве стандартного субстрата использовалась ДНК тимуса теленка, приготавливаемая путем растворения сухого препарата (Servа) в дистиллированной воде и обрабатываемая затем ультразвуком на аппарате УЗДН-2 (Россия) в течение 15 с при силе тока 0,3 A на резонансной частоте 22 кГц. При этом средний размер одного фрагмента ДНК составлял 35 000 Да. В качестве стандартного буфера применяли водный раствор, содержащий 0,01 М NaCl + 0,01М Na2EDTA (этилендиаминотетраацетат натрия) + 0,01 М Tris (2-амино-2-гидрокси-метил-1,3-пропандиол) с pH = = 7,4 ± 0,1. В качестве лизирующей смеси использовали водный раствор, содержащий 2М NaCl + + 0,1М Na2EDTA + 0,01М Tris + 0,5 % (по объему) об. Triton Х-100 (4-октил-(2,4,6,8,10-деканпентол) оксибензол) c pH = 8,0 ± 0,1.
Рис. 2 Схема флуоресцентного резонансного переноса энергии между молекулами соединений I (этидий бромид) и II (Хехст-33258) при специфической адсорбции их на ДНК: а — структурная схема донора энергии (соединение II); б — структурная схема акцептора энергии (соединение I); в — схема специфической адсорбции соединений I и II в теломерную последовательность ДНК:
1,2 — первая и вторая цепи ДНК; 3 — водородные связи между их комплиментарными азотистыми основаниями (А — аденин; Т — тимин; б — гуанин; С — цитозин);
г — типичный спектр флуоресцентного резонансного переноса энергии между молекулами соединений I (акцептор энергии) и II (донор энергии):
1 — возбуждение флуоресценции донора; 2 — флуоресцентная эмиссия, донора; 3 — возбуждение флуоресценции акцептора; 4 — флуоресцентная эмиссия акцептора; 5 — область резонансного переноса энергии между донором и акцептором
Описание эксперимента
К 0,10 мл пробы, в качестве которой может быть использована, например, цельная кровь, добавляем 1,00 мл лизирующей смеси, перемешиваем и выдерживаем 5 мин. Затем, к 0,05 мл полученного раствора добавляем 1 мл стандартного буфера. (Ли-зирующую смесь применяют для того, чтобы нарушить целостность клеточных стенок, внешних клеточных и ядерных мембран и таким образом обеспечить доступ красителя из внешнего по отношению к клетке раствора к внутриклеточной ДНК; состав данной смеси, а также стандартного буфера, стандартной ДНК и т. д. представлен в разделе «Мате-
| № 3(15)/2011
биотехносфера
риалы и методы».) В результате получаем раствор 1, для которого определяем значения фоновых интен-сивностей флуоресценции 1ф.х (интенсивность флуоресценции, фоновая для НоесЬв1-33258 (II), измеряемая при длинах волн возбуждения и эмиссии 350 и 455 нм соответственно) и 1ф.э (интенсивность флуоресценции, фоновая для этидия бромида, измеряемая при длинах волн возбуждения и эмиссии — 520 и 605 нм соответственно).
Добавляя к 1,05 мл первого раствора 0,05 мл раствора, содержащего 10 мкг/мл флуорофора II в стандартном буфере, получаем раствор 2, для которого определяем интенсивность флуоресценции Iх (интенсивность флуоресценции НоесЬв!-33258 (II) при длинах волн возбуждения и эмиссии — 350 и 455 нм). Далее, добавлением к 1,1 мл второго раствора 0,02 мл раствора, содержащего 60 мкг/мл стандартной ДНК в стандартном буфере, получаем раствор 3, интенсивность флуоресценции которого !д_х (интенсивность флуоресценции НоесЬв!-33258 (II) в присутствии ДНК, измеряемая при длинах волн возбуждения и эмиссии — 350 и 455 нм) определяем так же, как и ранее. После чего вычисляем собственно концентрацию ДНК в пробе: Сд.х = gСc.д (1х -- 1ф.х)/(1д.х " 1х), где сд.х — концентрация ДНК в пробе, определяемая по изменению флуоресценции НоесЬв!-33258 (II); g — разбавление ДНК в третьем растворе по сравнению с отобранной цельной кровью, g = 246; а Ссд — концентрация стандартной ДНК в третьем растворе, Ссд = 3,3 • 10~6 М).
