Новые азокрасители - потенциальные тушители флуоресценции как основа создания олигонуклеотидных гибридизационных зондов Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

УДК 577.113.4

НОВЫЕ АЗОКРАСИТЕЛИ -ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ ТУШИТЕЛИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ КАК ОСНОВА СОЗДАНИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ГИБРИДИЗАЦИОННЫХ ЗОНДОВ

© Ю. О. Карпова1, Р. Р. Гарафутдинов2*, А. В. Чемерис2, Р. Ф. Талипов1

1 Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450074, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.

Тел./факс: +7 (34 7) 273 6 7 78.

2Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71.

Тел./факс: +7 (347) 235 60 88.

E-mail: garafutdinovr@mail. ru

Синтезирован ряд карбоксилсодержащих моноазокрасителей, найдены их наиболее длинноволновые полосы поглощения в диапазоне 300—700 нм, исследовано тушение флуоресценции красителей 5'-карбоксифлуоресцеина и карбокси-Х-родамина полученными азосоединениями. Наиболее эффективный тушитель флуоресценции внедрен в молекулы олигонуклеотидов и изучено тушение им флуоресценции в олигонуклеотидных дуплексных структурах.

Ключевые слова: азокрасители, тушение флуоресценции, перенос энергии флуоресценции, олигонуклеотиды, гибридизационные зонды

Введение

В настоящее время для детектирования специфических взаимодействий нуклеиновых кислот все большее распространение приобретают флуоресцентные методы, которые позволяют вести анализ в режиме реального времени. Большинство подходов основано на использовании гибридизаци-онных зондов, обеспечивающих «включение-выключение» флуоресценции и дающих изменение интенсивности флуоресцентного сигнала за счет процессов внутри- и межмолекулярного переноса энергии при образовании вторичных структур [1]. Известно несколько механизмов передачи энергии возбуждения, однако в применяемых молекулярных системах реализуется резонансный перенос энергии флуоресценции (fluorescence resonance energy transfer, FRET), который базируется на переносе энергии возбуждения между двумя фотоактив-ными молекулами или группами, одна из которых выступает донором (Д), а другая - акцептором (А) энергии [2]. Если возбужденная частица акцептора дезактивируется в ходе безызлучательных процессов, она выступает тушителем флуоресценции.

Для тушения флуоресценции чаще всего используются соединения, содержащие в молекуле азогруппу. Поиск эффективных пар «флуорофор-тушитель» до сих пор остается актуальным. Наиболее используемыми флуорофорами являются 5'-карбоксифлуоресцеин (FAM) с максимумом флуоресценции 520 нм, карбокси-Х-родамин (ROX) -605 нм и ряд других, а тушителями - азосоединения Dabcyl и группы BHQ. Спектр поглощения Dabcyl недостаточно полно перекрывает спектры флуоресценции в интервале длин волн более 480 нм. Тушители группы BHQ имеют диапазон поглощения 480-730 нм и показывают лучшее соотношение «сигнал/шум» [3]. Относительно недавно были предложены новые тушители LQ1 и LQ2 - производные 1,4-диаминоантрахинона, которые высоко-

эффективны в паре с флуорофором Су5 [4]. Тушители д8У 7, д8У 9, д8У 21 и д8У 35 являются производными диарилродамина, имеют широкий спектр поглощения в видимой области с максимумом поглощения в 560 нм для д8У 7 и д8У 9 и около 660 нм для д8У 21 [5]. Константы тушения данными соединениями превышают величину 90000 см-1М-1, квантовые выходы флуоресценции составляют менее 0.001 в водном растворе. д8У 7 и д8У 9 эффективно тушат флуоресценцию зеленых и оранжевых флуоресцентных красителей, д8У 21 -флуоресценцию красных флуоресцентных красителей. Все тушители этой группы химически стабильны и стойки к обесцвечиванию.

