CC BY
63
УДК 53.06; 57.088; 577.1
Подход к диагностике точечных мутаций в нативной ДНК с применением оксида графена
А. А. Кузнецов*, Н. Р. Максимова, В. С. Каймонов, Г. Н. Александров, С. А. Смагулова
Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова, 677000, Республика Саха
(Якутия), Якутск, ул. Белинского, 58
*E-mail: kuznecov.artem@mail.ru
Поступила в редакцию 19.11.2015
Принята к печати 02.02.2016
РЕФЕРАТ C целью диагностики точечных мутаций в нативной ДНК разработан новый подход к созданию тест-систем с применением оксида графена. Принцип нового подхода заключается в использовании оксида графена для сорбции и тушения флуоресцентно меченных праймеров в постамплификационной ПЦР-смеси с последующей регистрацией флуоресцентно меченного продукта ПЦР. Благодаря различной аффинности одно- и двухцепочечных молекул ДНК к оксиду графена, а также способности оксида графена выступать в роли тушителя флуоресценции адсорбированных на его поверхности флуорофоров, существует возможность выявления флуоресцентно меченных ампликонов в присутствии избытка флуоресцентно меченных праймеров в продуктах ПЦР. Подход апробирован при создании тест-системы для ДНК-диагностики точечной мутации в гене CUL7 (4582insT), ассоциированной с формированием ЗМ-синдрома у якутов. Разработанный подход позволяет создавать тест-системы с применением оксида графена, предназначенные для диагностики любых точечных мутаций в нативной ДНК. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА диагностика, оксид графена, точечные мутации, тест-система.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ТМ - точечная мутация; ПЦР - полимеразная цепная реакция; ПДРФ-анализ - анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов; FAM - 6-карбоксифлуоресцеин; ROX - карбокси-Х-родамин.
ВВЕДЕНИЕ
Диагностика точечных мутаций (замен, инсерций, делеций, далее - ТМ) чрезвычайно важна для современной медицины, так как позволяет судить о предрасположенности к различным заболеваниям, осуществлять правильный подбор лекарств и открывает путь к изучению функций генов. В современной медицинской генетике используют несколько основных методов диагностики ТМ в нативной ДНК [1]: ПЦР-ПДРФ-анализ, флуоресцентные методы детекции (ПЦР в реальном времени, ПЦР с регистрацией сигнала по конечной точке), технологии с применением биочипов и секвенирование. Однако все эти методы имеют определенные недостатки, поэтому актуальным остается поиск новых более быстрых, экономичных и эффективных подходов к диагностике ТМ в нативной ДНК [2].
В последние годы при поиске подходов к диагностике ТМ активно используется оксид графена, который обладает двумя уникальными свойствами - способностью к тушению флуоресценции находящихся вблизи него флуорофоров [3] и различной аффинно-
стью по отношению к одно- и двухцепочечным молекулам ДНК [4] при низкой стоимости и простоте синтеза. С применением этих свойств за последние 5 лет разработано большое число различных подходов к диагностике ТМ с применением оксида графена, например, [5-9]. Однако эти подходы эффективны в случае диагностики ТМ в небольших по длине одноцепочечных олигонуклеотидах, и ни один из них не позволяет диагностировать ТМ в нативной ДНК [10]. Целью данного исследования стала разработка подхода к диагностике ТМ в нативной ДНК с применением оксида графена.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы
Оксид графена синтезировали из натурального порошка графита согласно модифицированному методу Hummers и соавт. [11]. Использовали реактивы для синтеза оксида графена компании «Востокреактив» (Россия), диализные мешки MFPI MF-1230-45 «Русбиолинк» (Россия), реактивы
ТОМ 8 № 2 (29) 2016 | ACTA NATURAE | 97
Структуры использованных праймеров
для проведения ПЦР (буфер для ПЦР, MgCl2, dNTP, ДНК-полимераза) приобретены в компании «Евроген» (Россия). Использовали аллель-специфичную SNPdetect ДНК-полимеразу («Евроген»). Структура праймеров для ПЦР приведена в таблице.
