CC BY
253
УДК 661.8...5, 577.113.4, 547.963.32, 544.77.032
С. Ф. Мусихин1' 2, канд. физ.-мат. наук, доцент, О. А. Александрова1, канд. физ.-мат. наук, доцент, В. В. Лучинин1, д-р техн. наук, зав. кафедрой,
A. И. Максимов1, канд. физ.-мат. наук, доцент,
B. А. Мошников1, 2, д-р физ.-мат. наук, профессор,
1 ФГОБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный электротехнический университет "ЛЭТИ"»;
2 ФГОБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный политехнический университет»
Полупроводниковые коллоидные наночастицы в биологии и медицине
Ключевые слова: квантовые точки, биосенсор. Key words: quantum dots, biosensor.
Представлен обзор современных методов изготовления и управления параметрами полупроводниковых коллоидных квантовых точек для применения в биологии и медицине. Особо выделяется направление синтеза бионаномаркеров с использованием нуклеиновых кислот. Рассмотрено применение квантовых точек в качестве селективного средства повышения контраста изображения и для разработки биосенсоров.
Условия применения квантовых точек для биологических исследований
Успехи нанотехнологии повлекли за собой расширение видов наночастиц, применяемых в биосенсорах для увеличения контраста изображения биологических объектов, для терапевтических целей и доставки лекарственных препаратов по месту назначения. У многих коллоидных наночастиц есть образцы, у которых по крайней мере один из размеров находится в диапазоне от 1 до 100 нм. Они специально спроектированы для клеточной биологии, медицинских исследований и применений, а также для разработки биосенсоров. Фундаментальные исследования взаимодействия наночастиц с биологическими системами очень важны для прогресса нанотехнологий в медицине.
Средства получения изображения, включая изображения с помощью магнитного резонанса (МРТ), компьютерную томографию, позитронно-эмиссион-ную томографию, биолюминесцентные изображения, флуоресцентные изображения и другие многофункциональные системы изображений, были использованы для исследования рака, болезней сердца и генетических заболеваний. МРТ предо-
ставляет трехмерную анатомическую и структурную информацию с высоким разрешением, в то время как флуоресценция визуализирует процессы на клеточном уровне. Оптические методы обеспечивают более высокое пространственное разрешение (< 1 мкм) по сравнению с МРТ (> 10 мкм). Одним из последних достижений в области флуоресцентного изображения и сенсоров является применение наночастиц, в частности полупроводниковых квантовых точек (КТ).
Коллоидные КТ — это полупроводниковые на-нокристаллы диаметром от 1 до 10 нм, которые обладают управляемой фотолюминесценцией (ФЛ) благодаря эффекту размерного квантования [1]. В спектроскопии используется целый ряд полезных свойств КТ:
• узкая симметричная форма линии люминесценции с полной шириной на половине амплитуды 25—35 нм;
• стоксовский сдвиг, который может быть более 200 нм;
• квантовый выход более 20 % в водных растворах;
• время жизни (возможно, более 10 нс);
• высокая устойчивость к фотообесцвечиванию (фототушению).
Все перечисленное выгодно отличает КТ от органических красителей GFP (green fluorescence protein — белок с зеленой флуоресценцией) и YFP (yellow fluorescence protein — белок с желтой флуоресценцией), широко применяемых в клеточных исследованиях. Яркость КТ обеспечивает высокую чувствительность при применении в качестве меток (маркеров) и биопроб. Комбинация узкой эмиссионной линии, большого стоксовского сдвига и длительного времени жизни предоставляет возможность использовать смесь КТ, чтобы одновременно отслеживать раз-
личные объекты для сложного многокомпонентного анализа и визуализации (получения изображения). Дополнительные возможности спектроскопии появляются на основе большого сечения двухфотонного поглощения КТ, которое может быть на два или три порядка больше, чем для типичных флуоресцентных красителей [2], и КТ, которые обладают ФЛ в ближней инфракрасной области спектра [3].
Устойчивость к фотообесцвечиванию и яркая люминесценция обычно отмечаются как основные преимущества КТ для исследований живого организма. Так, КТ применяли в конфокальной, эпифлуоресцентной микроскопии и микроскопии полного внутреннего отражения, причем наблюдения проводились в течение нескольких часов. Изменение размера и (или) состава КТ также позволяет настроить эмиссию ФЛ в таких пределах ближней инфракрасной области спектра, которые подходят для эффективного получения изображения глубоко лежащих слоев биологических тканей в области оптического окна с диапазоном 650—1350 нм, где биологические компоненты слабо взаимодействуют с оптическими сигналами. При получении изображений живого организма следует учитывать:
• гемоглобин, который сильно поглощает излучение в видимой части спектра (с длиной волны 300-600 нм);
• воду и липиды, через которые проходит изучение в видимой области спектра, но они сильно поглощают излучение в инфракрасной области (с длиной волны 1400-2000 нм);
• автофлуоресценцию, например, эндогенных флуорофоров кожи. Последние включают никотин-амид аденин динуклеотид / никотинамид аденин динуклеотид фосфат (эмиссия волн длиной 425 нм), флавин аденин динуклеотид (эмиссия волн длиной 520 нм) и порфирины (эмиссия волн длиной 625 нм), которые дают относительный вклад 75, 25 и 2 % соответственно [4].
Хотя КТ имеют преимущества, ценные для спектроскопии и получения изображений, у них есть и нежелательные свойства: многоэкспоненциальный спад ФЛ и мерцание на уровне отдельных КТ. Кроме того, практическое применение КТ в отношении живого организма сопряжено с тремя проблемами:
• высокий фоновый уровень удержания и накопления КТ в неопределенных местах;
• неполное удаление КТ из тела,
• трудность изготовления КТ с достаточно малым полным размером (гидродинамическим диаметром) для быстрого достижения равновесия между областями внутри и вне сосудов и обеспечения удаления КТ [5].