Недавно были предложены «супертушители», представляющие собой один, два или три остатка БаЬсу1 по 5'-концу олигонуклеотида [6]. Было показано, что эффективность тушения одним БаЬсу1 составляет 92.9%, двумя - 98.8%, тремя - 99.7%. Коэффициент «сигнал/шум» для зонда, имеющего «супертушитель», увеличился в 320 раз, в то время как для зонда с одним тушителем - в 14 раз. Авторами [7] была измерена эффективность тушения 22 флуорофоров с максимумами испускания в диапазоне 441-702 нм пятью разными тушителями. Эффективность тушения уменьшалась в соответствии с уменьшением степени перекрывания спектра испускания флуорофора и спектра поглощения тушителя.

Целью данной работы стал синтез моноазокрасителей с высокой эффективностью тушения флуоресценции в области 500-600 нм и создание на их основе олигонуклеотидных гибридизационных зондов для высокочувствительной ДНК-диаг-ностики в режиме реального времени.

Экспериментальная часть

В работе использовались следующие реактивы: и-аминобензойная кислота, феруловая кислота, 4-оксибензойная кислота, и-йоданилин, о-хлор-анилин, №метиланилин, 3-бромпропионовая ки-

* автор, ответственный за переписку

слота, о-, м- и п-нитроанилины (Aldrich, Fluka, Alfa Aesar), резорцин, сульфаниловая кислота, нитрит натрия, соляная кислота, гидроксид калия (Россия). Колоночную хроматографию проводили на силикагеле 60 (0.063-0.200) фирмы Merck. Для качественного ТСХ-анализа использовали пластинки Sorbfil, элюент ацетон:хлороформ, этилацетат: гексан, бен-зол:метанол в разных соотношениях.

Спектры ЯМР 13С и 1Н сняты на ЯМР-спектрометре Bruker AM 300 (Bruker, Германия) с рабочей частотой 300 МГц, растворитель ДМСО-^6. Масс-спектры сняты на спектрометре «МХ-1300». УФ-спектры сняты на УВИ-спектрометре 3600, ИК-спектры - на ИК-спектрометре IR Prestige 21, концентрацию олигонуклеотидов определяли на спектрофотометре Bio-Spec Mini (все фирмы Shi-madzu, Япония). Электрофорез олигонуклеотидов осуществляли в приборе вертикального типа Mini-PROTEAN 3 (Bio-Rad, США).

Синтез ]\-метил-]\-фенил-Р-аланина. Растворы 5 мл N-метиланилина в 10 мл хлороформа и

6.1 мл 3-бромпропионовой кислоты в 10 мл хлороформа сливали и тщательно перемешивали в присутствии 5 г тонко измельченного поташа 5 ч. Твердый остаток фильтровали на фильтре Шотта, промывали этанолом 2x10 мл, затем смешивали с 20 мл воды и постепенно прикапывали 10%-ный раствор HCl до нейтральной реакции по лакмусу. Водную фазу экстрагировали 2x30 мл ТГФ в присутствии NaCl, органические фазы объединяли, сушили над MgSO4. Растворитель упаривали, воскообразный остаток использовали далее без дополнительной очистки.

Общая методика синтеза азокрасителей. Аминокомпоненты-предшественники азокрасителей AQ-5, 6, 8-11 в количестве 5 ммоль растворяли при охлаждении в 5 мл 10%-ного раствора HCl. Аминокомпоненты-предшественники азокрасителей AQ-1 и AQ-4 в количестве 5 ммоль растворяли при охлаждении в 0.5 мл 30%-ного раствора KOH и 1 мл воды. Нитрит натрия в количестве 6 ммоль растворяли в 5 мл воды, раствор приливали к растворам аминокомпонентов-предшественников азокрасителей AQ-5, 6, 8-11 или смешивали при охлаждении до 0°С с 5 мл 10% HCl и затем приливали к растворам аминокомпонентов-предшественников

AQ-1 и AQ-4. Реакционные смеси выдерживали 0.5-3.0 ч в зависимости от активности азосоставляющей, выпавшие в ходе реакции или после под-кисления осадки фильтровали на фильтре Шотта, растворяли в 10%-ном растворе KOH, вновь фильтровали на фильтре Шотта, фильтрат подкисляли до кислой реакции по конго. Выпавшие осадки фильтровали, сушили. Продукты реакции разделяли колоночной хроматографией на силикагеле. Выходы варьировали от 15 до 37%.