Продукты ПЦР инкубировали с оксидом графена с использованием разведенного деионизованной водой натрий-фосфатного буфера (10х, Gibco, США). Деионизованную воду (18.2 М^Хсм) получали с помощью системы очистки Milli-Q Advantage A10 (Merck Millipore, Германия).
Характеристики тест-системы определяли на трех группах образцов ДНК (по 16 в каждой группе -больные ЗМ-синдромом с подтвержденной мутацией 4582insT в гомозиготном состоянии, гетерозиготные носители мутации 4582insT, здоровые), выделенных из периферической крови пациентов, от которых получено информированное согласие. Также были использованы 16 отрицательных контролей. Все образцы ДНК генотипировали с помощью тест-системы компании «ТестГен» на основе метода ПЦР в реальном времени (рис. 1). Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом.
Оборудование
Для синтеза оксида графена использовали магнитную мешалку Intelli-Stirrer MSH-300i (Biosan, Латвия), а также ультразвуковой диспергатор ИЛ100-6/3 («ИНЛАБ», Россия) и центрифугу MiniSpin Plus (Eppendorf, Германия). ПЦР проводили с использованием термоциклера С1000 (Bio-Rad, США), интенсивность флуоресценции регистрировали с помощью флуориметра Джин-4 («ДНК-технология», Россия).
Синтез оксида графена
Порошок графита (0.1 г, Sigma Aldrich, США) и нитрата натрия (0.05 г, «х. ч.») добавляли в концентрированную серную кислоту («ос. ч.») объемом 14 мл. Далее мелкими порциями постепенно добавляли 0.4 г перманганата калия («ч.д.а.»). Полученную реакционную смесь перемешивали в химическом стакане в течение 3 недель на магнитной мешалке при температуре 75оС. После перемешивания смесь разбав-
200
у
е 150
LU
О
«N 100
Л
Ü 50
с
<
0
Рис. 1. Результаты генотипирования образцов ДНК с помощью тест-системы на основе метода ПЦР в реальном времени (канал FAM - мутация 4582insT, канал VIC - дикий тип)
ляли деионизованной водой в 2 раза по объему. Далее в смесь добавляли 5% раствор пероксида водорода (7 мл) до появления бриллиантово-желтой окраски. Бриллиантово-желтую смесь фильтровали на воронке Бюхнера с использованием обеззоленного фильтра (желтая лента) диаметром 70 мм и промывали 300 мл деионизованной воды до установления нейтральной среды в фильтрате. При этом получали коричневую гелеобразную массу, которую переносили с фильтра в химический стакан и разбавляли 50 мл воды с последующей ультразвуковой обработкой с объемной мощностью 750 Вт в течение 5 мин на диспергаторе ИЛ100-6/3. После диспергирования суспензию центрифугировали при 14500 об/мин (14.1 g) в течение 5 мин, частицы оксида графита, не расслоившиеся в результате УЗ-обработки, удаляли путем декантации раствора оксида графена над осадком. На последнем этапе проводили диализ раствора в диализных мешках (MWCO: 12000-14000) в течение 3 дней с трехкратной сменой деионизованной воды в стакане объемом 1 л с диализным пакетом. В результате получали однородную суспензию оксида графена темно-коричневого цвета, объемом ~ 50 мл. В высушенной суспензии оксида графена методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии определяли атомное содержание углерода и кисло-
Обозначение Тип праймера Нуклеотидная последовательность, 5'-3'
R Обратный GATGAGGCAGTTCAGAAGATTCC
F-FAM FAM-меченый прямой FAM-CAGGGGTCCTCAAGATTTCG
F-ROX ROX-меченый прямой ROX-CAGGGGTCCTCAAGATTCG
Дискриминация аллелей
8 В
§ /
а ел
i оОД' «fr о
0 200 400 600 Аллель 1, ОЕФ FAM 800 1000
Аллель 1 С Аллель 2 Отсутствует ■'. Гетерозигота
5: £ <
\
МУТАЦИЯ
АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧНАЯ ПЦР
Г
ФЛ1 ФЛ2
АМПЛИКОНЫ
\
ФЛ1
ОКСИД ГРАФЕНА
Рис. 2. Схема диагностики точечных мутаций в нативной ДНК с использованием разработанного подхода
ФЛ2
ФЛ1
рода, которое составило ~58 и ~42% соответственно. Концентрацию оксида графена в суспензии определяли весовым методом, взвешивая сухой остаток от 1 мл суспензии, высушенной при температуре 170оС в течение 5 мин.