Добавляя к 1,05 мл первого раствора 0,05 мл раствора, содержащего 200 мкг/мл флуорофора I в стандартном буфере, получаем раствор 4, для которого при наличии волн возбуждения и эмиссии длиной 520 и 605 нм определяем интенсивность флуоресценции этидия бромида 1э. Далее, добавлением к 1,10 мл четвертого раствора 0,02 мл раствора, содержащего 60 мкг/мл стандартной ДНК в стандартном буфере, получаем раствор 5, интенсивность флуоресценции этидия бромида в присутствии ДНК которого 1д э определяем так же, как и ранее. После чего вычисляем коэффициент структуризации: Кс = Сд э/Сд.х, где концентрация ДНК в пробе, определяемая по изменению флуоресценции этидия бромида, вычисляется по формуле: Сд э = = gСc.д(Iэ - 1ф.э)/(1д.э _ 1э). При этом изменение величины Кс должно, в частности, отражать в определенной мере изменения в характере третичного и более высоких порядков организации структуры генома пробы, поскольку соединение I, как уже отмечалось, к ним существенно более специфично, чем соединение II.
Наконец, для второго раствора при длинах волн возбуждения и эмиссии 350 и 605 нм, соответственно, определяем 1ф.х.э — значение фоновой интенсивности флуоресценции при совместном присутствии НоесЬв!-33258 (II) и этидия бромида. Затем, добавлением к 1,12 мл 2-го раствора 0,02 мл раствора, содержащего 200 мкг/мл флуорофора I
в стандартном буфере, получаем раствор 6, интенсивность флуоресценции которого 1х.э при совместном присутствии НоесЬв!-33258 (II) и этидия бромида определяем так же, как и ранее. После чего вычисляем коэффициент эффективности переноса энергии Кэ = (1х.э - 1ф.х.э)/Сд.х, уменьшение величины которого (рис. 2) в определенной мере может отражать даже уменьшение длины теломерных участков генома (у позвоночных животных и человека они представляют собой многократно повторяющиеся на концах молекул ДНК фрагменты вида ТТАООО, число которых уменьшается при каждом делении клетки вследствие неполной репликации ее ДНК и, соответственно, является максимальным ограничителем возраста живого организма, выполняя, впрочем, и некоторые другие, в частности регуляторные, функции).
Вышеописанная схема анализа ДНК была опробована нами на двух группах крыс (по 30 особей в каждой), чей средний возраст составил 2 и 18 месяцев. В результате были получены достоверно, с вероятностью 99 %, различающиеся величины усредненных по этим группам параметров Кс и Кэ. Что вполне соответствовало нашим исходным предположениям, поскольку с возрастом состояние генетического материала в клетках эукариотов и должно ухудшаться (в частности, за счет уменьшения длины теломерных участков генома и других изменений в структуре хромосомального нуклеопроте-идного комплекса). А в целом, процессы старения у крыс протекают примерно в 20 раз быстрее, чем у человека.
Кроме того, вышеприведенная схема анализа ДНК использовалась в составе методов выявления генотоксического воздействия на живые организмы различных продуктов питания, лекарственных препаратов, угнетающих факторов окружающей среды; а также как часть методов оценки индивидуальной радиочувствительности клеток крови человека, адекватность которых удостоверялась по описанной ниже схеме.
Выявление генотоксического воздействия
На основе представленного анализа состояния генома стандартных биосистем мы разработали новые методы для быстрого выявления генотоксического воздействия различных продуктов питания, лекарственных и иных препаратов, радиационных, химических и иных угнетающих факторов окружающей среды, в том числе в низких дозах и при соче-танном их действии, на человеческий и другие живые организмы. Эти методы основаны на том, что в течение определенного времени группе животных вводят тем или иным способом анализируемый продукт или препарат (или подвергают данную группу воздействию того или иного угнетающего фактора), при необходимости — в сочетании с другими про-
№ 3(!5)/201Т[
биотехносфера
дуктами, препаратами и факторами окружающей среды. При этом у животных регулярно отбирают пробы крови, которые обрабатывают лизирующей смесью, после чего с помощью специального красителя либо системы из нескольких красителей (см. выше о соединениях I и II) и флуориметра оценивают общее содержание и структуру генетического материала в пробе; нормируют их на количество лейкоцитов (поскольку в нормальном состоянии в крови млекопитающих эритроциты не содержат ДНК, впрочем, как и митохондрий, рибосом, внутриклеточных мембран) и сравнивают с аналогичными величинами, определяемыми для контрольной группы животных, а также для всех животных, участвующих в анализе, до начала его проведения.