Чтобы обеспечить удаление из тела, оптимальный гидродинамический диаметр КТ должен быть менее 5,5 нм, это обязательное условие для их клинического применения.
Выбор и изготовление квантовых точек
Состав, физический размер и форма ядра КТ определяют спектральную область эмиссии — от ультрафиолетовой до инфракрасной области спектра. Покрытие ядра КТ высококачественной оболочкой из полупроводникового материала с большей шириной запрещенной зоны улучшает ФЛ ядра и пассивирует поверхностные ловушки. С точки зрения применения в живых организмах высококачественные оболочки, составленные из материалов с низкой токсичностью (например, ZnS), могут эффективно минимизировать токсические эффекты в клетках, предотвращая выделение высокотоксичных тяжелых металлов из ядра в тело живого организма.
Применяемые в живых организмах КТ CdSe/ZnS и CdTe/ZnS наиболее изучены и широко используются благодаря доступности этих коммерческих материалов и хорошо разработанным методам их изготовления в лабораторных условиях. КТ на основе тройных сплавов (CdZnS, CdZnSe, CdHgTe, InGaAs, CuInSe и CuInS) позволяют задавать ширину запрещенной зоны, контролируя размер, относительный состав и внутреннюю структуру (градиент или однородный состав ядра). Наилучшие оптические свойства (квантовый выход — 25—50 %, полная ширина спектра люминесценции на половине амплитуды — 18 нм) и стабильность были получены для ZnxCdi_xS и ZnxCdi_xSe с высокой степенью кристалличности благодаря большому размеру наночастиц и их жесткой структуре [6, 7]. ФЛ сдвигается в сторону коротких длин волн при увеличении доли Zn. Перечень и основные свойства наиболее известных КТ приведены в таблице.
Для получения высококачественных КТ обычно требуется синтез в органических растворах, в результате они становятся нерастворимыми в водной среде и имеют ограниченную возможность применения в живых организмах. Для того чтобы обеспечить растворимость в водной среде и соответствующую биосовместимость, используют метод замены лиганда, покрывая КТ амфифильными полимерами или производя мицеллярную инкапсуляцию. При образовании покрытия происходит замещение исходного лиганда, например TOPO на бифункциональные лиганды. Они могут содержать тиоловые группы, которые координируют ионы металлов на поверхности КТ и гидрофильные группы (например, заряженные ионы — группу карбоксильной кислоты, нейтральные — полиэтиленгликоль), которые взаимодействуют с окружающей средой. Полимерное покрытие обычно связывается с КТ в результате гидрофобных взаимодействий между свободными алкильными цепочками на полимере и исходным лигандом TOPO, в то время как полярные группы карбоксильной кислоты или группы полиэтиленгли-коля обеспечивают растворимость. Хотя полимерное покрытие обеспечивает высокую яркость ФЛ, оно
42
Бионанотехнологии и биоматериаловедение
Таблица Соотношение между составом ядра КТ, его размером, спектральным диапазоном ФЛ и шириной запрещенной зоны объемного материала [8, 9]
Состав Диапазон размеров, нм Спектральный диапазон ФЛ, нм Запрещенная зона
ядра оболочки объемного полупроводника, эВ (нм) Ссылка
еав - 2,7-5,3 400-470 2,46 (512) [10, 15-17]
СаБе - 1,35-6,0 460-650 1,68 (745) [10, 15-17]
СаБе ZnS 2,0-8,0 440-650 - [10]
ZnжCd1 -^е ZnSe 5,2-7,5 460-630 - [11]
сате - 3,2-9,0 500-750 1,35 (920) [10, 17]
сате СаБе 4,0-9,4 640-860 - [11]
Са8ежТе1-ж СаБ - 650-850 - [11]
1пР - 2,6-4,6 620-720 1,34 (930) [8, 17-19]
Си1п8е - 2,0-3,5 650-975 - [14]
Си1пР ZnSe 4,0 630-1100 1,0-1,21 (1030-1240) [20]
1ПАБ - 3,4-6,0 860-1260 0,35(3500) [10, 14, 17, 18, 21]
1пЛзжР1-ж ^Р^Бе 1,5-7,0 600-800а 0,41-1,24(1000-3000) [22]
1ПАБ ZnCdS 1,4-2,9 690-800 — [13]
РЬБ - 2,0-7,0 900-1500 0,37 (3400) [23, 24]
РЬБе - 3,0-15,0 1130-1320 0,27 (4600) [10, 25, 26]
РЬТе - 3,0-8,3 1200-2200 0,32 (3900) [26]
а Диапазон эмиссии приведен для постоянного размера КТ с различным содержанием Лб и Р.
же значительно увеличивает гидродинамический диаметр КТ (обычно до 20—80 нм) по сравнению с простой заменой лиганда (<20 нм). Водную растворимость также обеспечивает покрытие гидрофобных КТ амфифильным веществом, чтобы организовать системы с мицеллярной инкапсуляцией. Более того, полярные группы на поверхности мицеллы могут образовывать перекрестные связи, обеспечивая повышенную стабильность КТ [8].
Гидродинамический диаметр КТ оказывает большое влияние на биораспространение КТ в живом организме. Технология уменьшения гидродинамического диаметра [27] состоит в использовании смешанных составов линейных полимеров и внедренных в них тиолов и аминогрупп. Полимер синтезируют путем ковалентного замещения приблизительно 35 % групп карбоксильной кислоты, полиакриловой кислоты на цистеамин и М-Етое этилендиамин. После дополнительной защиты на одну молекулу полимера приходится 3,5 активных тиоловых групп и 3,0 активных аминогрупп. Эти свободные группы образовывали многочисленные перекрестные связи на длине полимера, создавая более компактное покрытие.
