CC BY
429
УДК 57.086.2
B. А. Мошников, О. А. Александрова, А. О. Дробинцева, И. М. Кветной, Ю. С. Крылова, Д. С. Мазинг, Л. Б. Матюшкин,
C. Ф. Мусихин, В. О. Полякова, О. А. Рыжов
От лазерной оптической микроскопии до флуоресцентной микроскопии высокого разрешения. Коллоидные квантовые точки — биомаркеры в поисковых научных исследованиях
Ключевые слова: лазерная сканирующая оптическая микроскопия, флуоресцентная микроскопия высокого разрешения, коллоидные квантовые точки, флуорофоры, фотодинамическая терапия.
Keywords: laser scanning optical microscopy, high-resolution fluorescence microscopy, colloidal quantum dots, phosphors, photodynamic therapy.
Рассмотрены этапы развития и методов оптической флуоресцентной микроскопии. Рассмотрены методы, обеспечивающие разрешение на наноуровне, включая методы 4Pi-микроскопии, STORM-, STED- и PALM-методы, а также методы с использованием ферстеров-ского резонансного переноса энергии. Приведены классификация флуорофоров и результаты их сравнения с коллоидными квантовыми точками с позиции применения в биологии и медицине. Описано применение коллоидных квантовых точек в поисковых научных исследованиях.
Введение
Присуждение в 2014 г. Нобелевской премии по химии за разработку флуоресцентной микроскопии высокого разрешения американцам Эрику Бетцигу, Уильяму Мёрнеру и немцу Стефану Хел-лу вызвало широкий отклик в научных и «околонаучных» кругах. СМИ сообщили, что преодолен дифракционный предел. Это утверждение некорректно. Дифракционный предел не преодолен, а «обойден», причем с использованием нескольких способов. А Нобелевская премия присуждена за новые методы флуоресцентной микроскопии — STED-метод (stimulated emission depletion) и PALM-метод (photo-activated localization microscopy).
Стефан Хелл обосновал, разработал и довел до практического воплощения STED-метод, в котором
благодаря комбинации лазерных пучков флуоресценция выходит только из нанозоны с размерами, значительно меньше дифракционного предела.
В PALM-методе, предложенном Эриком Бетци-гом, используется явление возбуждения и обесцвечивания локализованных нанообластей, помеченных флуорофорами. Высокое разрешение достигается и в STORM-методе (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy), разработанном в Гарвардском университете, в лаборатории Ксяовея Жу-анга.
В настоящее время интенсивно развиваются разнообразные методы, использующие новейшие достижения, включая получение информации о выходе излучения из каждой точки анализируемого на-нообъема, об изменении интенсивности по времени и спектральном разложении излучения для каждой точки в любой момент времени (так называемые 3D-, 4D- и 5D-режимы). Аналитические возможности новых методов зачастую расширяются при использовании нескольких лазеров одновременно, вариации их временных и энергетических характеристик, применении флуорофоров с уникальными свойствами, включая эффекты резонансной передачи энергии в специально подобранных парах (фёр-стеровские пары).
Особый интерес представляют работы по развитию флуоресцентных наносистем на основе коллоидных квантовых точек (КТ) из-за потенциальных возможностей обеспечения многоцветности при облучении одним лазерным пучком, а также получения большей интенсивности и стабильности.
СПбГЭТУ «ЛЭТИ» (кафедра микро- и наноэлек-троники) и НИИАГ им. Д. О. Отта (отдел пато-морфологии) проводят совместные исследования коллоидных квантовых точек как биомаркеров патологических процессов женской репродуктивной системы. Целями таких исследований являются замена органических флуорофоров на коллоидные квантовые точки на всех этапах использования материала в качестве диагностического агента и сравнительная оценка двух основных групп флу-орофоров.
Работа направлена на создание панелей квантовых точек, конъюгированных с антителами или специфическими белками, для диагностики отдельных нозологических форм, а также на оценку прогностических маркеров при злокачественных образованиях, подбор маркеров, наиболее значимых для женских заболеваний, и многоцветное окрашивание (4—5 типов квантовых точек) с последующей установкой уровня и длительности сигнала от каждого типа.
На данном этапе комплексного исследования разрабатывается методика получения водорастворимых квантовых точек с люминесценцией в диапазоне 400—1600 нм и оценки их цитотоксичности. Исследуются трансформированные и нормальные клеточные культуры (линия клеток карциномы молочной железы ZR-75—1 и культура нормального эндометрия). В дальнейшем будут решаться задачи получения флуоресцентных комплексов направленного действия и исследования системы КТ, связанных с антителами или специфическими белками (например, с белками К1-67 и Р16 для диагностики рака шейки матки), в зависимости от выбранного антитела. Особое внимание уделено оценке сохранности свойств и активности КТ после конъюгации с антителами и проверке специфики действия таких комплексов на культуре клеток активно экс-прессирующих маркеров К1-67 и Р16, а также на биопсийном материале с подтвержденным диагнозом рака шейки матки1. Основным методом диагностики при исследованиях является сканирующая лазерная конфокальная микроскопия (СЛКМ).
Методы флуоресцентной микроскопии
На начальных этапах развития флуоресцентной микроскопии в качестве источника излучения использовалась ртутная лампа, из которой фильтрами выделялся нужный диапазон спектра. С появлением лазеров и внедрением компьютерных технологий возникло новое направление — сканирующая лазерная флуоресцентная микроскопия. Лазерная диагностическая аппаратура, применявшаяся до конца 1980-х гг., подробно рассмотрена в работе [1].
1 Аналогичные тесты будут проводиться с молекулярными маркерами эндометрия и злокачественных образований женской репродуктивной системы.
Рис. 1 Принципиальная схема конфокального микроскопа, в котором жестко связаны три точки: два пинхола (отверстия) перед лазерным источником и перед детектором, а также точка фокуса на фокальной плоскости образца:
1 — лазер; 2 — экран с пинхоллом; 3 — фотодетектор;
4 — экран с пинхолом перед детектором;
5 — дихроическое зеркало; 6 — объективная линза; 7 — фокальная плоскость в прозрачном образце
Эксперименты выявили различие аналитического отклика автофлуоресценции (а затем и флуоресценции) здоровых и больных клеток на определенных частотах и обусловили дальнейшее развитие флуоресцентной микроскопии и возникновение спектрофлуометрии как метода диагностики. Аналитические возможности значительно усилились благодаря использованию принципа конфокально-сти (софокусности) (рис. 1), что существенно уменьшило фоновое излучение. Из рис. 1 видно, что три точки — точка фокусирования на образце, точка отверстия (pinhole) на экране перед источником излучения и точка отверстия перед детектором — жестко связаны. Отклонение одной из них ведет к потере сигнала. Ниже принцип конфокальности будет рассмотрен более подробно. Здесь же отметим, что автором идеи конфокальности и получения 3Б-информации считается М. Мински [2, 3] (конец 1950-х гг.). Первые промышленные конфокальные микроскопы появились в 1980-х гг. В настоящее время принцип конфокальности применяется в рамановской спектроскопии, электронной микроскопии и т. п.
Для увеличения скорости сканирования был предложен SDCM-метод (Spinning Disk Соп£оса1 Microscopy) [4]. В микроскопах подобного типа используется вращающийся диск с тысячами отверстий. Его прототипом стало изобретение германского ученого Пауля Нипкофа (1884 г.), обеспечивающее передачу изображений на расстояние. Современный аналог диска Нипкофа содержит
6
7
20 тысяч расположенных по спирали отверстий, причем лазерный луч фокусируется на них при помощи дополнителвного диска с 20 тысячами микролинз. При вращении такого двойного диска объект сканируется сразу множеством (около 1000) световых фокусов, обеспечивая считывание 360 кадров (плоскостей) за секунду или даже одного кадра за миллисекунду [5, 6].
В данном кратком обзоре не рассматриваются многие технические решения по обеспечению работоспособности аналитического оборудования. Например, в дисковых сканирующих микроскопах необходимы устройства точной синхронизации скорости вращения диска и частоты считывания. Для детекции при высоких скоростях сканирования требуются новые ПЗС-устройства типа ICCD (Intensified Charge-Coupled Device), имеющие встроенный фотоумножителв, или типа EMCCD (Electron Multiplying Charge-Coupled Device), способные ра-ботатв в режиме счетчика одиночных фотонов [7]. Отметим, что у сканирующих микроскопов типов LSCM и SDCM частично остается фоновая флуоресценция объектов, находящихся вне фокуса лазерного луча.