AQ-1: Спектр ЯМР 13C (ДМСО-^6, 5, м.д.): 55.7 (1С, OCH3), 111.2 (1С, CAr4), 115.6 (1С, CAr6),

122.9 (1С, С1Н), 125.8 (2С, CAr3',5'), 127.3 (1C,

САг5), 137.3 (2С, САг2',6'), 140.8 (1С, САг1), 144.6 (1С, САг2), 147.9 (1С, С2Н), 149.1 (1С, САг1'), 152.0 (1С, САгЗ), 153.2 (1С, САг4'), 174.8 (1С, СООН). Масс-спектр: ш/і 377 [М-Н]+.

ЛО-4: Спектр ЯМР 13С САМСОЙ, 5, м.д.): 103.5 (1С, САгЗ'), 114.3 (1С, САг5'), 124.4 (2С, САг2,6), 127.8 (1С, САг6'), 130.6 (2С, САгЗ,5), 137.7 (1С, САг4), 154.3 (1С, САг1'), 164.8 (1С, САг1), 167.2 (1С, САг2'), 172.4 (1С, САг4'), 177.5 (1С, СООН). Масс-спектр: ш/і 257 [М-Н]+.

ЛО-5: Спектр ЯМР 13С САМСОЙ, 5, м.д.):

35.1 (1С, С1Н2), 39.4 (1С, СНз), 47.6 (1С, С2Н2),

110.9 (2С, САгЗ,5), 121.8 (2С, САг2',6'), 126.7 (2С, САгЗ',5'), 128.4 (2С, САг2,6), 143.9 (1С, САг1), 150.8 (1С, САг4'), 151.3 (1С, САг4), 159.3 (1С, САг1'), 173.0 (1С, СООН). Масс-спектр: ш/і 327 [М-Н]+.

ЛО-6: Спектр ЯМР 13С САМСОЙ, 5, м.д.):

35.1 (1С, С1Н2), 39.4 (1С, СН3), 47.6 (1С, С2Н2),

110.9 (2С, САгЗ,5), 121.4 (1С, САг6'), 124.9 (1С, САг5'), 127.7 (1С, САгЗ'), 128.4 (2С, САг2,6), 129.4 (1С, САг2'), 131.3 (1С, САг4'), 143.9 (1С, САг1), 149.5 (1С, САг1'), 151.3 (1С, САг4), 173.0 (1С, СООН). Масс-спектр: ш/і 316.5 [М-Н]+.

ЛО-8: Спектр ЯМР 13С САМСОЙ, 5, м.д.): 102.0 (1С, САг4'), 119.4 (1С, САгЗ), 120.8 (1С, САг5),

126.3 (1С, САг6), 127.3 (2С, САг2',6'), 130.6 (1С, САг4), 137.1 (2С, САгЗ',5'), 137.7 (1С, САг1), 153.4 (1С, САг1'), 154.3 (1С, САг2), 177.5 (1С, СООН). Масс-спектр: ш/і 367 [М-Н]+.

ЛО-9: Спектр ЯМР 13С САМСОЙ, 5, м.д.):

119.4 (1С, САгЗ), 120.8 (1С, САг5), 121.7 (1С, САг6'),

126.3 (1С, САг6), 126.8 (1С, САгЗ'), 130.6 (1С, САг4),

134.9 (1С, САг4'), 137.4 (1С, САг1), 138.8 (1С, САг5'),

140.5 (1С, САг2'), 145.1 (1С, САг1'), 154.3 (1С, САг2),

177.5 (1С, СООН). Масс-спектр: ш/і 286 [М-Н]+. ЛО-10: Спектр ЯМР 13С САМСОЙ, 5, м.д.):

117.6 (1С, САг2'), 119.4 (1С, САгЗ), 120.8 (1С, САг5),

125.9 (1С, САг4'), 126.3 (1С, САг6), 129.3 (1С, САг6'),

130.6 (1С, САг4), 133.6 (1С, САг5'), 137.4 (1С, САг1), 146.8 (1С, САгЗ'), 153.3 (1С, САг1'), 154.3 (1С, САг2), 177.5 (1С, СООН). Масс-спектр: ш/і 286 [М-Н]+.

