CC BY
104
УДК 577.113.4
ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТУШЕНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ПРОИЗВОДНЫМИ ФЕРРОЦЕНА В ДИАПАЗОНЕ 500-600 НМ
© М. А. Лукьянова1*
А. В. Чемерис2, Р. Ф. Талипов1
, Р. Р. Гарафутдинов2, А. Р. Сахабутдинова2,
Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450074 г. Уфа, ул. Заки Валиди, З2.
Тел./факс: +7 (347) 273 67 78.
2Институт биохимии и генетики УНЦ РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71.
Тел./факс: +7 (347) 235 60 88.
E-mail: lukyanovamariyaan@mail.ru
Синтезирован ряд коммерчески недоступных монозамещенных производных ферроцена, получены их спектральные характеристики и изучено тушение ими флуоресценции 5(6)-карбоксифлуоресцеина, 5(6)-карбоксиродамина и 5(6)-карбокси-Х-родамина в растворе. Показано, что увеличение длины цепи сопряжения кратных связей закономерно приводит к батохромному сдвигу полосы поглощения ферроцена, соответствующая электронному переходу 5a1g^4e1g, на 15—90 нм с гиперхромным эффектом. Установлена прямая зависимость эффективности тушения от спектральных характеристик полученных производных, что свидетельствует о преимущественном динамическом характере тушения флуоресценции.
Ключевые слова: ферроцен, нуклеиновые кислоты, тушение флуоресценции, резонансный перенос энергии флуоресценции.
Введение
Производные ферроцена являются классическими тушителями возбужденных состояний. Высокая стабильность в видимой области спектра, обратимость окислительно-восстановительной пары ферроцен-ферроцений, электроактивность и доступность позволяют использовать его с большим разнообразием люминофоров во внутримолекулярных процессах в растворах. Перенос энергии флуоресценции в системах, содержащих ферроцен, может осуществляться по механизму Декстера за счет обмена электронами или по механизму Ферстера за счет диполь-дипольного взаимодействия [1].
Ферроцен и его производные известны в качестве эффективных тушителей триплетных состояний молекул, их константы тушения намного выше констант органических тушителей и приближаются к диффузионному пределу [2-4]. Межмолекулярное тушение ферроценом синглетных состояний остается малоизученным, хотя этот фотофизический процесс все шире используется при исследовании процессов переноса электронов в различных системах, например, искусственного фотосинтеза, образования фототока, а также в биологии [2]. Так, Ре^аик et а1. наблюдали тушение флуоресценции некоторых по-лиароматических углеводородов ферроценом в циклогексане [5]. Ими предложен механизм синглет-синглетной передачи энергии на основании спектров испускания углеводорода, частично совпадавших со спектром поглощения ферроцена. Другими авторами доказана двойственность механизма передачи энергии и электронов для порфиринов, образованию синглетного состояния которых препятствовали некоторые производные ферроцена [6].
Явление переноса энергии флуоресценции широко используется в биоаналитических системах; в частности, оно лежит в основе работы оли-
гонуклеотидных гибридизационных зондов. При этом в качестве репортерных групп наиболее применимы органические флуорофоры с длинами волн испускания в диапазоне 500-650 нм, например, 5(6)-карбоксифлуоресцеин (БАМ, А,исп= 521 нм), 5(6)-карбоксиродамин (Я60, Хисп = 557 нм), 5(6)-карбокси-Х-родамин (ЯОХ, Хисп = 605 нм) и ряд других. Для тушения синглетных возбужденных состояний данных соединений на практике применяются исключительно азокрасители. В то же время нет ограничений для использования в качестве тушителей других соединений, в том числе производных ферроцена. С тех пор как были предложены методы введения остатка ферроцен в молекулы сложного состава, открылась перспектива к созданию новых фото- и электрохимически активных соединений [7]. Данная работа посвящена синтезу монозамещенных производных ферроцена и исследованию тушения ими флуоресценции в области 500-600 нм с целью поиска эффективных тушителей ферроценового ряда.
Экспериментальная часть
В работе использовались следующие реактивы: ферроценальдегид, ферроцен, борогидрид натрия, 4-аминоацетофенон, 4-ацетилбензойная кислота, 4-нитроанилин, медный и цинковый порошки (производства фирм А1Га Ае8аг, Б1ика, Аего8), а также вспомогательные реактивы и растворители отечественного производства. Для качественного ТСХ-анализа использовали пластинки 8огЪй1 с обнаружением веществ йодом или под УФ излучением, колоночную хроматографию осуществляли на оксиде алюминия или силикагеле.