Кроме замены органического лиганда на гидрофильное покрытие КТ, возможен также непосредственный синтез КТ с использованием гидрофильных лигандов. Лиганды могут быть основаны на
смеси тиолов. Так, для синтеза КТ РЬБ использована смесь тиоглицерола и дитиглицерола [28]. В результате образуются стабильные КТ диаметром 4 ± 1 нм с ФЛ в ближней инфракрасной области спектра.
Другой метод синтеза КТ, растворимых в водной среде, основан на использовании биологических молекул, протеинов или ДНК в качестве матрицы для роста КТ и лиганда для их покрытия. Так, нуклеиновые кислоты имеют несколько важных для синтеза нанокристаллов особенностей [29]:
• анионный кислород фосфата, гидроксильные группы компонентов сахара, а также атомы азота и кислорода оснований нуклеотидов могут взаимодействовать с ионами металлов, которые являются прекурсорами (предшественниками) для нанокри-сталлов, например 0а2+, РЬ2+, Ия2+;
• трехмерная структура натуральных и искусственных нуклеиновых кислот хорошо определена, размеры многих из этих биологических наноструктур сравнимы с размерами обычных КТ, что помогает ограничить рост нанокристаллов и контролировать их размер;
• в настоящее время имеются эффективные химические и биологические технологии для синтеза КТ на основе полинуклеотидов и полинуклеотиды могут быть использованы для создания разнообразных нуклеиновых кислот с желаемой функциональностью;
• нуклеиновые кислоты являются растворимыми в воде, их можно использовать как лиганды, нуклеиновые кислоты пригодны для изготовления растворимых в воде нанокристаллов, которые не нуждались бы в замене лигандов и были бы совместимы с клеточными системами.
Комбинация всех перечисленных свойств показывает, что нуклеиновые кислоты могут быть эффективными и функциональными лигандами для нанокристаллов.
Нуклеиновые кислоты, включая ДНК и РНК, были использованы как матрица для синтеза полупроводниковых нанокристаллов [29-33]. Отрицательно заряженный фосфатный остов и основания представляют собой части нуклеиновой кислоты, которые могут взаимодействовать с КТ и стабилизировать их. Первый шаг сборки КТ включает в себя заселение лиганда или части матрицы ионами металла. Для нуклеиновых кислот фосфатный остов представляет собой идеальную основу, чтобы выполнить эту роль. Эта структура может подготовить ионы металла для последующей реакции с подходящим источником серы, что в итоге создает полупроводник. На последней стадии реакции части лиганда должны покрыть КТ, чтобы остановить процесс роста и защитить поверхность структуры так, чтобы избежать агрегации. Функциональные группы оснований нуклеиновой кислоты, главным образом эндоциклические и экзоциклические амины, могут служить в качестве лигандов и помогают образовать стабильный материал.
Последовательность оснований и структура нуклеиновой кислоты используется для контроля размеров и свойств КТ. Мономеры нуклеотидов использованы как лиганды для синтеза КТ РЪБ [34] и CdS [35]. В каждом случае специфические группы ДНК могут контролировать синтез и оказывать влияние на эмиссионные свойства полученного продукта. Эти исследования также подтвердили, что фосфатные части нуклеотида чрезвычайно важны для формирования стабильного растворимого материала. Фосфатные группы нуклеотида играют важную роль как в начале реакции при присоединении ионов металла, так и при обеспечении растворимости в воде, когда нуклеотид присоединятся к нанокристаллу как лиганд. Таким образом различные части ДНК могут влиять на синтез наноматериала и обуславливать отдельные стадии синтеза. В разумных пределах допустимо использовать нуклеиновые кислоты для программирования свойств материалов.
Для роста наночастиц эффективные лиганды должны обладать качествами, которые позволяют им:
• образовать комплекс — прекурсор с ионами металла, чтобы контролировать выделение иона и скорость роста наночастицы, способствовать гетерогенному зародышеобразованию;
• прерывать рост наночастиц и предотвращать их агломерацию, поскольку в ходе реакции расходуется большинство прекурсоров раствора;
• пассивировать дефекты поверхности нанокристаллов, чтобы получить максимальную люминесценцию;
• приводить КТ в состояние растворимости в растворе, в котором и был произведен их синтез [35].
Чтобы определить, действительно ли нуклеиновые кислоты могут служить лигандами для синтеза полупроводниковых наночастиц и какая функциональная группа ДНК оптимально подходит для этих целей, были исследованы четыре натуральных мононуклеотида: аденозинтрифосфат (ATP), гуанозинтрифосфат (GTP), уридинтрифосфат (UTP) и цитидинтрифосфат (CTP), эти молекулы были использованы как лиганды для синтеза PbS и CdS.
В случае синтеза PbS в водном растворе с использованием мононуклеотидных лигандов только GTP приводит к образованию люминесцентных нанокристаллов (рис. 1) [34]. Благодаря применению ATP, CTP и UTP получают главным образом нерастворимый объемный материал с очень низкой люминесценцией. Поэтому важную роль в образовании нанокристаллов играют функциональные группы, характерные для основания GTP.
Более тщательные исследования показали, что эк-зоциклическая функциональная группа N2 (рис. 2) взаимодействует с полупроводниковой поверхностью и, следовательно, играет главную роль в пассивации поверхности нанокристалла. Эндоци-клическая функциональная группа N7 тоже включена в процесс роста, но не приводит к проявлению свойств лиганда у мононуклеотида [29].
Фосфатные группы тоже играют существенную роль в росте нанокристаллов. Когда для синтеза нанокристаллов была использована только группа G (гуанин) нуклеотида, образовался нерастворимый продукт. То же самое произошло, когда вместо GTP для синтеза применили нуклеозид, лишенный любых фосфатов. Видимо, отрицательно заряженные фосфатные группы нужны для предотвращения
я
а
к
О!