ЛО-11: Спектр ЯМР 13С (ДМСО-^6, 5, м.д.):

119.4 (1С, САгЗ), 120.8 (1С, САг5), 122.7 (2С, САг2',6'), 124.6 (2С, САгЗ',5'), 126.3 (1С, САг6), 130.6 (1С, САг4), 137.7 (1С, САг1), 138.2 (1С, САг4'), 154.3 (1С, САг2), 158.4 (1С, САг1'), 177.5 (1С, СООН). Масс-спектр: ш/і 286 [М-Н]+.

Исследование эффективности тушения флуоресценции красителей в растворе. Флуориметрию проводили на люминесцентном спектрометре LS55 (РегкіпЕІшег, США), тип регистрации флуоресценции - «на отражение». Интенсивность флуоресценции красителей 5'-карбоксифлуоресцеина (РАМ, ^возб = 490 нм, ^исп = 520 нм) и карбокси-Х-родамина (ЯОХ, ^возб = 580 нм, ^исп = 605 нм) в концентрации 1-10-6 М (растворитель - этанол) была измерена в присутствии азокрасителей, концентрации которых варьировали в диапазоне 1 • 10-3-1 • 10-6 М.

^нтез N-гидроксисукцинимидного эфира

AQ-1. Раствор 0.25 ммоль азокрасителя AQ-1 в 3 мл ТГФ приливали к раствору 0.25 ммоль N-гидроксисукцинимида (NHS) и 0.3 ммоль дицик-логексилкарбодиимида (DCC) в 3 мл ТГФ. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 ч, затем выдерживали при 0 °С в течение 2 суток. ^№-Дициклогексилмочевину отфильтровывали, фильтрат упаривали под пониженным давлением. Спектр ЯМР 'H (ДМСО^6, 5, м.д., J/Гц): 2.7-2.9 (м, 4Н, 2СН2), 3.4 (с, 3Н, ОСН3), 6.4 (д, 1Н, C2H, J 16.0), 6.9 (с, 1Н, СА4), 7.5 (д, 1Н, C1H, J 16.0), 7.6 (с, 1Н, САг6), 7.9 (д, 2Н, САг2',6'),

8.3 (д, 2Н, САг3',5'). Спектр ЯМР 13C (ДМСО-d6, 5, м.д.): 27.5 (2С, 2СН2), 55.7 (1С, OCH3), 111.2 (1С, САг4), 115.6 (1С, САг6), 122.9 (1С, С1Н), 125.8 (2С, САг3',5'), 127.3 (1C, C^5), 137.3 (2C, САг2',6'), 140.8 (1C, C^1), 144.6 (1С, САг2), 147.9 (1С, С2Н), 149.1 (1С, САг1'), 152.0 (1C, CAг3), 153.2 (1C, Cai4'), 168.1 (1С, COO), 172.2 (2C, CO).

Синтез меченых олигонуклеотидов. Для получения меченых олигонуклеотидов использован постсинтетический метод. Олигонуклеотид ODN в количестве 1 о. е. растворяли в 20 мкл 0.5 М карбонатного буфера (NaHCO3/Na2CO3, pH = 9), приливали к раствору 2 мг N-гидроксисукцинимидного эфира AQ-1 в 100 мкл ДМСО и перемешивали в течение суток при комнатной температуре. Затем приливали 1 мл этанола и выдерживали раствор при -20 °С в течение 18 ч, после чего центрифугировали 15 мин при 14000 rpm. Надосадочную жидкость отбирали, осадок сушили под пониженным давлением, приливали 50 мкл деионизованной воды.