Спектры ЯМР сняты на приборе Вгикег АМ 300 (Вгикег, Г ермания) с рабочей частотой 300 МГ ц (растворители СБС13, БМ8О-ё6 или ацетон-<16). Спектры поглощения получены на УВИ-
* автор, ответственный за переписку
спектрометре 3600 (Shimadzu, Япония) для растворов веществ в этаноле при концентрации 1 • 10-4 М. Флуориметрию проводили на люминесцентном спектрометре LS55 (РегкіпЕІтег, США). Для красителей БАМ, ИЪ и ЯОХ в концентрации 2-10-6 М в этаноле были получены значения интенсивности флуоресценции в присутствии различных количеств (110-3, 2.410-4, 6.410-5, 1.610-5, 410-6, 110-6 М, 0 М) производных ферроцена.
Ацетилферроцен 1 синтезировали согласно [8]. Получены кристаллы оранжевого цвета. Яг=0.3 (гексан: этилацетат 3:1). Тпл=85 °С. Спектр ЯМР 1Н (СБС13, м.д.): 2.4 (с, 3Н, СОСН3), 4.2 (с, 5Н, С5Н5),
4.5 (с, 2Н, С3,4), 4.7 (с, 2Н, С2,5).
Синтез в-ферроценоилпропионовой кислоты 2 проводили согласно следующей методики. К 1.2 г возогнанного АІСІ3 приливали 10 мл сухого дихлор-метана, затем небольшими порциями при перемешивании вносили 0.8 г янтарного ангидрида. Смесь перемешивали 15 мин в токе азота, после чего прикапывали раствор 1.5 г РсН в сухом дихлорметане и продолжали перемешивание в атмосфере азота при комнатной температуре в течение 3 ч. Далее смесь выливали на 10 г льда, приливали 2 мл концентрированной НС1 и отделяли органическую фазу. Водный слой экстрагировали дихлорметаном (2x10 мл), органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором гидрокарбоната натрия (2x10 мл), водную фазу удаляли. Органический слой упаривали, к остатку приливали 5 мл 10 % №ОН. Кристаллы непрореагировавшего ферроцена удаляли фильтрованием на фильтре Шотта. Полученный раствор соли в-ферроценоилпропионовой кислоты подкисляли НС1 до слабокислой реакции по конго. Выпавший осадок отфильтровали, сушили на воздухе, целевой продукт выделяли с помощью колоночной хроматографии (гексан:этилацетат 3:1). Получили порошок желтого цвета, Тпл=160°С, И^=0.28 (бен-зол:метанол 9:1). Спектр ЯМР 1Н (ДМСО^6, м.д.):
3.05 (т, 2Н, Р-СН2); 3.15 (т, 2Н, а-СН2); 4.25 (с, 5Н,
С5Н5); 4.55 (т, 2Н, С3,4); 4.85 (д, 2Н, С2,5).
Синтез о-ферроценоилбензойной кислоты 3 осуществляли аналогично предыдущей методике. Получили порошок бордового цвета, Тпл=180°С, Яг=0.67 (ацетон:хлороформ 1:2). Найдено, %: С 62.19; Н 3.93; Ре 16.95, С18Н14О3Ре. Вычислено, %: С 64.67; Н 4.19; Ре 16.77. Спектр ЯМР 1Н (ДМСО-d6, м.д.): 4.2 (с, 5Н, С5Н5); 4.35 (д, 2Н, С3,4); 4.5 (д, 2Н, С2,5); 7.6-7.8 (м, 4Н, Саг).
Для получения в-ферроценилиденацетона 4 к 0.5 г РсСНО приливали 1 мл ацетона и 1.6 мл воды, охлаждали до 10 °С, после чего приливали 600 мкл 10 % №ОН и перемешивали в течение 1 ч. Далее приливали 400 мкл 10 % НС1 и отфильтровывали выпавший осадок на фильтре Шотта, несколько раз промывая водой. Получили кристаллы темно-бордового цвета, Тпл=75°С, И^=0.62 (бензол:метанол 9:1). Спектр ЯМР 1Н (СБС13, м.д.): 2.3 (с, 3Н, СН3); 4.15 (с, 5Н, С5Н5); 4.5 (д, 2Н, С3,4); 4.7 (д, 2Н, С2,5); 6.4 (д, 1Н, Срс, I 15.98); 7.4 (д, 1Н, Ссо, I 15.98).