Вышеописанные методы были апробированы нами, в частности, при оценке лечебного и профилактического действия циклоферона (индуктора интерферона) при лучевой терапии фибросаркомы [3], при прогнозировании развития лейкопении вследствие применения различных видов лучевой терапии при анализе действия на людей и другие живые организмы в условиях Петербурга и Ленинградской области различных минеральных вод (по договорам с предприятиями, производящими их) [4], а также при оценке экологического состояния ряда водоемов Ленинградской области. И полученные результаты достоверно коррелировали с наблюдаемым в дальнейшем снижением продолжительности жизни испытуемых животных; а также с результатами, полученными для тех же образцов методом учета нестабильных хромосомных аберраций в культивируемых лимфоцитах и другими цитологическими методами.
Оценка микробной обсемененности жидких сред
Кроме того, с использованием ДНК-специфичных флуорофоров нами был разработан новый метод для экспрессной оценки общей микробной обсемененности жидких сред, которая является одним из важных показателей при оценке санитарно-гигиенического состояния водоемов, мониторинге процесса очистки воды, а также иных биотехнологических производств и т. д. Стандартные методы, применяющиеся для этого в настоящее время и предполагающие высевание анализируемого материала на питательную среду, последующее инкубирование его при постоянной температуре в стерильных условиях в течение от одних до нескольких суток и подсчет числа образовавшихся колоний микроорганизмов, требуют значительного времени и специализированных стационарных условий. Разработанный нами метод позволяет проводить анализ практически в реальном режиме времени, непосредственно на месте отбора проб.
Сначала к отобранной во флуориметрическую кювету пробе (достаточно 1 мл) добавляем лизиру-
ющую смесь и определяем фоновую интенсивность флуоресценции образца так же, как описано выше для чистых красителей и полинуклеотида. Затем туда же добавляем раствор ДНК-специфичного флуорофора (например, коммерческого красителя DAPI, фоновая интенсивность флуоресценции которого 1ф2 определяется заранее) и измеряем интенсивность флуоресценции красителя в присутствии ДНК пробы 1Д. Далее в качестве «внутреннего стандарта» добавляем туда же раствор с известной концентрацией стандартной ДНК в стандартном буфере и определяем получившуюся интенсивность флуоресценции 1СД, изменившуюся относительно 1Д вследствие взаимодействия содержащегося в пробе флуорофора не только с микробной ДНК, но и с известным добавленным количеством стандартной ДНК. Вычисляем общее количество микроорганизмов в пробе:
СШ = 2 aixi , 1 = 0 ■ Я,
где См — концентрация микроорганизмов в пробе; at — коэффициенты, рассчитываемые по методу наименьших квадратов, исходя из калибровки, предварительно проводимой с использованием стандартных образцов с уже известным содержанием в них микроорганизмов (определяемым, например, по «стандартной высевной» методике — с последующим разведением исходного образца); X = (1Д - -
- 'ф2)/('с.д - 7Д).
С использованием переносного микрофлуоримет-ра ТКО-100 данная методика позволила определять общее количество микроорганизмов в пробе начиная с 20 кл/мл, с погрешностью не более 30 % и в течение не более чем 10 мин на одно измерение (причем прямо на месте отбора пробы). При этом с 95% -й вероятностью подтвердилась гипотеза о том, что данные, получаемые таким образом, принадлежат к той же генеральной совокупности, что и данные, собранные для тех же образцов по стандартной высевной методике [5]. На представленную методику нами был получен патент [6]. А ее дальнейшая разработка осуществлялась при финансовой поддержке гранта правительства Санкт-Петербурга PD03-1.3-40.