Полученный конъюгат ODN-AQ-1 очищали электрофорезом в 15%-ном полиакриламидном геле в трис-ацетатном буфере в денатурирующих условиях при градиенте напряжения 4 В на 1 см длины геля. После окончания электрофореза гель окрашивали бромистым этидием (5 мкг/мл) в течение 10 мин и визуализировали в фотодокументаци-онной системе Gel Camera System (UVP Inc., США). Выделение ODN-AQ-1 из геля осуществляли элюцией 2 М LiClO4 с последующим осаждени-

ем ацетоном. Осадок сушили, растворяли в 50 мкл воды высшей категории качества и определяли концентрацию продукта спектрофотометрически.

Олигонуклеотиды A3FAM, A3gFAM и A3shFAM получены автоматическим твердофазным синтезом на ДНК-синтезаторе ASM-800 (Би-оссет, Россия). Олигонуклеотиды A3ROX, A3gFAM и A3shROX получены от фирмы «Син-тол» (Россия).

Исследование эффективности тушения

флуоресценции в олигонуклеотидных дуплексных структурах

Опыт 1. Образцы объемом 30 мкл в lxSSC-буфере содержали 0.03 о.е. одного из флуоресцентно меченных олигонуклеотидов A3FAM, A3gFAM, A3shFAM и 0.15 о.е. олигонуклеотида ODN-AQ-1.

Опыт 2. Образцы объемом 30 мкл в lxSSC-буфере содержали 0.03 о.е. одного из флуоресцентно меченных олигонуклеотидов A3ROX, A3gFAM, A3shROX и 0.15 о.е. олигонуклеотида ODN-AQ-1.

Кривые плавления олигонуклеотидных дуплексов получены на ДНК-амплификаторе iCycler iQ (BioRad, США). Шаг изменения температуры задавался равным 0.5 °С с интервалом 10 с, диапазон изменения температуры - от 10 до 95 °С.

Pезультaты и обсуждение

Поиск эффективных и недорогих тушителей флуоресценции для мечения нуклеиновых кислот до сих пор остается актуальной задачей. Он осуществляется с учетом двух основных требований: 1) соединение должно обладать высокой эффективностью тушения целевого флуорофора и 2) структура соединения должна обеспечивать возможность ковалентного связывания с молекулами нуклеиновых кислот.

Поскольку наиболее применимыми тушителями флуоресценции являются азокрасители, а наиболее удобной формой для внедрения - карбоксипроизвод-ные, нами был осуществлен синтез карбоксилсодержащих азокрасителей, которые получали по реакции азосочетания (рис. 1). В качестве аминокомпоненты был взят ряд замещенных анилинов, в качестве азосоставляющей - феруловая и 4-оксибензойная кислоты, резорцин и №метил-Ы-фенил^-аланин.

Таблица 1

Использованные в работе олигонуклеотиды

Шифр Последовательность, 5'^3' Длина, число нукледотидных оснований

ODN nh2-tga-gag-ttg-aat-gtt-aat-aat 21

ODN-AQ-1 AQ-TGA-GAG-TTG-AAT-GTT-AAT-AAT 21

A3FAM ATTATTAACATTCAACTCTCA-FAM 21

A3gFAM ATTATTAACATTGAACTCTCA-FAM 21

A3shFAM TTCAACTCTCA-FAM 11

A3ROX ATTATTAACATTCAACTCTCA-ROX 21

A3gROX ATTATTAACATTGAACTCTCA-ROX 21

A3shROX T T CAAC TCT CA-ROX 11

Ме

РЬ—N СООН

ЫН?

ЛО-5, 6

€^N = N^0^

Ме

N СООН

Я К"'

■

НО

Я—СООН

ЛО-1, 4, 8-11

я—соон

НО

где

К = 4-803Н, 4-С00Н, 2-Ы02, 3-Ы02, 4-Ы02, 2-С1, 4-1 К’ = 3'-0СН3, 4'-0Н

К’’ = 5'-(2-карбокси)этенил, 5'-С00Н, -Н.

Рис. 1. Общая схема синтеза азокрасителей.