Ферроценилиден-и-карбоксиацетофенон 5 получали конденсацией 0.64 РсСНО и 0.5 г 4-ацетилбензойной кислоты в 20 мл толуола в присутствии 400 мкл пиперидина и молекулярных сит (3А) при нагревании с обратным холодильником в течение 2 ч. По охлаждении к реакционной смеси добавили 2 мл концентрированной НС1, выпавший осадок отфильтровали на фильтре Шотта, несколько раз промывая водой. Получили кристаллы фиолетового цвета. Яг=0.3 (этанол:хлороформ 1:1). Спектр ЯМР 1Н (ДМСО-ё6, м.д.): 4.2 (с, 5Н, С5Н5);
4.6 (с, 2Н, С3,4); 4.8 (с, 2Н, С2,5); 7.4 (д, Н, Срс, I 15,3); 7.6 (д, Н, ССО, I 15.3); 8.1-8.3 (м, 4Н, САг).
Ферроценилметанол 6 получали восстановлением 0.5 г рсСНО борогидридом натрия (0.05 г) в 5 мл ТГФ при нагревании с обратным холодильником в течение 1 ч. По окончании реакции приливали воду, добавляли кристаллический №С1. Органическую фазу отделяли и упаривали, предварительно высушив над MgSO4. После удаления растворителя сухой остаток подвергали колоночной хроматографии (А12О3, этилацетат: гексан 1:2). Получили кристаллы желтого цвета. Яг=0.31 (бензол:метанол 9:1), Тпл=79-81 °С.
п-Нитрофенилферроцен 7 и п-аминофенилфер-роцен 8 получали по [9]. Соединение 7 представляет собой порошок темно-фиолетового цвета. К^=0.7 (гексан:этилацетат 3:1). Тпл=166-167 °С. Спектр ЯМР 1Н (СБС13, м.д.): 4.10 (с, 5Н, С5Н5); 4.45 (с, 2Н, С3,4); 4.74 (с, 2Н, С2,3); 7.55 (д, 2Н, Саг2,6); 8.10 (д, 2Н, САг3,5). Соединение 8 - кристаллическое вещество оранжевого цвета. Я(=0.33 (гексан: этилацетат 3:1). Тпл= 160 °С. Спектр ЯМР 1Н (СБС13, м.д.): 3.6 (с, 2Н, КН2); 4.05 (с, 5Н, С5Н5); 4.25 (с, 2Н, С3,4); 4.55 (с, 2Н, С2,5); 6.65 (д, 2Н, САг2,6; I 8.6); 7.30 (д, 2Н, Саг3,5; I 8.6).
Результаты и обсуждение
В настоящее время ферроцен используется исключительно в качестве электроактивной метки при введении в молекулы нуклеиновых кислот [7, 10-12], однако полное отсутствие люминесценции в видимой области и наличие хромофорных свойств позволяют рассматривать его как потенциальную тушащую метку. Ранее для ферроцена и трех его производных было изучено тушение флуоресценции халконоподобных структур [2]. Данная работа стала одной из первых, в которой детально исследована дезактивация синглетного состояния органических флуорофоров.
С целью поиска эффективных тушителей флуоресценции ферроценового ряда в диапазоне 500-600 нм нами был синтезирован ряд коммерчески недоступных монозамещенных производных из ферроцена РсН и ферроценальдегида РсСНО (рис. 1). Известно, что ферроцен участвует в большинстве реакций, типичных для ароматических систем [9]. Так, ацилированием ферроцена нами были получены ацетилферроцен 1, в-ферроценоилпропионовая 2 и о-ферроценоилбензойная кислоты 3, по реакции альдольно-кротоновой конденсации рсСНО с соот-
ветствующими кетонами - в-ферроценилиденацетон 4 и ферроценилиден-п-карбоксиацето-фенон 5. Восстановление БсСНО борогидридом натрия дало с высоким выходом ферроценилметанол 6. Арилиро-ванием ферроцена синтезирован п-нитрофенилфер-роцен 7, восстановление которого привело к п-аминофенил-ферроцену 8. Строение всех полученных соединений подтверждается спектрами ЯМР 1Н.
