CC BY
58
Пробл. особо опасных инф. 2017; 3:105-109. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-3-105-109
УДК 616-07
А.В.Огепанов, н.А.осина, н.В.майоров
оптимизация технологической схемы производства препаратов для генной диагностики особо опасных инфекционных болезней методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов, Российская Федерация
цель: оптимизация технологической схемы получения препарата для генной диагностики чумы с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, связанная с подбором условий синтеза и метода очистки входящих в состав набора олигонуклеотидных зондов, несущих метки флуорофора (6-карбоксифлуоресцеин) и гасителя флуоресценции (Black Hole Quencher-1), оценка их качества и внедрения новой технологической линии в производство. материалы и методы. Объектом для исследования являлся набор реагентов «Ген Yersinia pestis идентификация-РГФ» и входящие в его состав праймеры и зонд, обеспечивающие амплификацию hmsH гена. Синтез праймеров и зондов осуществляли в восьмиканальном синтезаторе ДНК ASM-800 (Биоссет, Россия) твердофазным фосфитамидным методом. Для проведения исследований использовали очистку полученных зондов либо с помощью электрофореза в 20 % полиакриламидном геле размером 20*20 или 8*10 см с последующей очисткой на RP-картриджах в полуавтоматическом режиме на системе 0PS-201 и вручную, либо только с RP-картриджами вручную, либо методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Специфическую активность полученных зондов проверяли в полимеразной цепной реакции с использованием ДНК, выделенной из бактериальных суспензий штамма Yersinia pestis C-624 с концентрациями 1 103-1 106 м.к./мл. результаты и выводы. Оптимизирована технология синтеза и подобран метод очистки олигонуклеотидных зондов, несущих флуорофор-6-карбоксифлуоресцеин и гаситель флуоресценции Black Hole Quencher-1. Показана целесообразность использования для очистки таких олигонуклеотидов, либо комплекса ВЭЖХ, либо электрофореза в 20 % полиакриламидном геле с 7 М мочевиной и последующей хроматографией на RP-картриджах в ручном режиме. внедрение оптимизированной технологической схемы при производстве препаратов для генной индикации идентификации особо опасных патогенов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией позволит сократить сроки их изготовления на 50 % и снизить себестоимость на 66 %.
Ключевые слова: Black Hole Quencher-1, генодиагностические препараты, детекция, 6-карбоксифлуоресцеин, патогенные биологические агенты, синтез зондов.
Корреспондирующий автор: Степанов Андрей Владимирович, e-mail: rusrapi@microbe.ru.
A.V.Stepanov, N.A.Osina, N.V.Mayorov
Optimization of the Technological scheme for the Production of Preparations for Gene Diagnostics of Particularly Dangerous Infectious Diseases Using Polymerase Chain Reaction with Hybridization-Fluorescent Registration of Results
Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov, Russian Federation
Objective of the study was to optimize technological scheme for the production of preparation for gene diagnostics of plague with hybridization-fluorescent registration (HFR) of results, which is associated with the assessment and selection of synthesis conditions and method of oligonucleotide probe purification included into the kit and carrying fluorophore (6-carboxyfluorescein) and quencher (Black Hole Quencher-1) tags, as well as to evaluate their properties and implement this new technological line into manufacturing. Materials and methods. The object of investigation was the reagent panel "Gene Yersinia pestis Identification-HFR" and its constituent elements, probes and primers, providing for hmsH gene amplification. Synthesis of the primers and probes was carried out in 8-well DNA synthesizer ASM-800 (Bioset, Russia), using solid phosphite amid method. For the experiments the probes obtained were purified either by means of electrophoresis in 20 % polyacrylamide gel (size 20*20) or (size 8*10) with further purification through RP-cartridges in semi-automated mode in 0PS-201 system and manually, or on RP-cartridges only in manual mode; or applying highperformance liquid chromatography (HPLC). Specific activity of the produced probes was tested by polymerase chain reaction using the DNA isolated from bacterial suspensions of Yersinia pestis C-624 strain, in concentrations up to 1 103 - 1 106 mc/ml. Results and conclusions. Optimized has been synthesis technology; selected has been the method for oligonucleotide probe purification, carrying phluorophore-6-carboxyphluorescin and Black Hole Quencher-1. Demonstrated is viability of applying the stated oligonucleotides or HPLC, or electrophoresis in 20 % polyacrylamide gel with 7 M urea and further purification through RP-cartridges in manual mode for purification purposes. Introduction of the optimized technological scheme in manufacturing of preparations for gene indication and identification of particularly dangerous pathogens with hybridization-fluorescent detection will allow for the reduction of lead time by 50 % and original cost - by 66 %.