Для полученных азокрасителей были сняты спектры поглощения в кислой и щелочной средах. Известно, что азогруппа обусловливает появление интенсивной полосы перехода в области 280-320 нм [8]. Введение электронодонорного заместителя в сопряженное с азогруппой положение смещает полосу перехода в

видимую область спектра, введение электроноакцептор-

Структура и наиболее длинноволновые полосы

ного заместителя в сопряженное с азогруппой положение второго ароматические остатка еще более усиливает это смещение. В щелочной среде азосоединение депро-тонируется, что приводит к появлению характерных интенсивных полос в видимой области. Все полученные азокрасители имеют характерные спектры поглощения в области 300-600 нм (табл. 2).

Таблица 2

поглощения синтезированных азокрасителей

Шифр Структура азокрасителей ^погл? НМ pH < 7 ^погл? нм pH > 7 І8 є, pH > 7

ОСН3

лд-1

лд-4

лд-5

лд-6

лд-8

лд-9

лд-ю

лд-11

ОН

SO3H

ОН ^ .соон

^Ме

N .соон

С1

Ме

I

хт

НО.

соон

соон

^\/NO2 НОх

N = N

О^

O2N

НО.

НО

N = N

соон

соон

соон

330

343

485

410

358

362

360

376

549

434

490

518

435

466

467

521

4.0

4.6

3.9

3.9

4.4

4.2

4.3

4.7

Я

Анализ совокупности полученных спектральных характеристик позволяет сделать предположение, что азокрасители ло-1 , 6 и 11 могут эффективно тушить флуоресценцию ГАМ (^исп = 520 нм) и Я0Х (^исп = 605 нм), поскольку имеют полосы поглощения, наиболее близкие к спектрам возбуждения указанных флуорофоров. Однако по спектрам поглощения нельзя однозначно судить об эффективности тушения, поэтому было изучено тушение всеми азокрасителями флуоресценции ГАМ и Я0Х в растворе.

Эффективность тушения была оценена нахождением динамической константы тушения согласно уравнению Штерна-Фольмера: Шя = 1 + Кч[д], где К - динамическая константа тушения, [д] - концентрация тушителя д, Шч - отношение интенсивностей флуоресценции без и в присутствии тушителя. На основании полученных величин были построены кривые, аппроксимация которых дает значения констант тушения (табл. 3). Для всех кривых величина достоверности аппроксимации Я2 > 0.98.

Полученные результаты позволяют утверждать, что азокрасители ло-1 , 5, 6 и 11 наиболее эффективно тушат флуоресценцию ГАМ, а азокраситель AQ-1 - флуоресценцию Я0Х. Для синтеза меченого тушителем олигонуклеотида был выбран азокраситель AQ-1. Получение конъюгата ОБ]Ч^-1 проводили взаимодействием №гидроксисук-цинимидного эфира AQ-1 по аминогруппе олиго-

нуклеотида ОБ]Ч, его образование доказано электрофорезом в полиакриламидном геле. ОБ]\-лд-1 образует с флуоресцентно мечеными олигонуклеотидами (табл. 1) дуплексные структуры различной степени комплементарности (рис. 2).

Во всех дуплексах тушитель расположен по 5'-концу верхнего олигонуклеотида. Флуоресцентные метки ГАМ и ЯОХ находятся по З'-концу второго олигонуклеотида, что обеспечивает пространственное сближение меток и наибольшую эффективность переноса энергии флуоресценции. Профили плавления дуплексных структур представлены на рис. 3 и 4.