Лазерная сканирующая оптическая микроскопия является удобным инструментом для получения многомерных изображений с высоким разрешением и контрастом [8, 9]. В конфокалвных микроскопах это достигается исполвзованием апертуры (конфокалвной диафрагмы) в плоскости изображения, которая ограничивает поток фонового рассеянного света. Источником такого света часто является рассеянный свет возбуждающего излучения из областей, находящихся за пределами фокалвной зоны, или флуоресценция из тех же областей. Возбуждающее излучение фокусируется объективом в точку, размер которой определяется толвко эффектами дифракции. Излучение возбуждает флуоресценцию, которая собирается тем же объективом и направляется в приемник. Конфокалвная диафрагма (иногда исполвзуется термин «pinhole») пропускает в приемник толвко то излучение, которое приходит из фокалвной области, отсекая любое излучение за пределами этой зоны. Приемник регистрирует сигнал, который однозначно привязан к координатам области возбуждения. Сигнал от каждой точки записывается в памятв компвю-тера, и затем на основе этих сигналов строится изображение. Такая поточечная съемка позволяет построитв изображение толвко на экране компвю-тера. Световой луч последователвно перемещается по всей исследуемой площади (сканирует ее). По-сколвку излучение флуоресценции собирается толв-ко из фокалвной области, то появляется возмож-ноств послойного сканирования при перемещении фокалвной области в глубв образца. Совокупноств изображений слоев позволяет построитв трехмерное изображение объекта, а методы компвютерной обработки изображений позволяют рассмотретв объ-
а) E
б)
2А
2А
Рис. 2 Схема возникновения флуоресцентного излучения
в традиционном методе (а) и в методе двухфотон-ной микроскопии (б).
Длина волны: Xex — возбуждающего излучения в традиционной флуоресцентной микроскопии; 2Xex — в двухфотонной микроскопии; Xem — излучаемого фотона
ект со всех сторон. Глубина сканирования зависит от длины волны возбуждения и поглощения флуоресценции более высоко лежащими слоями и может достигатв 500 мкм. Для получения более глубоко расположенного изображения исполвзует-ся более длинноволновое излучение.
Другое направление развития микроскопии связано с исполвзованием нелинейных эффектов при взаимодействии лазерных пучков. Принцип MPE (Multi Photon Exitation) — принцип мулвтифотон-ной микроскопии — основан на том, что генерация второй и третвей гармоник происходит толвко в области фокуса (рис. 2, 3) [10].
В нелинейных оптических микроскопах приме-нятв конфокалвную диафрагму нет необходимости, посколвку для проявления нелинейных оптических эффектов требуется значителвная плотноств мощности возбуждающего оптического излучения, которая достигается толвко в области фокуса объектива. Поэтому излучение, связанное с многофотонным возбуждением флуоресценции, и генерация второй и третвей гармоник имеют место в области
а)
б)
Рис 3
Условные зоны возникновения флуоресценции в двухфотонной микроскопии (а) и традиционной флуоресцентной микроскопии (б)
Как видно, в двухфотонной микроскопии флуоресценция возникает в локальной зоне. Отметим, что сечение взаимодействия для квантовых точек выше, чем для флуорофоров, поэтому условия возникновения нелинейного эффекта более мягкие
А
'e.x
А
А
'em
•em
фокуса, а рассеянное излучение на длине волны возбуждения легко устраняется оптическими фильтрами благодаря большому различию длин волн возбуждающего и собираемого излучений.
Нелинейные эффекты описываются наведенным дипольным моментом при поляризации вещества светом. Для описания нелинейного взаимодействия вектор поляризации Р можно представить в виде [11]
Р(г) = х(1)£(0 + х(2)Е(г)Е(г) + %{3)Е(г)Е(г)Е(г) + ...
Здесь первый член описывает линейный отклик материала на оптическое электрическое поле Е, второй член — нелинейную восприимчивость второго порядка (в том числе и генерацию второй гармоники), а третий член представляет различные нелинейные процессы четырехволнового смешивания (генерацию третьей гармоники, когерентное рамановское рассеяние, двухфотонное поглощение и др.). Волны, которые генерируются при нелинейном взаимодействии, описываются неоднородным волновым уравнением
п2 д2 Е 4п д2 РМЬ У2Е =--=--,
с2 д^ с2 д^
где нелинейная поляризация PNL (второй, третий и последующие члены предыдущего уравнения) возбуждает электрическое поле Е, приводя к ускорению электрических зарядов и генерации электромагнитного излучения с частотой нелинейной поляризации, которая отлична от частоты возбуждающего излучения; п — линейный показатель преломления; с — скорость света в вакууме.
Нелинейный оптический микроскоп [12] по составу измерительной системы, способу сбора сигнала и построению изображения почти полностью совпадает с конфокальным микроскопом. Как уже отмечалось, отсутствует только конфокальная диафрагма. Другим различием является то, что люминесцентное излучение при двухфотонном возбуждении имеет длину волны почти вдвое короче, чем возбуждающее излучение. Это означает, что для наблюдения люминесценции в видимой области спектра возбуждающее излучение должно быть инфракрасным. То же самое касается регистрации второй и третьей гармоник. При ИК-возбуждении излучение третьей гармоники попадает в УФ-область, что предъявляет соответствующие спектральные требования к оптическому тракту. С другой стороны, ИК-возбуждение более выгодно в случае применения нелинейной микроскопии в медицине и биологии, поскольку глубина проникновения возбуждающего излучения оказывается больше вследствие более слабого поглощения ИК-излучения биотканями по сравнению с видимым светом.
Другой особенностью нелинейной микроскопии является импульсное возбуждение в фемтосекунд-ной области, хотя иногда используется и пикосе-
кундная область. Связано это с тем, что для наблюдения нелинейных эффектов необходима высокая плотность мощности при сравнительно низкой средней мощности возбуждающего излучения. Высокая средняя мощность может привести к повреждению биообъектов, пиковая мощность тоже ограничена возможностью диэлектрического пробоя биоматериала. Оптимальными по ряду причин являются импульсы длительностью в несколько сотен фемтосекунд.
Вторая гармоника генерируется в среде без центра симметрии, а в системах с инверсионной симметрией она исчезает. Биомембраны часто имеют различное содержание липидов и белков по разные стороны мембраны, и на них хорошо генерируется вторая гармоника.
Третью гармонику можно наблюдать, только если симметрия в фокальной области нарушена введением границы раздела материалов с различными показателями преломления или различными восприимчи-востями третьего порядка. Многослойные структуры с правильно подобранной периодичностью усиливают интенсивность третьей гармоники. Биоприменения регистрации третьей гармоники связаны с визуализацией биомембран, стенок клеток, складок внутренних мембран в митохондриях и т. п.
Многофотонное поглощение тоже нелинейно. В результате такого нелинейного поглощения либо появляется эмиссия люминесценции, либо энергия релаксирует через безызлучательный процесс. Многофотонное поглощение при переходе молекулы из основного состояния в возбужденное соответствует энергии двух или трех фотонов. Однофотонное поглощение требует различной симметрии волновых функций основного и возбужденного состояний. Если симметрия одна и та же, то поглощения не происходит. В то же время при двухфотонном переходе симметрия основного и возбужденного состояний может быть одной и той же. Поэтому в спектрах двухфотонного поглощения можно наблюдать переходы, которые не прослеживаются в случае однофотонного поглощения.
Нелинейная оптическая микроскопия очень перспективна для изучения структуры биообъектов. Моделирование генерации второй и третьей гармоник с учетом тензора нелинейной восприимчивости позволяет из сравнения рассчитанного и наблюдаемого характера распределения излучения гармоник сделать выводы о структуре объекта [13]. Регистрация второй гармоники с учетом изменения поляризации в сравнении с поляризацией возбуждающего излучения является перспективным методом определения изменений коллагена раковых тканей по сравнению с нормальными тканями [14]. Таким образом, патологи могут определить опухолевые области на гистологическом образце для выявления или прогнозирования ракового заболевания.
Среди разных направлений современной флуоресцентной микроскопии необходимо отметить эн-
Междисциплинарная платформа «Биотехносфера»
доскопическую флуоресцентную микроскопию, в которой подача и сбор излучения осуществляются посредством оптоволокна [15—18].
Специальные методы флуоресцентной микроскопии высокого разрешения
При достижении дифракционного предела1 можно использовать специальные приемы, позволяющие «обойти» запрет и обеспечить разрешение в несколько единиц нанометров.
Метод 4Р1-микроскопии. Был предложен Ш. Хел-лом. Для улучшения разрешающей способности используют два лазера, расположенные с противоположных сторон [19]. С помощью системы зеркал и призм возбуждающий свет делится на два потока и направляется в объективы, фокусы которых совпадают [17]. Меняя длину одного из плеч такого интерферометра, можно добиться совпадения фаз двух световых волн в области фокуса. Образуется стоячая волна, при этом функция PSF в аксиальном направлении значительно сужается (теоретически в 4—7 раз), т. е. повышается аксиальная разрешающая способность.
STED-метод. Первоначально был реализован на импульсных режимах лазеров [20]. В настоящее время разработан более «продвинутый» (но по сути тот же) CWSTED-метод, работающий в непрерывном режиме.