Аллель-специфичная ПЦР
Для каждого образца ДНК готовили 25 мкл смеси, содержащей 1х ПЦР-буфер, 3 мМ MgCl2, 0.28 мМ dNTP, 0.2 мкМ праймера R, 0.6 мкМ прай-мера F-FAM, 66.4 нМ праймера F-ROX, 2.5 ед. акт. SNPdetect ДНК-полимеразы и 1.2 нг/мкл ДНК. Температурный профиль ПЦР состоял из денатурации при 95оС в течение 3 мин, 38 циклов амплификации (30 с - денатурация при 95оС, 30 с - отжиг при 60оС, 1 мин - элонгация при 72оС), завершающей элонгации при 72оС в течение 5 мин. Верификацию прохождения амплификации осуществляли методом гель-электрофореза продуктов ПЦР в 3% агарозном геле без добавления бромистого этидия. Длина продукта амплификации составляла 149 п.н. (150 п.н. при амплификации с мутантного аллеля), GC-состав - 55.7%.
Добавление оксида графена к продуктам ПЦР и регистрация флуоресценции
Из каждой пробирки отбирали 15 мкл постампли-фикационной ПЦР-смеси и помещали в 0.6 мл прозрачную микроцентрифужную пробирку. Далее добавляли 3.6 мкл 5х натрий-фосфатного буфера ^Шсо, США) и 4 мкл суспензии оксида графена (0.5 мг/мл) в 1х натрий-фосфатном буфере ^Шсо, США), инкубировали при комнатной температуре на орбитальном шейкере в течение 20 мин (450 об/мин). Измеряли интенсивность флуоресценции по FAM- и ROX-каналам в каждой
пробирке с помощью флуориметра Джин-4 («ДНК-технология», Россия).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Описание разработанного подхода
На рис. 2 изображена схема разработанного подхода.
На первом этапе диагностики проводят аллель-специфичную ПЦР, которая отличается от обычной использованием аллель-специфичной ДНК-полимеразы и трех праймеров. Один из праймеров (обратный, выделен на рис. 2 зеленым цветом) способен комплементарно отжигаться на ДНК аллелей обоих типов (дикого и мутантного). Два других прай-мера (прямые, выделены синим и оранжевым цветом на рис. 2) содержат на 5'-конце разные флуорофо-ры - ФЛ1 и ФЛ2 с неперекрывающимися спектрами возбуждения/эмиссии. Каждый из прямых прайме-ров способен связываться с аллелем только одного типа, поскольку они комплементарны ДНК разных аллелей в области сайта мутации.
В зависимости от генотипа донора ДНК возможно образование трех типов постамплификационной смеси: с ампликонами, меченными флуорофором ФЛ1 (гомозиготный дикий тип); меченными флуорофором ФЛ2 (гомозиготный мутантный тип), и с амплико-нами, меченными обоими флуорофорами (гетерозиготный тип). В любом случае продукты ПЦР будут содержать избыток флуоресцентно меченных прай-меров.
При добавлении водной суспензии оксида графена к постамплификационной ПЦР-смеси на поверхности нанолистов оксида графена будет происходить адсорбция одноцепочечных молекул ДНК - флуоресцентно меченных праймеров, вследствие чего флуоресценция от них будет потушена. Двухцепочечные
s ^
X
ф
J
и ф а
о ^
■в" 5
X
о
-Ч J ф
M
Ф та
х а |Vg
Ф X
X
ф
3
о
X н
О
о и
20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
FAM ROX 0 мкл
FAM ROX 1 мкл
FAM ROX 2 мкл
FAM ROX 3 мкл
FAM ROX 4 мкл
FAM ROX 5 мкл
FAM ROX 6 мкл
Количество добавленной суспензии оксида графена (0.5 мг/мл)
Тип образцов:
Дикий
Мутантный
Гетерозигота
Рис. 3. Соотношение интенсивностей флуоресценции N образец/контроль в каждой клинической группе образцов по FAM- и ROX-каналам при добавлении разных объемов суспензии оксида графена к постамплификацион-ной смеси
молекулы ДНК (ампликоны) будут оставаться в растворе из-за их низкой аффинности к оксиду графена и могут генерировать флуоресцентный сигнал.