« 3
4 -
3 -
Я 2 _
1 .
С*
К
s
1000
1200 1400
X, нм
1600
Риг. 1
Спектры люминегценции нанокригталлов PbS при игполъзовании GTP в гинтезе нанокригталлов [29]
п
биотехносфера
| № 5-6(23-24) 2012
агрегации нанокристаллов и обеспечения растворимости нанокристаллов в воде. Кроме того, измерения спектров в дальней инфракрасной области (длина волны — более 8—10 мкм) показал, что на начальном этапе роста фосфатные группы связаны с ионами Pb2+, однако после введения источника ионов S2- экзоциклическая функциональная группа N2 становится главным узлом связи лиганда с нанокристаллом [34]. Таким образом, фосфатные группы важны на ранних стадиях синтеза нанокристаллов и контролируют реакцию, связывая свинец и передавая его в реакционную смесь.
При синтезе нанокристаллов CdS были обнаружены некоторые существенные отличия. Наиболее люминесцентные нанокристаллы были также получены в присутствии GTP. Материалы, синтезированные в присутствии ATP, UTP и CTP, давали меньшую, по крайней мере на порядок, люминесценцию. Исследования показали, что в синтезе CdS эндоциклическая группа N7 играет более важную роль, чем при синтезе PbS. Отрицательно заряженные трифосфатные группы мононуклеотидов так же значимы, как и при синтезе PbS. Однако в случае с CdS фосфатные группы непосредственно участвуют в пассивации, по-видимому, вместе с аминогруппой основания [37, 38]. В общем, пассивацию нанокристаллов в основном осуществляет основание нуклеотида, в то время как фосфатные группы предотвращают агрегацию из-за электростатического отталкивания между нанокристаллами.
Переход от нуклеотидов-мономеров к полимерной цепи ДНК или РНК может сделать последние чрезвычайно управляемыми и разнообразными лигандами для синтеза нанокристаллов. Последовательность оснований нуклеиновой кислоты определяет функциональность каждой цепи для пассивации нанокристалла, так же как и количество узлов пассивации и расстояние между ними. Более того, вторичная и третичная структуры нуклеиновых кислот могут оказывать влияние на кинетику роста наночастицы при взаимодействии с ее поверхностью на различных стадиях роста, приводя к образованию наночастиц различного размера и формы [39]. Эта дополнительная степень свободы может быть использована для производства ассортимента разнообразных нанокристаллических продуктов с уникальными свойствами.
Примером влияния структуры нуклеиновой кислоты на синтез нанокристалла может служить использование для синтеза натуральной биологически активной tPHK (Escherichia coli tRNALeu) и бесструктурного мутанта tPHK. Натуральная tPHK является чрезвычайно структурированной и имеет хорошо определенную вторичную структуру клеверного листа и третичную структуру в форме буквы L [40]. Полный размер структуры натуральной tPHK составляет около 5 нм, что сравнимо с размером типичного нанокристалла. В итоге структурные свойства нанокристаллов CdS, полученных со струк-
N7 модулирует длину волны эмиссии
О
"О—Р—О—Р—О—Р"
I I I
О" О" О"
Фосфаты обеспечивают рост QH
N2 пассивирует, стабилизирует
Рис. 2 Структурная формула ОТР и предполагаемые роли фосфатной группы и основания ОТР в зародыше-образовании, росте, его прекращении, стабилизации и пассивации [29]
турированной и бесструктурной РНК, имели явное различие. Нанокристаллы, приготовленные с использованием бесструктурной РНК, были значительно крупнее (около 7 нм) и имели большую дисперсию, чем нанокристаллы, для которых использовалась структурированная РНК (4,4 ± 0,4 нм). Поскольку бесструктурная молекула РНК более эластична по сравнению с натуральной РНК, то она может принять различные формы при связывании с Са2+ и поверхностью нанокристалла СаБ в процессе зародышеобразования и дальнейших стадий роста. В результате возможно сосуществование нескольких режимов роста и, как результат, различные размеры нанокристаллов.
Последовательность нуклеотидов также влияет на свойства нанокристаллов. Воздействие функциональных групп полинуклеотида усиливается, когда некоторые из этих групп действуют совместно в той же самой цепи. Более длинные олигонуклеотиды дают более стабильный материал и с большей люминесценцией [41]. Форма и жесткость олигомер-ных цепей, которая зависит от последовательности нуклеотидов в цепи, также влияет на привязывание нуклеиновых кислот к поверхности нанокристалла. Сложная последовательность ДНК может как бы «кодировать» интенсивность и длину волны люминесценции нанокристалла.
Использование специальных последовательностей ДНК позволяет производить самосборку комплексов, содержащих три различных типа КТ. Изменяя рИ раствора, можно обеспечивать комплексу состояние включенной и выключенной передачи энергии между разными КТ комплекса [42].
Таргетинг
Применение КТ для получения изображения выбранной части живого организма, например опухоли, требует адресной доставки и присоединения КТ к намеченным клеткам. Избирательное присоединение красителей или люминесцентных нанокристаллов к определенным клеткам и биологическим тканям составляет сущность таргетинга.
Чтобы доставить КТ к опухоли через сосудистую сеть, используют пассивный и активный таргетинг.
Основой пассивного таргетинга является утечка жидкости в сосудистой системе, связанная с опухолью [43]. Пассивный выход жидкости из сосудов в ткани не требует никакой специальной поверхностной химии. При отсутствии лимфатической дренажной системы в опухолях [44] КТ могут накапливаться преимущественно в месте расположения опухоли из-за эффекта усиленной проницаемости и удержания.