Для улучшения разрешения в STED-методе необходимы два разных лазера: один — для возбуждения флуорофора2, а другой — для подавления возбуждения стимулированной эмиссией3. Это относится и к пульсирующей STED. Оба лазерных луча фокусируются объективом на анализируемую область образца и, будучи точно совмещенными, сканируют участок поверхности. Распределение интенсивности более длинноволнового луча представляет собой кольцо с малой областью в центре. Таким образом, внутри тороида STED не происходит подавления возбуждения. Форма кольца придается лазерному лучу при помощи высокоэффективного спирального вихревого фазового фильтра так, что размер пятна флуоресценции становится минимальным.
STORM-метод. Одним из новейших методов, применяемых в оптическом имиджинге, является метод стохастической оптической ßD-ре-конструкционной микроскопии (STORM-метод) [20], который позволяет получать изображения клеток с очень высоким разрешением, вплоть до молекулярного. Этот метод использует последовательное возбуждение молекул флуорофоров, окрашивающих объект, так чтобы каждая молекула бы-
а)-
б)
S1
Sa
Рис. 4 Пример FRET-взаимодействия между двумя
флуорофорами: а — молекула донора; б — молекула акцептора.
Пик эмиссии донора перекрывается с пиком возбуждения акцептора. Поскольку два белка находятся очень близко друг к другу (5 нм), происходит передача энергии от донора к акцептору
ла представлена в качестве одного дифракционного пятна. Это, в частности, возможно при использовании возбуждения малой мощности, статистически достоверно возбуждающего лишь малую часть присутствующих в объекте флуорофоров. Данный подход позволяет выявить локализацию каждой флуоресцентной молекулы с наноскопической точностью. Такие повторяющиеся циклы импульсов предоставляют возможность определять положения всех молекул, что при наложении дает изображение с крайне высоким разрешением и точными координатами каждой молекулы флуорофора. Идея случайной последовательной активации флуорофо-ров лежит в основе трех методов — STORM, PALM и FPALM, разработанных тремя независимыми лабораториями.
PALM-метод. Отличается от STORM-метода использованием свойства обесцвечивания флуоро-форов. Иными словами, возбужденные молекулы флуорофора, отделенные друг от друга, обесцвечиваются, и в дальнейшем высвечивается другая группа атомов.
Методы, на основе FRET-эффекта4. Этот эффект был открыт Фёрстером в 1946 г. Метод работает на весьма ограниченных расстояниях (менее 10 нм). FRET-механизм описывает передачу энергии между двумя флуорофорами (рис. 4). Энергия от донора к акцептору передается на малых расстояниях в результате резонанса между энергетическими уровнями, а вероятность процесса (и, следовательно, интенсивность излучения) зависит от расстояния между молекулами. Затем акцептор излучает энергию в видимой области спектра, которая регистрируется конфокальным микроскопом. Измерение энергии переноса обеспечивает возможность наблюдения белок-белковых взаимодействий и взаимодействия белков с рецепторами [21].
FLIM-метод 5. Это, по сути, разновидность флуоресцентной микроскопии, в которой дополнитель-
1 Он приблизительно равен половине длины волны, т. е. 200-300 нм.
2 Аргоновый лазер (488 и 514 нм).
3 Волоконный лазер (592 нм).
4 FRET — Förster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer — ^epcTepoBCKaa (^ayopecöeHTHaa) pe30HaHCHaa nepefla^a aHeprHH.
5 FLIM — fluorescence lifetime imaging pe»HM.
S
1
ная биоинформация получается за счет сопоставления характеристик флуоресцентного излучения за разные промежутки времени.
При наличии автофлуоресценции метод не требует приготовления образцов, меченных флуорофо-рами. На многофотонном микроскопе исполвзуется методика коррелированного во времени подсчета одиночных фотонов (TCSPC — time-correlated single photon counting). Метод представляет огромный интерес для патогистологических исследований тканей, полученных в ходе операции (интраопе-рационно) [22].
FLIM-изображения тканевых автофлуоресценций можно получитв всего за несколвко секунд при ис-полвзовании обычного микроскопа с широким полем зрения. Для практических клинических приложений (и для многих других приложений, включая изображения живых клеток и быстрый просмотр изображений) это качество желаемо или необходимо в целях формирования и визуализации FLIM-изображений в режиме реалвного времени. Была достигнута ско-роств регенерации 29 Гц при визуализации FLIM-изображений в режиме реалвного времени.
Среди прочих можно отметитв семейство методов, в которых исполвзуются режимы обесцвечивания и наблюдения процесса восстановления флуоресценции за счет диффузии молекул, помеченных метками, а также методы оценки свойств по спаду флуоресценции.
Флуорофоры
Все значителвные успехи в развитии флуоресцентной микроскопии высокого разрешения, спек-трофлуометрии и специалвных методов диагностики в биологии и медицине тесно связаны с открытием новых флуорофоров [23].
Перечислим наиболее важные классы природных и искусственных флуорофоров и принципы их классификации.
Природные флуорофоры принято делитв на три группы: аминокислоты, коферменты и пигменты. Флуоресцентные белки, которые можно рассматри-ватв и как природные, и как искусственные флуо-рофоры, выделяют в отделвный класс соединений [24]. При исследовании структуры и динамики биообъектов с помощвю природных и искусственных флуорофоров для получения необходимой информации можно исполвзоватв следующие параметры:
• интенсивноств люминесценции;
• спектр флуоресценции (положение максимума, полуширина);
• время жизни флуоресцентного состояния;
• характеристики поляризации (или анизотропии) флуоресценции;
• эффективноств резонансного переноса энергии.
Из 20 аминокислот, входящих в состав белков,
толвко три способны к фотолюминесценции в оп-
тическом диапазоне — триптофан, тирозин и фе-нилаланин.
Зачастую объектами исследования являются процессы, связанные с нефлуоресцирующими молекулами (например, молекулы ДНК или липиды не способны к люминесценции с необходимой ин-тенсивноствю). В таких случаях фотолюминесценции объекта добиваются введением в него специ-алвно подобранного флуорофора, который, хотя и является посторонним по отношению к исследуемой системе, имеет лучшие спектралвные свойства.
К искусственным флуорофорам предъявляются нижеследующие пятв требований [24]:
1) подходящие спектрально-люминесцентные характеристики.
Желательно, чтобы спектры поглощения и испускания флуорофора мало перекрывалисв со спектрами компонентов биообъекта, тогда при регистрации удастся из-бежатв помех со стороны фоновой люминесценции (автофлуоресценции);
2) высокий коэффициент молярной экстинкции.
Данный показателв позволяет исполвзоватв низкие
интенсивности для возбуждения люминесценции флу-орофора;
3) высокий квантовый выход флуоресценции.
Это свойство определяет интенсивную фотолюминесценцию флуорофора;
4) фотостабильность.
Многие люминесцирующие молекулы удобны для исследований, но быстро разрушаются под воздействием света даже видимого диапазона;
5) компактность молекулы.
Это важно при выборе искусственного флуорофора. Маленвкие молекулы легче проникают в биообъект и присоединяются к молекуле-мишени без существенного влияния на ее характеристики.
Искусственные флуорофоры называют также флуоресцентными зондами и флуоресцентными метками. В первом случае флуорофор связывается с интересующей молекулой-мишенвю нековалент-ными связями, во втором — ковалентными. Количество искусственных флуорофоров, применяемых для исследования биообъектов, за последние десятилетия выросло многократно.
Можно привести много примеров исследований, интересных специалистам разных профилей и объединенных биотехносферной тематикой: транспорт веществ через биомембраны, структурные перестройки, связанные с функционированием мембранных систем как in vitro, так и непосредственно в клетках и тканях. С помощвю зондов-трассеров диагностируются кровообращение1, бактериалвные инфекции и грибковые заболевания2.
1 После введения через вену раствора двунатриевой соли флуоресцеина (уранин) наблюдают желто-зеленую флуоресценцию губ и глаз.
2 Волосы флуоресцируют в желто-зеленом цвете при возбуждении 365 нм. Яйца, зараженные салвмонеллой, флуоресцируют ярко-зеленым светом сквозв скорлупу.
В экологических исследованиях с помощью зондов-трассеров осуществляют трассирование флуоресцирующим красителем сточных вод для определения области их распространения, направления подводных течений и т. д. Флуоресцируют канцерогенные углеводороды (3, 4-бензопирен, дибензатра-цен) в воздухе городов, дыме сигарет и т. п.; флуоресцируют нефтепродукты и лекарства (хинин, гризольфульвин и др.); флуоресцируют наркотики (морфин, героин и др.) в количестве до 0,02 мкг в пробе. Преимуществами флуоресцентных меток по сравнению с радиоактивными метками являются безопасность, дешевизна и высокая чувствительность.
Рассмотрим несколько классов флуоресцентных соединений и их основные свойства.
Гидрофобные мембранные зонды. Придание мембране флуоресцентных способностей заключается в процедуре распределения нерастворимого в воде вещества внутри неполярной области мембраны. Наиболее часто используемым мембранным зондом является БРН (1,6-дифенил-1, 3, 5-гексатриен). При смешивании этого флуорофора с суспензией мембран происходит полное связывание и люминесценция водной фазы БРН отсутствует.