Если после добавления избытка оксида графена сравнить интенсивность флуоресценции каждого из флуорофоров в конечном растворе (для анализируемого образца ДНК) и интенсивность флуоресценции в отрицательном контроле, то можно установить генотип донора ДНК.
Апробация разработанного подхода
С применением этого подхода нами разработана тест-система, предназначенная для ДНК-диагностики мутации, ассоциированной с формированием ЗМ-синдрома у якутов. ЗМ-синдром - частое ауто-сомно-рецессивное наследственное заболевание, обусловленное мутацией 4582^Т в экзоне 25 гена CUL7 (К1АА0076, Куллин 7) [12]. Ввиду высокой частоты гетерозиготного носительства мутации, ассоциированной с формированием ЗМ-синдрома у якутов
(около 30 человек на 1000), это заболевание было выбрано для разработки тест-системы с применением оксида графена.
C помощью сервиса Primer Blast (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/) к разным аллелям были подобраны FAM- и ROX-меченые праймеры, по З'-концу комплементарные последовательности ДНК в области мутации (таблица).
На стадии добавления оксида графена к продуктам ПЦР использовали раствор оксида графена (0.5 мг/мл) в 1х натрий-фосфатном буфере, а также сам буфер, чтобы нивелировать влияние pH на интенсивности флуоресценции. После добавления оксида графена измеряли интенсивность флуоресценции каждого образца (в том числе отрицательных контролей) по FAM- и ROX-каналам, после чего рассчитывали средние интенсивности флуоресценции и соотношения интенсивностей образец/контроль в каждой клинической группе образцов по каждому каналу флуоресценции в отдельности. Условия проведения
аллель-специфичной ПЦР, состав ПЦР-смеси, длину амплифицируемого участка, количество оксида гра-фена варьировали для достижения максимального соотношения интенсивностей флуоресценции образец/контроль по каждому каналу флуоресценции.
В ходе оптимизации тест-системы на выборке из шести образцов ДНК носителей мутации 4582insT и здоровых доноров (по два образца каждого типа) и двух отрицательных контролей в семи эквивалентных опытах с разными объемами добавляемой суспензии оксида графена определено количество оксида графена, позволяющее максимально эффективно интерпретировать результаты ДНК-диагностики - 4 мкл с концентрацией 0.5 мг/мл в 1х натрий-фосфатном буфере (рис. 3).
Испытание разработанной тест-системы при ге-нотипировании контрольной выборки из 48 образцов ДНК носителей мутации 4582^Т и здоровых людей (по 16 образцов каждого типа) дало хорошие результаты (рис. 4).
Доверительные интервалы на рис. 4 построены с применением стандартных отклонений, рассчитанных как сумма относительных стандартных отклонений для интенсивностей флуоресценции контрольных и известных образцов по каждому каналу.