В случае активного таргетинга КТ соединена с лигандом, который избирательно присоединяется к поверхностному рецептору, например к трансмембранному протеину или другим протеинам во внеклеточном окружении, которые важны для разрастания опухоли [45]. Многие из этих узлов распознавания также существуют и в нормальных тканях, но их содержание сильно повышено у многих типов раковых клеток и предоставляет возможность предпочтительного таргетинга циркулирующих КТ к опухоли.
Выбор лиганда для таргетинга имеет важное значение для использования КТ в качестве маркера. Степень избирательности и силы взаимодействия — главные критерии для выбора лиганда. Общий размер частицы, плотность заряда КТ и доступность лиганда для таргетинга — факторы, играющие главную роль в применении КТ в живом организме. Гидродинамический диаметр КТ менее максимального 5,5 нм необходим, чтобы обеспечить выделение КТ через почки в течении 4 ч, кроме того, большое отношении заряда к гидродинамическому диаметру может вызвать абсорбцию протеинов сыворотки крови и увеличить гидродинамический диаметр. Размер КТ будет влиять на их способность проникать в ткань опухоли из сосудистой системы.
Существует несколько вариантов выбора лиган-да или линкера для таргетинга. Для этих целей используют пептиды, протеины и олигомерные цепи ДНК.
Пептиды предоставляют широкий выбор лиган-дов для таргетинга. Малый размер пептида по сравнению с антителом также увеличивает его привлекательность, поскольку компактное покрытие поверхности можно произвести прямым замещением лиганда. Однако последовательность аминокислот и результирующая плотность заряда комплекса КТ и лиганда могут привести к неспецифической абсорбции. Пептиды удается легко привязать к поверхности КТ, контроль ориентации осуществляется путем добавления связи или к атомам С или N последовательности. К КТ можно присоединить сотни пептидов в зависимости от типа КТ и размера последовательности. Пептиды обладают высокой степенью взаимодействия благодаря эффекту поливалентности, когда пептиды со сложной структурой могут связываться с разнообразными точками распознавания данной молекулы [46]. Одним из примеров может служить применение комплекса «КТ — пептид» для визуализации опу-
холи легкого мыши в результате внутривенного введения комплекса [45].
Антитела и другие протеины можно использовать как таргетирующий агент. Активный таргетинг облегчается путем привязки таргетирующего агента к рецепторному узлу, распознанному протеином. Многие антитела и другие протеины отличаются сильным взаимодействием с поверхностными рецепторами клетки и хорошей избирательностью как маркеры поверхностных рецепторов клетки. Главный недостаток использования таргетинга при помощи протеинов состоит в ориентации иммобилизованных протеинов и размере антител, используемых в качестве лигандов, что приводит к увеличенному размеру комплекса КТ и антитела. Большинство методов получения объединения для ковалентного связывания протеинов основано на свободных аминах и сульфгидрилах (-SH группы, тиоловрй группы) протеина [8]. Амины часто связаны с покрытыми карбоксильной кислотой КТ. Примером применения протеинов может служить использование специфического мембранного антигена простаты, который был использован для привязки КТ к опухоли простаты в живом организме [43].
Матрица ДНК может выполнять двойную функцию. С одной стороны, она может выполнять роль лиганда, который участвует в процессе синтеза КТ, а с другой — линкера, который соединяет КТ с био-распознающим агентом для присоединения к клеткам намеченных типов или биологическим тканям [29]. С этой целью была спроектирована химерная ДНК, состоящая из 10 нуклеотидов фосфоротиолат-ного сегмента ДНК (ps) и 10 нуклеотидов фосфатного сегмента (po), которые были соединены цепочкой из пяти нуклеотидов поли-А линкера. Образовавшаяся ps-po ДНК использована для синтеза нанокри-сталлов CdTe. Фосфоротиолатная ДНК, в которой отрицательно заряженный атом кислорода фосфатного остова заменен на серу, была использована как пассивирующий фрагмент. Фосфоротиолатные нуклеотиды образуют более сильные связи с ионами Cd2+, чем фосфатные нуклеотиды. Путем комбинации фосфоротилолатного фрагмента с фосфатным фрагментом в одной и той же цепи ДНК фосфоро-тиолатная часть связывается с нанокристаллом, а фосфатный домен оказывается свободным и может взаимодействовать с различными биомолекулами и выполнять распознавание специфических целей (рис. 3). Таким образом, биофункциональные на-нокристаллы для биораспознавания и получения изображения могут быть получены в ходе одного этапа водного синтеза.
Использование ps-po ДНК позволило синтезировать нанокристаллы CdTe диаметром от 6,0 до 6,5 нм с квантовым выходом ~15 %. Благодаря сходной процедуре были получены нанокристаллы PbS [47]. Были исследованы привязки нанокристаллов CdTe к протеинам и раковым клеткам. Высокая
Бионанотехнологии и биоматериаловедение
à)
ps остов po остов (или скелет) (или скелет)
■К.0-)- -К
Привязка Привязка к нуклеиновой к поверхности кислоте, протеинам, нанокристалла клеточным рецепторам
в)
CdCI2, GSH NaHTe
tt?ftt
Рис. 3 Нанокристаллы CdTe запрограммированные с помощью ДНК с приданием им специальных функций: а — проектирование химерических олигонуклеотидов с доменами, выполняющими роль лиганда (ps) и роль распознающего агента (ро); б — схематическое представление синтеза в ходе одной процедуры; в — привязка к биологической цели [29]
эффективность связывания подтверждена на примере присоединения комплекса «рв-ро-ТВА — пассивированные нанокристаллы CdTe» с тромбином (ТВА — аптамер связи с тромбином, аптамер — молекулы олигонуклеиновой кислоты или пептида, которые избирательно присоединяются к специфическим целенаправленно избранным молекулам). Происходит также избирательное присоединение к раковым клеткам с помощью специального аптаме-ра связи с раковыми клетками [29, 48].