Существуют мембранные зонды, чувствительные к потенциалу мембраны. За изменение параметров флуоресценции таких молекул могут быть ответственны несколько механизмов: изменение ориентации зонда или его локальной концентрации в мембране, влияние электрического поля на электронное распределение в зонде и др. Например, карбоцианиновые красители обычно реагируют на изменение потенциала распределением и/или агрегацией в мембране, а стириловые красители, по-видимому, реагируют непосредственно на электрическое поле.
Длинноволновые зонды. Флуоресценция зонда в красной или ближней ИК-области спектра — очень важное его преимущество при исследовании биообъектов. Это связано с тем, что такие зонды имеют также сдвинутую в длинноволновую область полосу поглощения. При возбуждении таких искусственных флуорофоров сводится к минимуму проблема фоновой флуоресценции биообъектов, а значит, повышаются чувствительность метода и точность определения интересующего параметра. Длинноволновыми зондами являются цианиновые красители Су 5, Су 7, флуоресцирующие при длинах волн более 650 нм. Недостатком этих красителей считается маленький (около 30 нм) стоксов сдвиг, что является причиной возникновения реабсорбции. Среди длинноволновых зондов присутствуют и производные родамина, и оксазиновые красители, фта-лоцианины и нафталоцианины.
Метки для ДНК. Собственная флуоресценция ДНК слабоинтенсивна и располагается в УФ-области, ее трудно использовать для исследования динамики макромолекулы. Но есть флуоресцент-
ные вещества, способные спонтанно связываться с ДНК и проявлять в связанном состоянии еще более интенсивную флуоресценцию. Для маркировки ДНК наиболее широко используется этидиум бромид (EtBr). Связывание EtBr с ДНК происходит через интеркаляцию ароматического кольца молекулы флуорофора между основаниями двух спиралей. Флуорофоры другого типа, например DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол), связываются с малой бороздкой ДНК. Интенсивность люминесценции DAPI возрастает в наибольшей степени, когда молекула этого красителя связывается с участками ДНК, имеющими много AT-пар нукле-отидов. Сделать молекулу ДНК люминесцентной может также применение флуоресцирующих аналогов оснований. В качестве аналога аденина применяется 2-аминопурин, аналогом гуанина служит изоксантоптерин.
Флуоресцентмые химические индикаторы. Существует ряд флуоресцентных зондов, которые меняют свои спектрально-люминесцентные характеристики вследствие взаимодействия с биологически важными ионами (Cl-, Na+, Ca2+). Например, флуоресценция химически чувствительного зонда MQAE [Щметоксикарбонилфенил)-6-метоксихинолиниума] подвергается тушению по динамическому механизму со стороны ионов хлора. Построение зависимости Штерна—Фольмера для такого тушения позволяет оценить концентрацию ионов Cl- в исследуемом образце. У флуорофора торговой марки «Fura-2» в присутствии ионов Ca2+ наблюдается смещение максимумов спектров люминесценции и возбуждения. По соотношению интенсивностей люминесценции при длинах волн, соответствующих несмещенному и смещенному максимумам, определяют концентрацию ионов кальция. У другого зонда — «Calcium Green» — в присутствии ионов Ca2+ интенсивность флуоресценции увеличивается, а смещения максимумов не происходит.
Флуоресцентные индикаторы найдены для многих видов молекул и ионов (Na+, K+, Mg2+, амины, фосфаты), а также для pH среды. Разработан целый ряд флуоресцентных красителей, которые используются в качестве меток макромолекул.
Флуорогенные зонды. Флуорогенные соединения — это вещества, приобретающие способность флуоресцировать только после модификации. С помощью флуорогенных субстратов измеряют активность разных ферментов. Например, 7-UmP (7-ум-белиферрил фосфат) используется для определения активности алкалинфосфатазы. Он начинает флуоресцировать после отщепления фосфатного фрагмента, катализируемого алкалинфосфатазой. Таким образом, рост интенсивности фотолюминесценции в исследуемом объекте характеризует скорость накопления продукта ферментативной реакции. Другой класс флуорогенных зондов обретает способность люминесцировать после связывания с ами-
ногруппами белков. Это явление используется для определения концентрации белков и низкомолекулярных пептидов. Для изучения работы ферментов служит также следующий флуорогенный прием. Белок связывается с двумя метками — флуорофо-ром и тушителем. Пока белок цел, флуорофор не люминесцирует. Если белок расщепляется специальным ферментом (например, протеазой) и флуорофор с тушителем оказываются на разных фрагментах исходного белка, то процесс тушения прекращается и образец начинает флуоресцировать.
Структурные аналоги биомолекул. Другим подходом к изучению функционирования нелюминесци-рующих биообъектов является создание структурных аналогов исследуемых молекул. Например, дегидро-эргостерол служит флуоресцентным аналогом холе-стерола и характеризуется спектрами поглощения и испускания с максимумами при 325 и 390 нм соответственно. Этот аналог был использован для изучения взаимодействия стероидов с мембранами.
Зонды для оценки вязкости. Квантовый выход флуоресценции веществ часто зависит от вязкости их микроокружения. Для флуорофора СС^ [9-(2-карбокси-2-циановинил)-юлолидин] в возбужденном состоянии характерен перенос заряда от аминогруппы к виниловой группе. В среде с высокой вязкостью такой процесс затрудняется, потому что молекула ССУ^ не может принять изогнутую конформацию, необходимую для переноса заряда, и квантовый выход этого флуорофора значительно увеличивается. Такие зонды применяются для измерения микровязкости мембран и характеристик центров связывания ферментов.
Флуоресцентные белки. Это протеины, люми-несцирующие и в видимой области спектра. К ним относятся фикобилипротеины, белки семейства зеленого флуоресцентного белка (СЕР) и недавно созданные фитофлуоры. Эти белки легко экспрессиру-ются в гетерогенных системах, устойчивы к про-теолизу и разным детергентам [25].
В 2008 г. Осаму Симомура, Мартин Чалфи и Роджер Тсьен получили Нобелевскую премию по химии «за открытие и разработку зеленого флуоресцентного белка СЕР» [26]. При этом подчеркивалось, что они удостоены премии за открытие СЕР и целую серию работ, которые привели к тому, что сегодня флуоресцентный белок позволяет увидеть реальные процессы в живом организме. Так, нынче ученые научились «прицеплять» СЕР-маркер к несветящимся белкам и тем самым видеть, как они двигаются, изменяются и работают в живом организме. С помощью СЕР также исследуют поведение различных клеток в организме: нервных клеток, пораженных болезнью Альцгеймера; Р-клеток поджелудочной железы, производящих инсулин; красных кровяных телец; макрофагов, защищающих организм [27, 28].
Уникальность СЕР определяется строением его флуорофора. Этот белок не присоединяет к себе
низкомолекулярную флуоресцирующую молекулу. Флуорофор GFP образуется из трех его собственных аминокислотных остатков без участия внешних кофакторов за исключением молекулярного кислорода. Цвет флуоресцентного белка кодируется только его геном. Иными словами, соединяя ген GFP с генами других белков, можно наблюдать во флуоресцентном микроскопе места и скорости образования этих белков и рост клеточных клонов, включая патогенные бактерии и раковые опухоли. Также стало возможным наблюдать размножение в подопытном организме разных вирусов, в том числе тех, которые содержат не ДНК, а РНК, т. е. ретровирусов (например, вируса иммунодефицита человека) [29—31].
Выделим семейство флуорофоров Alexa Fluor 1111. Эти сульфированные производные родамина характеризуются более высоким значением квантового выхода и повышенной фотостабильностью. Их спектры поглощения хорошо согласуются с традиционными лазерными линиями. Водорастворимые зонды Alexa Fluor удобно использовать для анализа живых клеток и тканей. Буквенно-цифровые имена коммерческих флуорофоров связаны со спектральными линиями возбуждения (например, Alexa Fluor 568 согласован со спектральной линией 568 нм аргонового лазера). Флуорофоры Alexa Fluor уже являются коммерческими реактивными промежуточными продуктами, их можно приобрести, например, в виде специализированных зондов. Конъюгатами могут быть лектин, декстрин, стрептавидин, авидин, а также вторичные антитела широкого выбора.
Сравнение свойств органических флуорофоров и коллоидных квантовых точек
Исследование фундаментальных биопроцессов требует быстрого и надежного обнаружения взаимодействия биомолекул друг с другом или с молекулами и ионами других видов. Для этого хорошо подходят методы флуоресценции, сочетающие высокое разрешение и чувствительность на уровне одиночных молекул. Диагностические возможности определяются физико-химическими свойствами используемого флуорофора — его химической структурой, размером и биосовместимостью. Свойства флуорофора влияют на предел и надежность обнаружения конкретной цели или события, определяют его пригодность для одновременного детектирования нескольких целей.
Подобные флуорофоры можно условно разделить на две группы.