Key words: Black Hole Quencher-1, gene diagnostic preparations, detection, 6-carboxyfluorescein, pathogenic biological agents, probe synthesis.
Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.
Corresponding author: Andrey V. Stepanov, e-mail: rusrapi@microbe.ru.
Citation: Stepanov A.V., Osina N.A., Mayorov N.V. Optimization of the Technological Scheme for the Production of Preparations for Gene Diagnostics of Particularly Dangerous Infectious Diseases Using Polymerase Chain Reaction with Hybridization-Fluorescent Registration of Results. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii[Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2017; 3:105-109. (In Russ.). DOI: 10.21055/0370-1069-2017-3-105-109
К настоящему времени полимеразная цепная реакция (ПЦР) является одним из наиболее совершенных диагностических методов молекулярной биологии и клинической лабораторной диагностики. Основными ее достоинствами являются высокая чувствительность, универсальность технологических процедур в виде использования единого набора оборудования, реактивов, подготовки проб и постановки анализа.
В настоящее время в ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» освоен выпуск зарегистрированных в установленном порядке наборов реагентов для индикации и идентификации возбудителей особо опасных инфекционных агентов методом ПЦР с электро-форетической и гибридизационно-флуоресцентной детекцией. При производстве препаратов с электро-форетическим учетом результатов технологическая схема состоит из пяти этапов: получение олигону-клеотидных праймеров (ОНП); препарата ПКО (положительного контрольного образца); приготовление компонентов набора; контроль готового препарата; маркировка, фасовка и упаковка комплектов набора.
При изготовлении наборов с учетом результатов в режиме реального времени необходим еще один дополнительный этап - получение зондов, меченых флуорофором и гасителем флуоресценции. Технология синтеза последних существенно отличается от классической схемы получения праймеров [5]. Одним из важных этапов в данном процессе является очистка модифицированных олигонуклеоти-дов, поскольку от этого напрямую зависит качество выпускаемого препарата [6].
технология синтеза праймеров используется в институте с 2003 г., тогда как синтез зондов до сих пор оставался не внедренным в производство. В связи с этим очевидна необходимость проведения работ по освоению технологии введения флуоресцентных меток в состав олигонуклеотида, оптимизации способов очистки модифицированных зондов и внедрения подобранных технологических схем в практику.
В качестве объекта для исследования представляется перспективным использование набора реагентов «Ген Yersinia pestis - идентификация», включающего в свой состав по два зонда, меченых флуо-рофорами FAM, R6G, ROX [1].
целью данной работы явилась оптимизация технологической схемы производства препарата для генной диагностики чумы с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, направленная на подбор условий синтеза и методов очистки входящих в состав набора олигонуклеотидных зондов, несущих метки флуорофор-6-карбоксифлуоресцеин (FAM) и гаситель флуоресценции Black Hole Quencher-1 (BHQ1), оценка их качества и внедрения усовершенствованной технологической линии в практику.
Материалы и методы
В качестве объекта исследований выбрали прай-
меры и зонд, входящие в состав набора реагентов «Ген Yersinia pestis идентификация-РГФ», и обеспечивающие амплификацию hmsH гена [1].
Синтез праймеров и зондов осуществляли в восьмиканальном синтезаторе ДНК ASM-800 (Биос-сет, Россия) твердофазным фосфитамидным методом с использованием стандартных коммерческих реагентов: амидофосфитных производных нуклео-зидов, нуклеозид-полимеров. Для получения зондов использовали 6-(3',6'-дипивалоилфлуореценил-6-карбоксамидо)-гексил-1-0-(2-цианоэтил)-^^-диизопропил)-фосфорамидит и 4'-(2-нитро-4-толуилдиазо)-2'-метокси-5'-метил-азобензен-4' '-^-этил-2-0-(4,4'-дитетокситритил))-К-этил-2-0-гликолат-CPG.