Биосенсоры на основе КТ
КТ нашли применение и в биологическом анализе, например ДНК или других биологических объектов вне живого организма. Так, детектирующие системы на основе биочипов позволяют идентифицировать и анализировать множество биологических объектов, механизмов их действия и регуляции [49]. «Биочипы обладают высокой производительностью и способны одновременно
количественно регистрировать в мультиплексных тестах присутствие сразу многих молекул, содержащихся в микрообъемах. Биочипы позволяют проводить параллельный геномный или протеомный анализ здоровых или измененных болезнью тканей и клеток, выполнять сравнительный анализ, выявляя изменения, связанные с заболеванием. Для считывания сигнала с биочипов обычно используют органические красители, недостатком которых являются низкие фотостабильность и яркость и, кроме того, наличие флуоресцентного фона. Использование полупроводниковых КТ позволяет снять эти ограничения» [49].
Детектирование сигналов Ферстеровского резонансного переноса энергии (FRET) позволяет зафиксировать факт гибридизации ДНК и переход от одиночной к сдвоенной цепи ДНК [50]. Сигналы FRET в ячейках микропотоковых каналов свидетельствуют об иммобилизации ДНК в микроканалах и образовании двойной спирали ДНК [51]. Явление показано на примере передачи энергии от КТ донора CdSe/ZnS к акцептору — красителю Cy3. К КТ присоединены олигонуклеотиды, которые нужно распознать, а Cy3 соединен с закрепленными в канале олигонуклеотидами с известной последовательностью. В этом случае измерение ФЛ позволяет зафиксировать образование двойной спирали ДНК и тем самым распознать ее. Объединение технологии микропотоков с использованием КТ расширяет возможности применения биосенсоров и биохимического анализа и создает синергетический эффект [52].
КТ выполняют роль донора либо акцептора в процессах FRET. Однако есть возможность использовать ее сразу и как донор, и как акцептор. С этой целью используется временная задержка переключения FRET [53]. КТ служит центральной основой (платформой) и связана с пептидами или олигонуклеотидами, которые помечены либо тер-биевым (III) комплексом (Tb), имеющими большое время жизни ФЛ, либо флуоресцентным красителем Alexa Fluor 647 (A647). В ходе переключения FRET КТ служит в качестве важного посредника, когда возбужденное состояние Tb донора передает энергию в основное состояние КТ, за которым следует микросекундная задержка, после чего КТ передает энергию акцептору A647.
Временная задержка передачи энергии к акцептору A647 способствует устранению фоновой автофлуоресценции клеток и тканей, время спада которой менее 20 нс. Передача энергии от Tb к КТ происходит в миллисекундном диапазоне, а время жизни возбужденного состояния A647 составляет ~1 нс. Применение такой двухступенчатой передачи энергии выгодно благодаря устранению фоновой флуоресценции и возможности существования двух приблизительно независимых FRET механизмов на основе приема-передачи сигнала одной и той же КТ и комплексной биочувствительности, основанной
на спектрально-временном разрешении FRET КТ без необходимости участия нескольких КТ с люминесценцией разного цвета.
Заключение
КТ играют важную роль в развитии наномедици-ны. Благодаря развитию технологии объединения полупроводниковых КТ с биологическими молекулами, такими как протеины, нуклеиновые кислоты и пептиды, открылась возможность их применения в медицине [54—56], прежде всего для разработки биосенсоров и применения для анализа биологических молекул, протеинов и ДНК вне живых организмов для диагностики болезней, в частности генетических. Другое важное направление связано с получением изображения необходимого участка живого организма, где КТ играют роль средства усиления контраста и маркера для обозначения клеток, которые нужно выделить на изображении, например, раковых клеток. КТ можно использовать в диагностике болезней и терапии [57]. Причем, КТ могут выступать одновременно и как средство повышения контраста изображения, и как средство терапии, особенно для лечения генетических заболеваний, поскольку фотоактивация КТ может приводить к образованию промежуточных соединений с активным кислородом, что является основой для применения фотодинамической терапии. Например, если вблизи от КТ находится нужная цепь ДНК, то может произойти ее разрыв [58]. Таким образом, коллоидные КТ — это важный компонент в развитии нанотехнологий в применении к биологии и медицине.
Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации, соглашение 14.B37.21.1089.
| Литература |
1. Физика низкоразмерных систем / А. Я. Шик, Л. Г. Баку-ева, С. Ф. Мусихин и др. СПб.: Наука, 2001. 155 с.
2. Alivisatos A. P., Gu W., Larabell C. Quantum dots as cellular probes // Annual Review of Biomedical Engineering. 2005. Vol. 7. P. 55-76.
3. Bakueva L., Musikhin S., Hines M. A. et al. Size-tunable infrared (1000-1600) electroluminescence from PbS quantum dot nanocrystals in a semiconducting polymer // Appl. Phys. Lett. 2003. Vol. 82, N 17. P. 2895-2897.
4. Na R. H., Stender I. M., Ma L. X. et al. Autofluorescence spectrum of skin: component bands and body site variations // Skin Research and Technology. 2000. Vol. 6, N 3. P. 112117.
5. Choi H. S., Liu W., Liu F. et al. Design considerations for tumour-targeted nanoparticles // Nature Nanotechnology. 2010. Vol. 5, N 1. P. 42-47.
6. Zhang X., Feng Y., Knoll W. et al. Alloyed ZnxCd1-xS Nanocrystals with Highly Narrow Luminescence Spectral Width // J. Am. Chem. Soc. 2003. Vol. 125, N 44. P. 1355913563.
7. Zhong X., Han M., Doug Z., White T. J. et al. Composition-Tunable ZnxCd1-xSe Nanocrystals with High Luminescence and Stability // J. Am. Chem. Soc. 2003. Vol. 125, N 28. P. 8589-8594.