Первая группа — молекулярные системы, включающие небольшие молекулы органических красителей, комплексы металлов с радикальными лигандами (например, лантаноиды с лигандами
хелатного типа) и флуорофоры биологического происхождения.
Вторая группа — нанокристаллические флуо-рофоры, проявляющие зависимость оптических и физико-химических свойств от размера частицы [32], в том числе коллоидные КТ на основе полупроводниковых соединений
АпВУ1, А1УВУ1 и Лшву.
Флюорофор любого типа должен:
• обладать возможностью оптического возбуждения без воздействия на окружающую биоматрицу и возможностью обнаружения излучения типовыми приборами;
• быть ярким, т. е. обладать одновременно высоким молярным коэффициентом поглощения на длине волны возбуждения и высоким квантовым выходом флуоресценции;
• диспергироваться в соответствующих буферных средах;
• быть стабильным в соответствующих условиях;
• обладать функциональными группами для обеспечения специфичной маркировки.
В зависимости от применения могут быть важны также геометрия и размеры маркера, возможность доставки его непосредственно в клетку, потенциальная токсичность метки и т. п.
Сравнительные свойства органических флуоро-форов и коллоидных КТ представлены в таблице. Оптические свойства органических красителей за-
висят от типа электронных переходов, известных для каждого класса красителей. Эмиссия органических красителей обычно происходит либо делока-лизованно (т. е. за счет всего хромофора), либо за счет внутримолекулярного переноса заряда. Многие органические красители (в том числе флуорес-цеин, родамины и большинство цианинов) относятся к первому типу и имеют относительно узкие полосы поглощения и излучения, малый стоксов сдвиг, высокие молярные коэффициенты поглощения и относительно высокий квантовый выход. Малый стоксов сдвиг приводит к перекрестному возбуждению молекул красителя. Большинство молекул второго типа (например, кумарины) имеют более широкие полосы поглощения и излучения и больший стоксов сдвиг, зависящий от растворителя или матрицы. Однако коэффициенты поглощения и квантовый выход таких красителей меньше, чем у красителей первого типа.
Оптические свойства коллоидных КТ определяются материалом нанокристалла, размером частиц, распределением по размеру и количеством поверхностных состояний, обусловленных химическими свойствами поверхности [33]. Типичные размеры КТ составляют 1—10 нм. В сравнении с органическими красителями спектр поглощения КТ непрерывно растет в сторону меньших длин волн, а спектр люминесценции узок и симметричен. Положение спектра поглощения и излучения
Сравнительные свойства органических красителей и коллоидных квантовых точек
Свойство Органические красители Коллоидные квантовые точки
Спектр поглощения Дискретные полосы с полушириной 35-100 нм Монотонный рост от края поглощения в сторону УФ-области, что существенно облегчает выбор длины волны возбуждающего излучения
Молярный коэффициент поглощения 2,5-104-2,5-105 М-1 см-1 105-106 М-1 см-1 в области первого экси-тонного пика, увеличивается в сторону меньших длин волн. Более крупные частицы обладают более высокими значениями
Спектр флуоресценции Несимметричная форма, часто с «хвостом» в длинноволновой области, полуширина 35-100 нм Симметричная гауссова кривая с полушириной 30-90 нм
Стоксов сдвиг Обычно <50 нм Обычно <50 нм для наночастиц видимого диапазона
Квантовый выход 0,5-1,0 (видимая область); 0,05-0,25 (ближняя ИК-область) 0,1-0,9 (видимая область), 0,2-0,7 (ближняя ИК-область)
Диспергируемость в водной среде Диспергируемые исходно За счет замещения исходных групп соответствующими лигандами либо исходным получением в водной среде
Прикрепление к биомолекулам За счет функциональных групп по разработанным протоколам. Часто определенные красители связываются с отдельными биомолекулами За счет прививания линкеров (химия ли-гандов). Некоторые биомолекулы связываются с отдельными квантовыми точками
Возможность картирования за счет многоцветной детекции Ограничена в возможностях цветового кодирования (3-4 цвета) Идеальны для многоцветной детекции, имеются примеры с пятью различными цветами
управляется размером частиц. Ширина пика в основном определяется распределением частиц по размеру. Широкий спектр поглощения позволяет свободно выбирать длину волны возбуждения, что существенно облегчает разделение возбуждающего излучения и люминесценции.
Маркировка биомолекул пептидов, белков или олигонуклеотидов при помощи флуорофора требует соответствующих функциональных групп для кова-лентного связывания или нековалентного прикрепления. Преимуществом органических красителей в данном случае является коммерческая доступность набора инструментов функционализирован-ных красителей в сочетании с установленными протоколами маркировки, очистки и характеризации биоконъюгатов красителей, а также информация о специфичной маркировке. Небольшой размер меток на основе органических красителей минимизирует трудности, связанные со стерическим расположением молекулы, которые могут влиять на функции биомолекулы. Кроме того, малые размеры молекул облегчают возможность прикрепления нескольких молекул флуорофоров к одной биомолекуле, что позволяет увеличить интенсивность сигнала флуоресценции.
Не наблюдается консенсуса в вопросе связывания квантовых точек с биомолекулами. Связывание водоспергируемых частиц может осуществляться электростатически через комплекс «авидин—био-тин» за счет ковалентных связей (например, кар-бодиимидное связывание между аминной и карбоксильной группами) или за счет полигистиди-новых групп. Кроме того, в ряде работ показана возможность прикрепления биомолекул вследствие замены ими исходных лигандов, покрывающих частицу в процессе синтеза. Последняя стратегия хорошо работает для маркировки олигонуклеотидов. Сложность создания протоколов связывания с биомолекулами обусловлена тем, что этот процесс существенно зависит от химических свойств поверхности наночастиц, т. е. от того, какими функциональными группами покрыта поверхность. А это, в свою очередь, зависит от способа получения на-ночастиц.
В отличие от органических красителей, где несколько молекул флуорофоров могут прикрепиться к одной молекуле, в КТ может наблюдаться обратная ситуация, когда к одной квантовой точке прикрепились несколько биомолекул. Это затрудняет определение ориентации биомолекулы и может влиять на ее функцию. Относительно большие пространственные размеры КТ могут затруднять доступ к частям клетки, если КТ используются в качестве флуорофоров клеточных органелл.
Внеклеточный таргетинг КТ обычно достигается за счет функционализации квантовых точек антителами, специфичными к рецепторам клеточной поверхности. В силу гидродинамического размера внутриклеточная доставка КТ является сложной
задачей по сравнению с органическими красителями.
Особенности синтеза и диагностики коллоидных КТ, полученных в полярных и неполярных средах, рассматривались нами ранее [34]. Коллоидный синтез КТ заключается в соединении двух растворов (источников ионов бинарных соединений) при температуре нуклеации и в присутствии ПАВ, стабилизирующих и солюбилизирующих поверхность наночастиц и препятствующих их агрегации. Время роста определяет размер нанокристаллов, в зависимости от которого происходит изменение зазора энергетической структуры, что обуславливает различные длины волн люминесценции нано-частиц.
Частицы могут синтезироваться непосредственно в водной среде, например, с использованием в качестве стабилизатора тиогликолевой кислоты [35]. Однако лучшие результаты дает синтез в органической неполярной среде с последующей заменой лигандов и соответствующим переводом частиц в водную фазу. Синтез в органической среде позволяет формировать нанокристаллы при более высоких температурах и получать таким образом более совершенные структуры, содержащие меньшее количество дефектов, приводящих к безызлу-чательной рекомбинации носителей заряда.
В то время как физика излучения в значительной мере обусловлена материалом, размером и поверхностными состояниями кристаллического ядра, химия связывания КТ с биообъектами определяется природой покрывающих частицу органических лигандов.
Очень важен вопрос цитотоксичности КТ как флуорофоров [36], поскольку в состав материала кристаллических ядер входят ионы токсичных элементов — кадмия и свинца. Решение этой проблемы также рассматривается с двух сторон — со стороны материала ядра и со стороны покрывающей его оболочки. Первое направление связано с получением КТ на основе широкозонных сульфида и селенида цинка, легирование которых позволит получить люминесценцию в видимой области спектра. Второе направление продиктовано блокированием поверхности за счет создания вокруг частицы плотной инертной оболочки (например, из диоксида кремния).
Применение коллоидных квантовых точек в биологии и медицине
У КТ есть большой потенциал применения в качестве зондов для in vivo и in vitro обнаружения и визуализации раковых клеток [37]. Ранее упомянутые свойства этих полупроводниковых нано-кристаллов (яркость флуоресценции, фотостабильность) позволяют получать отчетливые изображения с высоким соотношением «сигнал/шум».
Многоцветное окрашивание, основанное на люминесцентных нанокристаллах, также может использоваться в иммунологических исследованиях. Зависимость люминесценции КТ от их размера и возможность их одновременного возбуждения от одного источника обеспечивают мультиплексирование при люминесценции КТ. Смеси цветов и степеней яркости могут служить в качестве кодов для идентификации мишеней [38, 39].