Таблица 3 Константы тушения флуоресценции К синтезированных азокрасителей

Шифр К-10" 3, м-1

флуорофор ГАМ флуорофор ЯОХ

лд-1 128.3±3.5 213.9±7.9

лд-4 13.1±0.4 1.6±0.0

лд-5 121.8±2.7 4.5±0.4

лд-6 215.5±4.3 47.8±1.5

лд-8 45.7±0.8 4.6±0.6

лд-9 24.5±0.6 2.8±0.3

лд-10 16.8±0.9 7.2±0.6

лд-11 496.8±8.9 34.7±2.6

5’ AQ-TGAGAGTTG.4_4TGTT.4_4T.4_4T

І І І І І І І І І І І І І І І І І І І І I

З'-ГАМ-АСТСТСААСТТАСААТТАТТА

I И

5’ А(3 TGAGAGTTGAATGTT.4AT.4AT

3’- ROX.4CTCTCAACTTACAATT.4TTA

I К

5' А(2 ТСАСАСТТСААТСТТААТААТ

ІІІІІІІІ ІІІІІІІІІІІІ

З'-ЕАМ АСТСТСААСТТАСААТТАТТА

II Р

5’ А(2 TGAGAGTTGAATGTT.4AT.4AT

З’ ЯОХ АСТСТСААСТТАСААТТАТТА

II Я

5’ АС> ТСАСАСТТСААТСТТААТААТ

ІІІІІІІІІІІ

З’ Б.4М АСТСТСААСТТ

5' AQ-TGAGAGTTG.4ATGTTA4T.A4T

ІІІІІІІІІІІ

3’ ПОХ АСТСТСААСТТ

III Г III Я

Рис. 2. Строение олигонуклеотидных дуплексов.

Рис. 3. Профили плавления олигонуклеотидных дуплексов, содержащих в качестве флуорофора ГАМ.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что азокраситель AQ-l достаточно эффективно тушит флуоресценцию FAM и ROX в олигонук-леотидных дуплексных структурах, т.к. в отожженном состоянии наблюдается минимум интенсивности свечения, которая после плавления дуплексов увеличивается. Для всех дуплексных структур дифференцированием кривых плавления найдены температуры плавления (табл. 4).

Таблица 4

Температуры плавления дуплексных структур

Дуплекс Т °С Тпл, эксп С T °С пл, теор С

I б3.0 б3.3

II 5б.0 5б.8

III 34.0 33.3

Для дуплексов группы I температура плавления оказалась максимальной вследствие совершенности структуры. Однонуклеотидная замена в дуплексах группы II дестабилизирует вторичную структуру, что приводит к понижению температуры плавления. Вследствие укороченности структуры дуплексов третьей группы происходит значительное снижение температуры плавления. Во всех трех случаях наблюдается хорошая корреляция расчетных и экспериментальных значений температуры плавления.

Таким образом, было синтезировано 8 карбоксилсодержащих моноазокрасителей, для которых получены спектральные характеристики и исследовано тушение ими флуоресценции FAM и ROX в растворе. Азокраситель с наибольшей константой тушения был введен в молекулу олигонуклеотида и на примере олигонуклеотидных дуплексных структур показана эффективность его использования в качестве тушителя. Полученные экспериментальные данные подтвердили верность стратегии поиска соединений с высокой эффективностью тушения флуоресценции.

ЛИТЕРАТУРА

1. Гарафутдинов Р. Р., Никоноров Ю. М., Чемерис Д. А., Постригань Б. Н., Чубукова О. В., Талипов Р. Ф., Вахитов В. А., Чемерис А. В. Новые способы генерации сигнала флуоресценции при анализе однонуклеотидных замен с помощью химерных гибридизационных зондов в реальном времени // Биоорганическая химия. 2009. Т. 35. С. 665-673.

2. Рубин А. Б. Биофизика. М.: изд-во МГУ, 2004. 464 с.

3. Tyagi S., Bratu D. P., Kramer F. R. Black hole quencher dyes // Nature biotechnology. 1998. V. 16. P. 49-53.

4. May J. P., Brown L. J., Rudloff I., Brown T. A new dark quenchers for use in genetic analysis // Chem. Commun. 2003. P. 970-971.

5. Invitrogen by Life Technologies. URL: http://www.invitrogen.com/ site/us/en/home.html

6. James Y. Ch., Lin H., Tan W. Molecular assembly of superquenchers in signaling molecular interactions // J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127. P. 12772-12773.

7. Marras S. A. E., Kramer F. R., Tyagi S. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. №21. P. 122.

8. Степанов Б. И. Введение в химию и технологию органических красителей. М.: Химия, 1977. 488 с.

Поступила в редакцию 08.11.2010 г.