8. Tavares A. J., Chong L., Petryayeva E. et al. Quantum dots as contrast agents for in vivo tumor imaging: progress and issues // Anal. Bioanal. Chem. 2011. Vol. 399. P. 2331-2342.
9. Халькогениды и оксиды элементов IV группы. Получение, исследование, применение / О. А. Александрова, А. И. Максимов, В. А. Мошников и др. СПб.: Технолит, 2008. 240 с.
10. Michalet X., Pinaud F. F., Bentolila L. A. et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics // Science. 2005. Vol. 307, N 5709. P. 538-544.
11. Jiang W., Singhal A., Kim A. Y. S. et al. Assessing near-infrared quantum dots for deep tissue, organ, and animal imaging applications // J. Assoc. Lab. Automat. 2008. Vol. 13. P. 6-12.
12. Wang X.Y., Ren X. F., Kahen K. et al. Non-blinking semiconductor nanocrystals // Nature. 2009. Vol. 459. P. 686-689.
13. Allen P. M., Bawendi M. G. Ternary I-III-VI Quantum Dots Luminescent in the Red to Near-Infrared // J. Am. Chem. Soc. 2008. Vol. 130, N 29. P. 9240-9241.
14. Allen P. M., Liu W., Chauchan B. P. et al. InAs(ZnCdS) Quantum Dots Optimized for Biological Imaging in the Near-Infrared // J. Am. Chem Soc. 2010. Vol. 132, N 2. P. 470-471.
15. Yu W. W., Qu L., Guo W. et al. Experimental determination of the extinction coefficient of CdTe, CdSe, and CdS nanocrystals // Chem. Mater. 2003. Vol. 15, N 14. P. 2854-2860.
16. Peng Z. A., Peng X. Formation of high-quality CdTe, CdSe, and CdS Nanocrystals using CdO as precursor // J. Am. Chem. Soc. 2001. Vol. 123, N 1. P. 183-184.
17. Delehanty J. B., Mattoussi H., Medintz I. L. Delivering quantum dots into cells: strategies, progress and remaining issues. Analytical and Bioanalytical Chemistry // Anal. Bioanal. Chem. 2009. Vol. 393, N 4. P. 1091-1105.
18. Guzelian A. A., Banin U., Kadavanich A. V. et al. Colloidal chemical synthesis and characterization of InAs nanocrys-tal quantum dots // Appl Phys Lett. 1996. Vol. 69, N 10. P. 1432-1434.
19. Micic O. I., Sprague J. R., Curtis C. J. et al. Synthesis and characterization of InP, GaP, and GaInP2 quantum dots // J. Phys. Chem. 1995. Vol. 99, N 19. P. 7754-7759.
20. Xie R., Peng X. Synthesis of Cu-Doped InP nanocrystals (d-dots) with ZnSe diffusion barrier as efficient and color-tunable NIR emitters // J. Am. Chem. Soc. 2009. Vol. 131, N 30. P. 10645-10651.
21. Cao Y. W., Banin U. Growth and properties of semiconductor core/shell nanocrystals with InAs cores // J. Am. Chem. Soc. 2000. Vol. 122, N 40. P. 9692-9702.
22. Kim S. W., Zimmer J. P., Ohnishi S. et al. Engineering InAsxP1-x/InP/ZnSe III-V alloyed core/shell quantum dots for the Near-Infrared // J. Am. Chem. Soc. 2005. Vol. 127, N 30. P. 10526-10532.
23. Hines M. A., Scholes G. D. Colloidal PbS nanocrystals with size-tunable near-infrared emission: Observation of post-synthesis self-narrowing of the particle size distribution // Adv Mater. 2003. Vol. 15, N 21. P. 1844-1849.
24. Cademartiri L., Montanari E., Calestani G. et al. Size-Dependent Extinction Coefficients of PbS Quantum Dots // J. Am. Chem. Soc. 2006. Vol. 128, N 31. P. 10337-10346.
25. Moreels I., Lambert K., De Muynck D. et al. Composition and size-dependent extinction coefficient of colloidal PbSe quantum dots // Chem. Mater. 2007. Vol. 19, N 25. P. 6101-6106.
26. Murphy J. E., Beard M. C., Norman A. G. et al. PbTe colloidal nanocrystals: Synthesis, characterization, and multiple exci-ton generation // J. Am. Chem. Soc. 2006. Vol. 128, N 10. P. 3241-3247.
27. Smith A. M., Nie S. Minimizing the hydrodynamic size of 44. quantum dots with multifunctional multidentate polymer ligands // J. Am. Chem. Soc. 2008. Vol. 130, N 34. P. 1127811279. 45.
28. Bakueva L., Gorelikov I., Musikhin S. et al. PbS quantum dots with stable efficient luminescence in the near-IR spectral range // Adv. Mater. 2004. Vol. 16, N 11. P. 927-929. 46.
29. Ma N., Tikhomirov G., Kelley S. O. Nucleic acid-passivated semiconductor nanocrystals: biomolecular templating of form and function // Accounts of Chemical Research. 2010. Vol. 43,
N 2. P. 173-180. 47.
30. Levina L., Sukhovatkin V., Musikhin S. et al. Efficient infrared-emitting PbS quantum dots grown on DNA and stable in aqueous solution and Blood Plasma. Adv. Mater.
2005. Vol. 17, N 15. P. 1854-1857. 48.
31. Choi J. H., Chen K. H., Strano M. S. Aptamer-capped nano-crystal quantum dots: a new method for label-free protein detection // J. Am. Chem. Soc. 2006. Vol. 128, N 49. P. 15584- 49. 15585.