Спектроскопические измерения показывают, что высокая однородность и воспроизводимость КТ-помеченых частиц делают возможным идентификацию частицы с точностью до 99,99 %. Исследования гибридизации молекулы ДНК демонстрируют, что кодирующий и целевой сигналы могут быть одновременно прочитаны на уровне отдельной частицы [40].
Наиболее простым способом связать КТ с маркерными молекулами является использование ави-дин-биотинового комплекса, тем более что многие биотинилированные антитела коммерчески доступны [41].
В опухолевой ткани раковые клетки, инфильтрирующие макрофаги и вновь образованные сосуды, формируют единицу опухолевой инвазии, которая составляет микроокружение опухоли и способствует дальнейшей инвазии и метастазированию опухоли. В связи с этим создание системы in situ визуализации этих трех компонентов очень важно для углубленной биопсии опухоли [42].
связываться с ФС, повышая их растворимость при высоких концентрациях, и заодно нести на себе антитела к опухолевым клеткам. Кроме того, КТ могут обеспечить значительное накопление фотосенсибилизаторов в ткани, а также выполнять роль антенны-светособирателя при ФДТ за счет высокого сечения одно- и двухфотонного поглощения [44].
Эффективность ФС зависит от его энергетического выхода и/или способности переносить электроны на молекулы кислорода с образованием активных форм кислорода (АФК). КТ считаются донорами электронов [45], их способность к резонансному переносу энергии (FRET) особенно полезна в сочетании с традиционными фотосенсибилизаторами ФДТ.
Комплексы переходных металлов, используемые для ФДТ, создали богатую базу для исследования противораковой терапии на основе КТ. В возбужденном состоянии эти комплексы рассеивают энергию через высвобождение электронов, потерю лигандов (или их замещение) либо через перенос энергии (в виде электронов) соседним молекулам кислорода (или другим окружающим молекулам). Так, возбужденное состояние комплексов переходных металлов тушится в реакции с кислородом, находящимся в основном состоянии, и приводит к образованию огромного количества АФК. А эти активные формы, в свою очередь, быстро запускают окислительно-восстановительные реакции, приводящие к повреждению ДНК и разрушению опухолевой ткани.
Фотодинамическая терапия с использованием КТ
Фотодинамическая терапия (ФДТ) — часть фотохимиотерапии, при которой помимо света и препарата необходим кислород. Введенные в организм молекулы фотосенсибилизатора избирательно фиксируются на мембранах опухолевых клеток и митохондриях. Максимальная концентрация препарата в тканях достигается через 24—72 часа. При лазерном облучении фотосенсибилизированной опухолевой ткани нетоксичный триплетный кислород (IIIO2) переходит в синглетный (IO2) кислород, обладающий выраженным цитотоксическим действием, что приводит к разрушению клеточных мембран опухолевых клеток. Синглетный кислород, несмотря на короткое время действия, успевает полностью разрушить опухолевые клетки. При этом цитотоксический эффект зависит от концентрации фотосенсибилизатора и глубины проникновения света в ткань опухоли [43].
КТ позволяют повысить эффективность метода ФДТ, поскольку способны улучшить свойства фотосенсибилизаторов (ФС). Сами по себе фотосенсибилизаторы плохо растворимы в воде, их трудно направить к специфической ткани и контролируемо возбуждать in vivo, в то время как КТ могут
Применение КТ во флуоресцентной in situ гибридизации
FISH1 — это цитогенетический метод детекции численных (анеуплодия) и структурных (транслокация, делеция) аномалий хромосом на метафаз-ных хромосомах или в интерфазных ядрах. С помощью FISH-метода можно идентифицировать целые хромосомы, хромосомно-специфичные области или однокопийные уникальные последовательности, в зависимости от используемых методик маркировки. Принцип FISH-метода заключается в гибридизации, т. е. связывании ДНК-зонда с хромосомной ДНК исследуемого образца пациента. Зонд представляет собой небольшой фрагмент ДНК, помеченный флуоресцентным красителем, который связывается с определенным участком хромосомы. FISH-метод прост в исполнении, имеет высокую чувствительность (можно обнаруживать индивидуальные гены) и высокую множественность (в одном препарате можно использовать несколько зондов).
Не имеющие аналогов особенности флюоресценции KT позволяют получать более стабильное изображение, облегчающее количественный анализ препаратов, созданных FISH-методом, в научных
1 FISH (fluorescence in situ hybridization) — флуоресцентная гибридизация in situ.
и клинических исследованиях. Исследования in vitro и тесты на клетках показали, что при сопряжении фрагментов ДНК с КТ сохраняется их способность комплементарно взаимодействовать с на-тивной ДНК. Прямая многоцветная визуализация нескольких генетических последовательностей была выполнена на бактерии Escherichia coli FISH-методом с использованием КТ [1]. Был разработан FISH-протокол, способный использовать до шести различных ДНК-зондов одновременно, с применением смеси КТ и обычных флуорофоров, которые при 4Р1-микроскопии обеспечивают разрешающую способность 100 нм.
При раковых опухолях FISH-метод служит для обнаружения НЕК2-амплификации гена, что позволяет выявить пациентов, которые будут реагировать на терапию герцептином (трастузумабом) [46].
Доставка лекарств
Для мониторинга доставки лекарств в режиме реального времени ядро неорганических наноча-стиц (КТ, магнитные наночастицы и лантанид-до-пированные наночастицы высокого разрешения) покрывается полимером (для повышения биостабильности и биосовместимости), а к полимеру прикрепляются направляющие агенты (например, эпи-дермальный фактор роста, лекарственный препарат и другие функциональные группы). Ожидается, что магнитные наночастицы с полимерным покрытием будут служить средством доставки препарата из-за наличия у них магнитного момента [47—49].
Химия поверхностных явлений особенно важна для того, чтобы избежать воздействия ретикулоэн-дотелиальной системы, которая является частью иммунной системы, и увеличить время существования в кровотоке. К тому же они содержат флуоресцентную метку отслеживания перемещения комплекса [50].
В последние годы КТ как транспортеры препаратов вызывают колоссальный интерес среди исследователей в связи с отработкой техники поверхностной модификации КТ водорастворимым покрытием [меркаптоуксусная кислота, меркаптоэтиламин и полиэтиленгликоль (PEG)]. Поверхностные группы легко связываются с молекулами препарата кова-лентными связями или электростатическим взаимодействием. Отслеживание флуоресцентной метки у животных позволит оценить специфичность и эффективность этой доставки, а также скорость выведения препарата. Эти преимущества позволят облегчить диагностику заболевания1 и уточнить пути доставки препарата [51—54].
КТ позволяют отследить процесс связывания, интернализации и движения клеточной мембраны
1 Магнитные наночастицы в настоящее время активно исследуются в качестве следующего поколения агентов МРТ-контраста.
в результате эндоцитоза векторной ДНК. А связывание KT пептидами, проникающими в клетку, предоставляет возможность расширить технику внутриклеточной доставки белкового груза. Tаким образом, KT могут использоваться для адресной доставки препаратов при химиотерапии, что повысит вероятность благоприятного исхода [бб].
Большим терапевтическим потенциалом обладают варианты адресной доставки лекарств с применением комбинации по крайней мере двух различных KT: одна ориентирована на доставку препарата, а другая используется в роли «маяка» благодаря ее «выдающимся» люминесцентным свойствам.
Новым направлением химиотерапии является применение углеродных нанотрубок (ÓHT). Первичные наблюдения in vitro показали, что комплексы (УHT—KT—EGF) попадают в раковые клетки за счет связывания EGF c его рецепторами на поверхности клеток. Сходные результаты были получены при дальнейшем исследовании in vivo. Tак, после инъекции комплекса УHT—KT—EGF живым мышам он (комплекс) селективно связывался клетками плоскоклеточного рака головы и шеи. Для контроля вводился комплекс УHT—KT, и в течение 20 мин наблюдалось выведение комплекса из области опухоли. Добавление в комплекс цисплати-на позволит убивать раковые клетки и уменьшать объем опухоли.
Дальнейшие исследования в области наномеди-цины направлены на разработку универсальной системы на основе ÓHT, содержащей лекарственный препарат и по крайней мере три типа KT (с разными спектрами испускания для различных целей) [бб]. Первый тип KT должен светиться постоянно, чтобы отслеживать поступление комплекса в ткань, оставшиеся две должны быть «выключены». Второй тип KT должен начать флуоресцировать при высвобождении противоракового препарата, а третий должен «включаться» в присутствии белков, появляющихся в процессе апоптоза. Tаким образом, вторая и третья метки будут сигнализировать о том, что препарат достиг цели и, соответственно, подействовал на опухоль.
В лаборатории клеточной биологии НИИАГ им. Д. О. Отта [б7] используется конфокальная микроскопия с органическими флуоресцентными красителями.