Среди представленных соединений можно условно выделить несколько групп на основании природы ближайшей к ферроценовому ядру связи. Группу I составляют РсСНО и структуры 1, 2 и 3 (ферроценоил-производные), к группе II относятся 4 и 5 (ферроценилиден-производные), к группе III -соединения 7 и 8 (арилзамещенные). Особняком стоят РсН и ферроценилметанол 6. Для всех структур , кроме БсН и 6, имеет место сопряжение электронной плотности п-связей ферроценового ядра и прилегающей системы кратных связей, при этом наибольшая длина цепи сопряжения присуща группе III, наименьшая - группе I. Очевидно, что характер распределения электронной плотности в структурах внутри одной группы будет сходным.
Поскольку с увеличением числа сопряженных связей в молекуле максимум в спектре поглощения сдвигается в сторону больших длин волн, можно ожидать, что характерная для незамещенного ферроцена полоса поглощения при 440 нм, соответствующая электронному переходу 5а1§^4е1§, сместится для некоторых его производных в длинноволновую область, при этом величина батохромного сдвига будет максимальной для производных с наиболее протяженной цепью сопряжения. Действительно, найденные полосы поглощения в электронных спектрах подтвердили данное предположение (табл. 1). Оказалось, что максимумы поглощения винил- (4 и 5) и арилзамещенных (7) производных испытывают наибольший батохромный сдвиг, до 90 нм со значительным гиперхромным эффектом. Сильное различие в максимумах поглощения для 7 и 8 обусловлено, вероятно, большей
способностью нитрогруппы к делокализации электронной плотности по сравнению с аминогруппой. Максимумы поглощения производных группы I, как и ожидалось, имеют гораздо меньшее смещение относительно максимума поглощения ферроцена.
Считается, что для ферроцена и его производных тушение флуоресценции носит динамический характер [2], для которого условием эффективного тушения является хорошее перекрытие спектров испускания флуорофора и поглощения тушителя. Для определения эффективности тушения флуоресценции в диапазоне 500-600 нм нами были выбраны три флуорофора: 5(6)-карбоксифлуоресцеин (FAM, ^исп= 521 нм), родамин С (Rh, Хисп = 550 нм) и 5(6)-карбокси-Х-родамин (ROX, Хисп = 605 нм). Зная максимумы поглощения производных ферроцена, можно предположить, что наилучшими тушителями для них будут соединения, имеющие в спектре самое близкое значение длины максимума поглощения, т.е. соединения S, Т и 4.
Однако по спектрам поглощения нельзя однозначно судить об эффективности тушения, поскольку может реализоваться механизм тушения не только по пути резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET), но и по пути статического тушения, для которого условие хорошего спектрального перекрывания не является обязательным. Поэтому далее для оценки эффективности тушения нами было изучено тушение производными ферроцена флуоресценции FAM, Rh и ROX в спиртовом растворе при концентрации последних 10-6М, исключающей эффекты агрегации самого флуорофора. Эффективность тушения была оценена путем нахождения динамической константы тушения согласно уравнению Штерна-Фольмера: I/ = 1 + Kd[Q], где I0 и I - интенсивности флуоресценции в отсутствие и в присутствии тушителя, [Q] - концентрация тушителя; Кд - константа тушения. На основании измерений были построены кривые, аппроксимация которых дает значения констант тушения (табл. 1). Для всех кривых величина достоверности аппроксимации R2 > 0.97.
OO
O COOH
Fc"
Fc COOH Fc
2З
O
Fc
COOH
O
Fc ^ Fc OH
4 б
NO2 Fc
Т
-NH2
8
Fe Fe
FcH FcCHO
Рис. 1. Структуры ферроцена FcH, ферроценальдегида FcCHO и синтезированных производных 1-8.