Если при обработке клеток вместо лизирующей смеси использовать какой-либо антибиотик, образующий канал только во внешних стенке и мембране клетки, то ДНК-специфичный флуорофор будет окрашивать лишь клетки прокариотов, присутствие которых нежелательно, к примеру, при производстве пива. Если же вычесть полученные таким образом данные из общего количества микроорганизмов в пробе, определенного с помощью ДНК-специфичного флуорофора и лизирующей смеси, то можно будет оценить и количество содержащихся в анализируемом образце эукариотов, которых не должно быть, например, при производстве кисломолочных продуктов. Кроме того, на производствах в стационарных условиях (к ним отно-
биотехносфера
I № 3(15)/2Ш
сятся очистка воды для населения и технических нужд, производство пива и т. д.) для регистрации окрашивания ДНК флуорофором можно использовать не переносной, а стационарный проточный цитофлуориметр, что позволит не только проводить оценку микробной обсемененности в реальном режиме времени, но и существенно повысить чувствительность такой оценки. Однако в каждом конкретном случае, когда микробиологическая чистота определяется не просто в воде, а в достаточно сложной многокомпонентной смеси, необходимо предварительно убедиться, можно ли пренебречь влиянием вышеупомянутых компонентов на свечение используемого флуорофора в отсутствие микроорганизмов (влияние примесей на характер взаимодействия флуорофора с ДНК учитывается введением внутреннего стандарта). И в случае отрицательного ответа надлежит либо подобрать другой флуорофор, либо видоизменить методику измерения.
в пробе, нормируют последнее на общее количество лейкоцитов в пробе и, сравнивая полученные величины между собой, делают вывод о степени повреждающего воздействия, которое окажет, вероятно, лучевая терапия в выбранной дозе на конкретного пациента.
Описанный метод был апробирован нами в отношении более чем 50 пациентов Центрального научно-исследовательского рентгено-радиологиче-ского института. Он показал достоверную 95%-ю корреляцию с результатами, полученными для тех же людей в тех же условиях методом учета нестабильных хромосомных аберраций в культивируемых лимфоцитах. Последний является одним из общепринятых методов ранней идентификации облучения человека, но существенно более материа-лоемким, трудоемким и продолжительным (7 суток вместо 4 ч), чем метод, предлагаемый в данной статье.
Оценка индивидуальной радиочувствительности организма
Также, используя ДНК-специфичные флуорофо-ры, мы разработали новый быстрый метод для предварительной оценки индивидуальной радиочувствительности живых организмов, весьма полезный, в частности, при выборе оптимальной дозы облучения больных в ходе их лучевой терапии или для определения времени, в течение которого тот или иной конкретный человек или иной живой организм может находиться в зоне с повышенным радиационным фоном без значимого ущерба для своего здоровья. При этом у пациента перед началом лучевой терапии, например, отбирают 1 мл крови, разбавляют ее стандартным буфером и делят на две равные части. Одну из них затем облучают, а другую (контрольную) — нет. После этого каждый образец инкубируют в течение 3 ч при 37 °С (для репарации первичных повреждений ДНК) и обрабатывают лизирующей смесью. Затем с помощью специального красителя (либо системы из нескольких красителей) и флуориметра оценивают структуру и общее содержание генетического материала
| Литература |
1. Кованько Е. Г. Флуоресцентная характеристика изменений структуры ДНК клеток кроветворной системы облученных крыс: Дис. ... канд. биол. наук. СПб.: ЦНИР-РИ, 2000. 166 с.
2. Сибирцев В. С. Изучение возможностей применения к анализу ДНК бифункциональной системы: бромид этидия + Хехст-33258 // Биохимия. 2005. Т. 70, № 4. С. 545-555.
3. Иванов С. Д., Коваленко А. Л., Кованько Е. Г. и др. Применение циклоферона при экспериментальной лучевой терапии опухолей // Вопросы онкологии. 1999. № 3. С. 292-297.
4. Иванов С. Д., Кованько Е. Г., Ямшанов В. А. и др. Влияние ионов металлов питьевых минеральных вод на биологические эффекты радиации // Актуальные вопросы медицинской радиологии: Тез. докл. научн. конф. СПб.: ЦНИРРИ, 1998. С. 370.
5. ГОСТ 18963—73. Вода питьевая. Методы санитарно-бак-териологического анализа. М.: Изд-во стандартов, 1985.
6. Пат. № 2079138 С0Ш33/569, С0Ш33/18. Способ определения микробиологической загрязненности воды / С. Д. Иванов, В. С. Сибирцев; заявитель и правообладатель Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологиче-ский институт МЗМП РФ; С. Д. Иванов. № 96101131/14; заявл. 30.01.1996, опубл. 10.05.1997. Бюл. № 13.
№ 3(15)/20Т"[
биотехносфера