Согласно приведенным на рис. 4 данным, разработанная тест-система позволяет достоверно диагностировать все три комбинации аллельных вариантов в гене CUL7. Использование оксида графена в качестве наноструктурного тушителя флуоресценции флуоресцентно меченных праймеров в постам-плификационной ПЦР-смеси позволило добиться практически полного тушения их флуоресценции. При этом флуоресценция от меченого продукта ПЦР в значительной степени сохранялась, что позволило статистически значимо анализировать постампли-фикационную смесь по флуоресцентным свойствам. На протестированной выборке клинических образцов специфичность тест-системы составила 100% (так как все образцы можно однозначно отнести к клиническим группам), а чувствительность - не менее 1.2 нг ДНК, что позволяет говорить о пригодности предложенного подхода для генотипирования точечных мутаций в условиях классической генетической лаборатории. Несомненными достоинствами разработанного метода являются его простота (три стадии) и скорость (2 ч). При этом, теоретически, разработанный подход не ограничен типом детектируемых точечных мутаций (инсерций, делеций, замен), так как он основан на применении аллель-специфичной ПЦР, что позволяет адаптировать данный метод к диагностике любых точечных мутаций, если подобрать оптимальные структуры праймеров и условия
! 25.0
о а
о 20.0
т \
5 з-и (и
£ " <и т !; ¡р
15.0
10.0
э
о
X
I-
о о
С
5.0
0.0
Ли
ДИКИЙ МУТАНТНЫЙ ГЕТЕРОЗИГОТА
ТИП ВЫБОРКИ ОБРАЗЦОВ
Рис. 4. Соотношение интенсивностей флуоресценции N образец/контроль в каждой клинической группе образцов по FAM- и ROX-каналам
диагностики. С учетом простоты метода, низкой стоимости коммерческого оксида графена, доступности используемого для ДНК-диагностики оборудования метод может быть интересен генетическим лабораториям, занимающимся фармакогенетическими исследованиями, а также диагностикой наследственных заболеваний, обусловленных точечными мутациями в ДНК.
ВЫВОДЫ
Нами разработан подход, который предполагает использование оксида графена в качестве нанострук-турного тушителя флуоресценции для проведения диагностики ТМ с применением аллель-специфичной ПЦР. Метод может быть интересен диагностическим лабораториям, в которых для диагностики точечных мутаций (замен, инсерций, делеций) в натив-ной ДНК используется недорогое оборудование типа ПЦР-флуориметров. Достоверность, специфичность и хорошая чувствительность подхода подтверждены при разработке тест-системы для ДНК-диагностики носительства мутации, ассоциированной с формированием 3М-синдрома у якутов. Разработанный подход позволяет создавать тест-системы для диагностики любых точечных мутаций. •
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» (уникальный идентификатор проекта: RFMEFI57514X0015).
N
РАМ
N
1ЮХ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Mamotte C.D.S. // Clin. Biochem. Rev. 2006. V. 27. № 1. P. 63-75.
2. Ye S., Dhillon S., Ke X., et al. // Nucl. Acids Res. 2001. V. 29. № 17. P. e88.
3. Li F., Pei H., Wang L., Lu J., Gao J., Jiang B., Zhao X., Fan C. // Adv. Funct. Mater. 2013. V. 23. № 33. P. 4140-4148.
4. Huang P.-J., Liu J. // Nanomaterials. 2013. V. 3. № 2. P. 221-228.
5. Lu C.H., Yang H.H., Zhu C.L., Chen X., Chen G.N. // Angew. Chemie. Int. Ed. 2009. V. 48. № 26. P. 4785-4787.
6. He S., Song B., Li D., Zhu C., Qi W., Wen Y., Wang L., Song S., Fang H., Fan C. // Adv. Funct. Mater. 2010. V. 20. № 3. P. 453-459.
7. Li J., Huang Y., Wang D., Song B., Li Z., Song S., Wang L., Ji-
ang B., Zhao X., Yan J., et al. // Chem. Commun. (Camb.). 2013. V. 49. № 30. P. 3125-3127.
8. Li Z., Zhu W., Zhang J., Jiang J., Shen G., Yu R. // Analyst. 2013. V. 138. № 13. P. 3616-3620.
9. Xiang D., Zheng A.H., Luo M., Ji X.H., He Z.K. // Sci. China Chem. 2013. V. 56. № 3. P. 380-386.
10. Kuznetsov A.A., Maksimova N.R., Alexandrov G.N., Smagulova S.A. // Yakut Med. J. 2014. V. 4. № 48. P. 142-149.
11. Hummers W.S., Offeman R.E. // J. Am. Chem. Soc. 1958. V. 80. № 6. P. 1339-1339.
12. Maksimova N., Hara K., Miyashia A., Nikolaeva I., Shiga A., Nogovicina A., Sukhomyasova A., Argunov V., Shvedova A., Ikeuchi T., et al. // J. Med. Genet. 2007. V. 44. № 12. P. 772-778.