С помощью маркера эпителиальных клеток ци-токератина-В (CK-B) окрашивание фиксированной параформальдегидом культуры проводилось с применением первичных моноклональных мышиных антител против СК-В (Dako, USA; разведение 1 : б0) и вторичных козьих антител против иммуноглобулинов мыши, конъюгированных с Alexa Fluor б47 (Abcam, UK, разведение 1 : 1000) (рис. б см. на 3-й стороне обложки). При культивировании клеточного материала количество железистых клеток уменьшалось по мере пассирования, что может быть об-
а)
UV Excitation РгаЬе
Alexa 647
450 550 650
Wavelength (nm)
450 550 650
Wavelength (nm)
Рис. 6
Двухцветное детектирование нуклеиновых кислот (ДНК) на основе квантовых точек и резонансной передачи энергии (FRET): а — одновременное возбуждение зеленой и красной КТ в растворе возможно светом из ультрафиолетовой области без значительного возбуждения красителей Cy 3 и Alexa 647 (пара «зеленая КТ-Cy 3» использована для анализа SMN1 последовательности нуклеотидов, а пара «красная КТ-Alexa 647» — для анализа LacZ последовательности); б — ожидаемые профили эмиссии излучения, где выделенные штриховыми прямоугольниками области представляют особый интерес для анализа [58]. Рисунок воспроизведен с разрешения авторов
условлено быстрыми темпами деления фибробла-стоподобных стромальных клеток и их лучшими адгезивными способностями. Таким образом, для создания модели эндометрия in vitro необходимо отработать методику сохранения популяции эпи-телиоподобных клеток.
При исследовании образцов ткани с использованием флуоресцентных красителей криосрезы ткани плаценты были окрашены первичными поликло-нальными кроличьими антителами против плацентарного лактогена (Abcam, UK, разведение 1 : 250) и первичными моноклональными мышиными антителами против виментина (Abcam, UK, разведение 1 : 1000). Ядра клеток докрашивали Hoechst 33258 (Sigma, USA). Таким образом, получали двойное окрашивание, т. е. выявляли в образце два белка одновременно.
Заключение
В статье приведен краткий обзор основных этапов развития флуоресцентной микроскопии, включая последние достижения. Рассмотрены перспективы приборостроения и разработки искусственных флуорофоров. Особое внимание уделено синтезу коллоидных КТ и их применению в качестве биомаркеров.
Необходимо подчеркнуть, что не всегда следует противопоставлять коллоидные КТ флуоресциру-
ющим белкам или другим флуорофорам. Эти материалы могут эффективно дополнять друг друга, обеспечивая получение новой информации.
Оптические методы анализа ДНК путем регистрации факта гибридизации (дегибридизации) ее двойной спирали играют важную роль в разработке автоматизированных методов экспресс-анализа ДНК [58].
Одно из наиболее популярных средств оптического анализа для детектирования нуклеиновых кислот — биосенсоры на основе оптических волокон применительно к детектированию патогенов и генетическому анализу [59]. Однако одновременное детектирование нескольких последовательностей нуклеотидов требует либо двухцветного возбуждения, либо нескольких чувствительных элементов в общем анализируемом растворе. Комбинируя широкие спектры поглощения квантовых точек со стимулированной эмиссией при резонансной передаче энергии по механизму Фёрстера (FRET), можно развить подход к многоцветной диагностике нуклеиновых кислот. Такая диагностика использует один источник возбуждения, позволяет проводить измерения объемных образцов и не требует набора отдельных дискретных чувствительных элементов для каждого анализируемого образца [60, 61].
Светящиеся зеленым цветом КТ меньших размеров присоединены к олигонуклеотидам пробника (тестирующая цепочка нуклеиновых кислот), которые являются дополнительными по отноше-
нию к последователвности нуклеотидов анализируемого образца (генетическое нарушение, например атрофия мышц спины). Аналогично, эмитирующие красный свет КТ болвшего размера присоединены к пробникам для диагноза патогена (E. coli). После гибридизации комплексы, состоящие из зеленых или красных КТ и отделвных нитей ДНК, объединяются с последователвностями нуклеотидов анализируемого образца, маркированными красителями Cyanine 3 (Cy 3) и Alexa Fluor 647 (Alexa 647) соответственно. КТ действуют как доноры, а красители — как акцепторы. Резулвтатом является одновременная эмиссия из красителей-акцепторов Cy 3 и Alexa 647 (рис. 6). Когда олигонуклеотиды-проб-ники (probe oligonucleotides) были присоединены к КТ, факт их гибридизации с анализируемыми ну-клеотидами (target oligonucleotides), помеченными красителями Cy 3 или Alexa 647, был зарегистрирован по флуоресценции красителей за счет FRET-эффекта. Этот сигнал флуоресценции красителей как раз и является аналитическим сигналом.
Помимо возможности многоцветного анализа на одном и том же чувствителвном элементе этот метод устойчив к фотообесцвечиванию флуорофо-ров. Органические флуорофоры возбуждаются не прямым путем, а через передачу энергии от доноров к красителям.
Авторы благодарят заведующего кафедрой микро- и наноэлектроники СПбГЭТУ «ЛЭТИ» д-ра техн. наук, проф. В. В. Лучинина за поддержку и полезное обсуждение.
Исследования выполнены в рамках гранта Российского научного фонда (проект №14—15—00324).
Литература
1. Приезжев А. В., Тучин В. В., Шубочкин Л. П. Лазерная диагностика в биологии и медицине. М.: Наука. 1989. 240 с.
2. Minsky M. Memoir on inventing the confocal scanning microscope / Scanning. 1988. Vol. 10. P. 128-138. (http:// web.media.mit.edu/-minsky/papers/ConfocalMemoir.html)
3. LSM 510 and LSM 510 META. Laser Scanning Microscopes. Operating Manual. Release 3.2. http://phys.web.ru/db/ msg/1182209/
4. Introduction to Spinning Disk Confocal microscopy [Электронный ресурс] / Электр. текст. дан. 2012. Режим доступа http://zeiss- campus.magnet.fsu.edu/articles/spinningdisk/ introduction.html / свободный
5. Inoue S., Inoue T. Direct-view high-speed confocal scanner: the CSU-10 // Methods in Cell Biology. 2002. Vol. 70. P. 87-127.
6. High-speed 1-frame/ms scanning confocal microscope with a microlens and Nipkowdisks / T. Tanaami, S. Otsuki, N. Tomosada [et al.] // Applied Optics. 2002. Vol. 41. P. 4704-4708.
7. Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed, and resolution / C. G. Coates, D. J. Denvir, N. G. McHale [et al.] // J. Biomed. Opt. 2004. Vol. 9. N 6. P. 1244-1252
8. Confocal microscopy methods and protocols / Ed. S. W. Paddock. N.-Y.: Humana Press, 1999. 464 p.
9. Diaspro A. Confocal and two-photon microscopy: foundations, applications and advances. N.-Y.: Wiley-Liss, 2002. 567 p.
10. Egner A., Andersen V., Hell S. W. Comparison of the axial resolution of practical Nipkow-disk confocal fluorescence microscopy with that of multifocal multiphoton microscopy: theory and experiment // J. Microscopy. 2002. Vol. 206. Pt. 1. P. 24-32.
11. Boyd R. W. Nonlinear optics. Amsterdam: Academic Press, 2003. 578 p.
12. Barzda V. Non-Linear Contrast Mechanisms for Optical Microscopy // Biophysical Techniques in Photosynthesis. Vol. II. P. 35-54.
13. Sandkuijl D., Tuer A. E., Tokarz D. [et al.] Numerical second-and third-harmonic generation microscopy // J. Opt. Soc. Am. B. 2013. Vol. 30. N 2. P. 382-395.
14. Golaraei A., Cisek R., Krouglov S. [et al.] Characterization of collagen in non-small cell lung carcinoma with second harmonic polarization microscopy// Biomedical Optics Express. 2014. Vol. 5. N 10.
15. Gono K. An introduction to high-resolution endoscopy and narrowband imaging / J. Cohen // Advanced digestive endoscopy: comprehensive atlas of high resolution endoscopy and narrowband imaging. Oxford, UK: Blackwell Publishing Ltd. 2007. P. 9-22.
16. Wang K. K., Okoro N., Prasad G. [et al.] Endoscopic evaluation and advanced imaging of Barrett's esophagus // Gastrointest. Endosc. Clin. N. Am. 2011. Vol. 21. N 1. P. 39-51.
17. Штейн Г. И. Руководство по конфокальной микроскопии. СПб.: ИНЦ РАН, 2007. 77 с.
18. Handbook of Biological Confocal Microscopy / Ed. J. B. Pawley. Springer, 2006. 988 p.
19. Феофанов А. В. ^ектральная лазерная сканирующая конфокальная микроскопия в биологических исследованиях // Успехи биол. химии. 2007. № 47. С. 371-410.
20. Митрошина Е. В. Оптический имиджинг в приложении к исследованию нейробиологических систем мозга: учеб.-ме-тодич. пособие. Нижний Новгород: ННГУ им. Н. И. Лобачевского, 2012. http://window.edu.ru/resource/482/79482
21. Amy J. Lam, Fran3ois St-Pierre, Yiyang Gong [et al.]. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins // Nature Methods. 2012. N 9:10. P. 1005-1012.