32. Ma N., Dooley C. J., Kelley S. O. RNA-Templated Semiconductor Nanocrystals // J. Am. Chem. Soc. 2006. Vol. 128, 50. N 39. P. 12598.
33. Ma N., Sargent E. H., Kelley S. O. One-step DNA-programmed growth of luminescent and biofunctionalized nanocrystals // 51. Nature Nanotechnology. 2009. Vol. 4. P. 121-125.
34. Hinds S., Taft B. J., Levina L. et al. Nucleotide-directed growth of semiconductor nanocrystals // J. Am. Chem. Soc.
2006. Vol. 128, N 1. P. 64-65.
35. Dooley C. J., Rouge J., Ma N. et al. Nucleotide-stabilized cad- 52. mium sulfide nanoparticles // J. Mater. Chem. 2007. Vol. 17,
N 17. P. 1687-1691.
36. Cushing B. L., Kolesnichenko V. L., O'Connor C. J. Recent 53. advances in the liquid-phase syntheses of inorganic nanopar-ticles // Chem. Rev. 2004. Vol. 104, N 9. P. 3893-3946.
37. Green M., Taylor R., Wakefield G. The synthesis of luminescent adenosine triphosphate passivated cadmium sulfide na- 54. noparticles // J. Mater. Chem. 2003. Vol. 13. P. 1859-1861.
38. Green M., Smith-Boyle D., Harries J. et al. Nucleotide passivated cadmium Sulfide Quantum Dots // Chem. Commun. 55. 2005. N 38. P. 4830-4832.
39. Gugliotti L. A., Feldheim D. L., Eaton B. E. RNA-mediated control of metal nanoparticle shape // J. Am. Chem. Soc. 2005. 56. Vol. 127. P. 17814-17818.
40. Kim S. Transfer RNA: Structure, properties and recognition.
New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1979. 577 p. 57.
41. Ma N., Yang J., Stewart K. M. et al. DNA-passivated CdS nanocrystals: luminescence, bioimaging, and toxicity profiles. Langmuir. 2007. Vol. 23. P. 12783-12787.
42. Tikhomirov G., Hoogland S., Lee P. et al. DNA-based programming of quantum dot valency,self-assembly and luminescence // Nature Nanotechnology. 2011. Vol. 6, N 8. P. 485-490.
43. Gao X., Cui Y., Levenson R.M. et al. In vivo cancer target- 58. ing and imaging with semiconductor quantum dots //Nat. Biotechnol. 2004. Vol. 22, N 8. P. 969-976.
Gao J., Chen K., Xie R. et al. Ultrasmall Near-Infrared Non-cadmium quantum dots for in vivo tumor imaging // Small.
2010. Vol. 6, N 2. P. 256-261.
Ekerman M.E., Chan W.C.W., Laakkonen P. et al. Nanocrys-tal targeting in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. Vol. 99, N 20. P. 12617-12621.
Mammen M., Choi S.-K., Whitesides G. M. Polyvalent interactions in biological systems: Implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors // Angew Chem Int Ed. 1998. Vol. 37, N 20. P. 2754-2794. Choi J. H., Chen K. H., Strano M. S. Aptamer-capped nanocrys-tal quantum dots: A new method for label-free protein detection // J. Am. Chem. Soc. 2006. Vol. 128, N 49. P. 1558415585.
Shangguan D., Tang Z. W., Mallikaratchy P. et. al. Optimization and modifications of aptamers selected from live cancer Cell Lines // ChemBioChem. 2007. Vol. 8, N 6. P. 603-606. Олейников В. А. Полупроводниковые флуоресцентные на-нокристаллы (квантовые точки) в белковых биочипах // Биоорганическая химия. 2011. T. 37, № 2. C. 171-189. Wei W., Jun-Jie Z. Optical applications of quantum dots in biological system // Sci China Chem. 2011. Vol. 54, N 8. P. 1177-1184.
Chen L., Algar W. R., Tavares A. J. et al. Toward a solidphase nucleic acid hybridization assay within microfluidic channels using immobilized quantum dots as donors in fluorescence resonance energy transfer // Anal. Bioanal. Chem.
2011. Vol. 399. P. 133-141.
Vannoy C. H., Tavares A. J., Noor M. O. et al. Biosensing with quantum dots: A Microfluidic Approach // Sensors. 2011. Vol. 11. P. 9732-9763.
Algar W. R., Wegner D., Huston A. L. et al. Quantum dots as simultaneous acceptors and donors in time-gated forster resonance energy transfer relays: characterization and bio-sensing // J. Am. Chem. Soc. 2012. Vol. 134. P. 1876-1891. Мусихин С. Ф., Ильин В. И. Методы нанотехнологии в биологии и медицине // Научно-технические ведомости СПбГПУ. 2008. № 3. C. 183-190.
Свешников П. Г., Пальцев М. А., Киселев В. И. Нанотехнологии в медицине // Вестник РАН. 2009. Т. 79, № 7. С. 627-636.
Kim B. Y. S., Rutka J. T., Chan W. C. W. Nanomedicine // The New England Journal of Medicine. 2010. Vol. 363, N 25. P. 2434-2443.
Tian B., Al-Jamal W. T., Van den Bossche J. et al. Design and engineering of multifunctional quantum dot-based nanopar-ticles for simultaneous therapeutic-diagnostic applications // Multifunctional Nanoparticles for Drug Delivery Applications: Imaging, Targeting, and Delivery, Nanostructure Science and Technology / Eds. S. Svenson, R. K. Prud'homme. New York; Dordrecht; Heidelberg; London: Springer Science+Business Media, 2012. 373 р.
Anas A., Akita H., Harashima H. et al. Photosensitized breakage and damage of DNA by CdSe-ZnS quantum dots // J. Phys. Chem. B. 2008. Vol. 112, N 32. P. 10005-10011.