1
S
O
Таблица 1
Полосы поглощения электронного перехода 5а^^-4е^ и динамические константы тушения флуоресценции производных ферроцена
Кд10-3, М-1
С о единение лпогл, нм (lg е) FAM 1 Rh I ROX
FcH 440 (2.88) 1.2±0.2 0.38±0.07 0.30±0.04
FcCHO 460 (3.71) 20±2 5.0±0.5 1.9±0.6
1 455 (3.39) 29±3 0.85±0.06 0.35±0.08
2 465 (3.58) 11±1 3.5±0.3 1.2±0.1
З 470 (3.77) 60±8 15±1 8±1
4 490 (4.15) 72±7 8±3 26±2
5 530 (4.36) 142±11 26±5 67±7
б 435 (3.09) 1.02±0.05 0.25±0.08 0.2±0.1
Т 500 (3.16) 309±21 29±8 61±5
8 460 (2.20) 0.60±0.02 0.46±0.07 0.3±0.1
Dabcyl 468 (4.52)* 878±47 70±4 17±1
BHQ-1 534 (4.53)* 316±26 66±3 220±33
* согласно [13]
Наибольшей константой тушения флуоресценции указанных красителей обладает 7, достаточно высокие константы также у 5, 4 и 3, что находится в хорошем соответствии с выводами, сделанными при анализе спектров поглощения. В целом наблюдается рост констант тушения флуоресценции со смещением максимумов поглощения в видимую область. Найдено, что ферроценилиден-п-карбоксиацетофенон и п-нитрофенилферроцен
имеют наибольшие константы тушения, что объясняется наличием в молекулах длинной сопряженной системы, обеспечивающей значительную делокализацию р-электронов. Высокое значение константы тушения флуоресценции для 7, вероятно, обусловлено тем, что тушение этим соединением носит не только динамический, но и статический характер. В целом наблюдается четкая корреляция между положением максимума поглощения и величиной константы тушения, что свидетельствует о преимущественном динамическом характере тушения флуоресценции для полученных соединений.
Сравнение констант тушения флуоресценции для производных ферроцена и широко используемых тушителей БаЬсу1 и BHQ-1, найденных в сходных условиях, показало, что первые уступают по эффективности тушения указанным азокрасителям. Несмотря на данный недостаток, полученные результаты могут послужить основой для направленного поиска хромофорных соединений ряда ферроцена - потенциальных тушителей флуоресценции для ковалентного мечения нуклеиновых кислот и создания гибридизационных зондов. При этом преимущества ферроценовых меток заключаются в возможности одновременного использования флуори-
метрических и электрохимических методов для анализа одного и того же меченого образца.
Работа поддержана Министерством образования и науки РФ (контракт № 14.740.11.0244).
ЛИТЕРАТУРА
1. Fery-Forgues S., Delavaux-Nicot B. Ferrocene and ferrocenyl derivatives in luminescent systems // J. of Photochem. Photobiol. A. 2000. V. 132. PP. 137-159.
2. Fery-Forgues S., Delavaux-Nicot B., Lavabre D., Rurack K. Intermolecular quenching of excited singlet states by ferrocenyl derivatives: study with ketocyanine dyes // J. of Photochem. Photobiol. A. 2003. V. 155. PP. 107-114.
3. Farmilo A., Wilkinson F. Triplet state quenching by ferrocene // J. Phys. Chem. 1975. V. 34. PP. 575-580.
4. Gilbert A., Kelly J. M., von Gustorf E. Quenching of triplet fluorenone by organometallic compounds // Mol. Photochem. 1974. V. 6. PP. 225-230.
5. Penigault E., Braun A. M., Faure J. Singlet-singlet energy transfer from several aromatic hydrocarbons to ferrocene // C. R. Acad. Sci. Paris. Ser. C. 1976. V. 283. PP. 655-658.
6. Giasson R., Lee E. J., Zhao X., Wrighton M. S. Inter- and intramolecular quenching of the singlet excited state of porphyrins by ferrocene // J. Phys. Chem. 1993. V. 97. PP. 2596-2601.
7. Seiwert B., Karst U. Ferrocene-based derivatization in analytical chemistry // J. Anal. Bioanal. Chem. 2008. V. 390. P. 181-200.
8. http://imr.chem.binghamton.edu/labs/ferrocene/ferrocene.html
9. Перевалова Э. Г., Решетова М. Д., Грандберг К. И. Железоорганические соединения. Ферроцен. М.: Наука, 1983. 544 c.
10. Anne A., Demaille C. Dynamics of Electron Transport by Elastic Bending of Short DNA Duplexes. Experimental Study and Quantitative Modeling of the Cyclic Voltammetric Behavior of 3-Ferrocenyl DNA End-Grafted on Gold // J. Am. Chem. Soc. 2006. V. 128. PP. 542-557.
11. Staveren D. R., Metzler-Nolte N. Bioorganometallic Chemistry of Ferrocene // Chem. Rev. 2004. V. 104. PP. 5931-5985.
12. Swami N.S., Chou C.-F., Terberueggen R. Two-Potential Electrochemical Probe for Study of DNA Immobilization // Langmuir. 2005. V. 21. PP. 1937-1941.
13. http://www.glenresearch.com
Поступила в редакцию 19.03.2012 г.