22. Ragazzi M., Piana S., Longo С. [et al.] Fluorescence confocal microscopy for Pathologists // Modern Pathology. 2014. Vol. 27. P. 460-471.
23. Сайфитдинова А. Ф. Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов. СПб.: СПбГУ, 2008.
24. Фотобиофизика. Версия 1.0 [электронный ресурс]: электр. учеб. пособие / И. Е. Суковатая, В. А. Кратасюк, В. В. Ме-жевикин и др. Красноярск: ИПК СФУ, 2008.
25. Божокин C. Д., Зегря Г. Г. , Мынбаев К. Д. и др. Квантовые точки в биологии и медицине: учеб. пособие. СПб.: СПбГПУ, 2011.
26. Roger Y. Tsien 2009 Constructing and Exploiting the Fluorescent Protein Paintbox (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed. 48: 5612-5626.
27. Степаненко О. В., Верхуша В. В., Кузнецова И. М. [и др.] Флуоресцентные белки: физико-химические свойства и использование в клеточной биологии // Цитология. 2007. Т. 49. № 5. С. 395-420.
28. Frischknecht F., Martin B., Thiery I. [et al.] Using green fluorescent malaria parasites to screen for permissive vector mosquitoes // Malaria J. 2006. Vol. 5. P. 23-30.
29. Olson E. S., Whitney M. A., Friedman B. [et al.] In vivo fluorescence imaging of atherosclerotic plaques with activatable cell-penetrating peptides targeting thrombin activity // Integr. Biol. 2012. N 4. P. 595-605.
30. Savariar E. N., Felsen C. N., Nashi N. [et al.] Real-time In 47. Vivo Molecular Detection of Primary Tumors and Metastases
with Ratiometric Activatable Cell-Penetrating Peptides // Cancer Res. 2013. N 73:2. P. 855-864.
31. Davalos D., Baeten K. M., Whitney M. A. [et al.] Early 48. Detection of Thrombin Activity in Neuroinflammatory Disease // Annals of Neurology. 2014. N 75. P. 303-308.
32. Мусихин С. Ф., Александрова О. А., Лучинин В. В. [и др.] Полупроводниковые коллоидные наночастицы в биологии и медицине // Биотехносфера. 2012. № 5-6. С. 40- 49. 48.
33. Олейников В. А. Полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы (квантовые точки) в белковых биочипах // Биоорганическая химия. 2011. T. 37. № 2. C. 171189. 50.
34. Матюшкин Л. Б., Александрова О. А., Максимов А. И. [и др.] Особенности синтеза люминесцирующих полупроводниковых наночастиц в полярных и неполярных средах // Биотехносфера. 2013. № 2 (26). С. 27-32. 51.
35. Мазинг Д. С., Александрова О. А., Матюшкин Л. Б. [и др.] Синтез коллоидных квантовых точек селенида кадмия в водной среде // Известия СПбГЭТУ «ЛЭТИ». 2014. Т. 7. 52. С. 15-19.
36. Derfus A. M., Chan W. C., Bhatia S. N. Probing the Cytotoxicity of Semiconductor Quantum Dots // Nano Letters. 2004. Vol. 4. N 1. P. 11-18. 53.
37. Hu M., Yan J., He Y. [et al.] Ultrasensitive, multiplexed detection of cancer biomarkers directly in serum by using a quantum dot-based microfluidic protein chip // ACS Nano. 54. 2009. N 4. P. 488-494.
38. Gill R., Zayats M., Willner I. Semiconductor quantum
dots for bioanalysis // Angew Chem Int Ed Engl. 2008. 55. Vol. 47(40). P. 7602-7625.
39. Han M. Y., Gao X. H., Su J. Z. Quantum-dot-tagged microbeads for multiplexed optical coding of biomolecules //
Nie, S. Nat Biotechnol. 2001. Jul. N 19(7). P. 631. 56.
40. Eastman P. S., Ruan W. M., Doctolero M. [et al.] Chen FQF: Qdot nanobarcodes for multiplexed gene expression analysis // Nano Letters, 2006. N 6. P. 1059-1064. 57.
41. Goldman E. R., Clapp A. R., Anderson G. P. [et al.] Mattoussi, Multiplexed toxin analysis using four colors of quantum dot fluororeagents // Anal Chem. 2004. Feb 1. N 76(3). P. 684-688.
42. Hu W.-Q., Fang M., Zhao H.-L. [et al.] Tumor invasion unit 58. in gastric cancer revealed by QDs-based in situ molecular imaging and multispectral analysis // Biomaterials. Vol. 35. 2014. P. 4125-4132. 59.
43. Гельфонд М. Л. Фотодинамическая терапия в онкологии // Практическая онкология. 2007. Т. 8. № 4.
44. Bakalova R., Zhelev Z., Aoki I. Kanno Chemical nature and structure of organic coating of quantum dots is crucial
for their application in imaging diagnostics / Int. J. Nano- 60. medicine. 2011. N 6. P. 1719-1732.
45. Clapp A. R., Pons T., Medintz I. L. [et al.] Two-photon excitation of quantum-dot-based fluorescence resonance energy transfer and its applications // Adv. Mater. 2007. 61. Vol. 19. P. 1921-1926.
46. Xiao Y., Barker P. E. Semiconductor nanocrystal probes for human metaphase chromosomes // Nucleic Acids Res. 2004. Feb. 11. N 32(3). e28.
Babayan V., Kazantseva N. T., Moucka R. [et al.] Combined effect of demagnetizing field and induced magnetic anisotropy the magnetic properties of manganesezinc ferrite composites // JMMM. 2012. Т. 324. N 2. P. 161-172. Bagalkot V., Zhang L., Levy-Nissenbaum E. [et al.] Quantum dot-aptamer conjugates for synchronous cancer imaging, therapy, and sensing of drug delivery based on bi-fluorescence resonance energy transfer // Nano Lett. 2007. N 7(10). P. 3065-3070.
Kim J., Kim H. S., Lee N. [et al.] Multifunctional uniform nanoparticles composed of a magnetite nanocrystal core and a mesoporous silica shell for magnetic resonance and fluorescence imaging and for drug delivery// Angew Chem Int Ed Engl. 2008. Vol. 47(44). P. 8438-8434. Yoon T.-J., Kim J. S., Kim B. G. [et al.] Multifunctional nanoparticles possessing a «magnetic motor effect» for drug or gene delivery // Angew Chem Int Ed Engl. 2005. Vol. 44(7). P. 1068-1071.
Гареев К. Г., Лучинин В. В., Мошников В. А. Магнитные наноматериалы, получаемые химическими методами // Биотехносфера. 2013. № 5 (29). C. 2-13. Jablonski A. E., Humphries W. H., Payne C. K. Pyrenebu-tyrate-mediated Delivery of Quantum Dots Across the Plasma Membrane of Living Cells // J. Phys Chem B. 2012. N 114(30). P. 9946.
Medintz I. L., Berti L., Pons T. [et al.] A reactive peptidic linker for self-assembling hybrid quantum dot-DNA bio-conjugates // Nano Lett. 2007. N 7(6). P. 1741-1748. Ravizzini G., Turkbey B., Barrett T. [et al.] Nanoparticles in sentinel lymph node mappingInterdiscip // Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2009. N 1(6). P. 610-623. Multifunctional Nanoparticles for Drug Delivery Applications: Imaging, Targeting and Delivery, Nanostructure Science and Technology / Ed. S. Svenson and R. K. Prud'homme. Springer Science+Business Media, LLC, 2012. de La Zerda A., Gambhir S. S. Drug delivery: keeping tabs on nanocarriers // Nature nanotechnology. 2007. N 2 (12). P. 745.
Малинин В. В., Дурнова А. О., Полякова В. О. Факторы роста и молекулы адгезии эндотелия сосудов как молекулярные мишени для создания пептидных лекарственных препаратов против атеросклероза // Молекулярная медицина. 2013. № 3. С. 53-55.
Мусихин С. Ф., Ильин В. И. Методы нанотехнологии в биологии и медицине // Научно-технические ведомости СПбГПУ. 2008. № 3. C. 183-190.
Major A., Barzda V., Piunno P. A. [et al.] An extended cavity diode-pumped femtosecond Yb:KGW laser for applications in optical DNA sensor technology based on fluorescence lifetime measurements // Optics Express. 2006. Vol. 14. N 12. P. 5285-5294.
Algar W. R., Krull U. J. Luminescence and stability of aqueous thioalkyl acid capped CdSe/ZnS quantum dots correlated to ligand ionization // Chem. Phys. Chem. 2007. Vol. 8. P. 561-568.
Algar W. R., Krull U. J. Towards multi-colour strategies for the detection of oligonucleotide hybridization using quantum dots as energy donors in fluorescence resonance energy transfer (FRET) // Analytica Chimica Acta. 2007. Vol. 581. P. 193-201.