Праймеры и зонды синтезировали в масштабе 200 нмоль. Очистку синтезированных праймеров осуществляли методом обращенно-фазовой хроматографии на RP-картриджах (ChemGenes, США) на двухканальной системе очистки OPS-201 (Биоссет, Россия). После этого их переосаждали 6 % перхлоратом лития (Fluka, Швейцария) в ацетоне (Экрос, Россия), отмывали от солей ацетоном и подсушивали этоксиэтаном (Вектон, Россия). Очистку полученных зондов проводили либо с помощью электрофореза в 20 % полиакриламидном геле размером 20^20 или 8^10 см с последующей очисткой на RP-картриджах в полуавтоматическом режиме на системе 0PS-201 и вручную, либо только с RP-картриджами вручную, либо методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Для проведения ВЭЖХ использовали систему «Waters» c программным обеспечением «Breeze», включающую бинарный градиентный насос Waters 1525, ручной инжектор Rheodyne 7725i, нагреватель колонок Waters, двухволновой детектор Waters 2487, сканирующий программируемый флуоресцентный детектор Waters 2475, колонки Macherey-Nagel Nucleosil размером 250/4,6 мм с носителем С18, размером частиц 5 мкм и размером пор 300 Á. Подвижная фаза: А: 0,1 М водный раствор ацетата аммония; B: 50 % ацетонитрил в 0,1 М водном растворе ацетата аммония. Градиент: с А/В (70:30) до А/В (30:70) за 30 мин. Скорость потока: 1 мл/мин.
качество синтезированных классических оли-гонуклеотидов проверяли методом электрофореза в денатурирующих условиях (с 7 М мочевиной) в 20 % ПААГ. В качестве лидирующего красителя использовали смесь 0,05 % бромфенолового синего и 0,05 % ксиленцианола (Диа-М, Россия) в 95 % водном растворе формамида (Merck, Германия) с 10 мМ NaOH (Хеликон, Россия). Для окрашивания полос и визуализации результата использовали 0,75 % Stains-all (Serva, Германия) в 50 % водном растворе формамида.
Оптическую плотность праймеров и зондов определяли при 260 нм на спектрофотометре СФ-56 (ЛОМО, Россия). Концентрацию олигонуклеоти-дов и зондов рассчитывали с помощью программы «Олиго Кальк» [2].
Аналитическую и специфическую активность праймеров и зондов проверяли с использованием реагентов, входящих в состав набора реагентов «Ген Yersinia pestis идентификация-РГФ». Для исследования готовили бактериальные суспензии штамма Y pestis C-624 в 0,9 % растворе натрия хлористого до конечной концентрации 1103 м.к./мл. Обеззараживание бактериальных суспензий проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение ДНК осуществляли методом нуклеосорбции с использованием коммерческого набора «ДНК-сорб-В» («ИнтерЛабСервис», Россия). Работу проводили в соответствии с инструкцией к препарату. Полученную ДНК изучали в ПЦР с реакционной смесью, приготовленной по ТУ 9398-034-01898109-2011.
термоциклирование осуществляли в приборах «RotorGene 3000», «RotorGene 6000» («Corbett Life Science», Австралия) и «RotorGene Q» QIAGEN (Германия) по следующей программе: предварительная денатурация при 95 °С в течение 5 мин, затем 10 циклов, включающих 3 шага по 30 с каждый: денатурация при 95 °С, отжиг при 60 °С и синтез при 72 °С; затем 35 циклов по 20 с каждый: денатурация при 95 °С, отжиг при 56 °С и синтез при 72 °С. Уровень флуоресценции определяли при 56 °С (во втором блоке циклирования) по каналам FAM/Green, JOE/Yellow, ROX/Orange. Для учета флуоресценции активировали функцию «Slope Correct»/«Коррек. уклона», функция «More settings»/«Outlier Removal»/«Устранение выбросов» - 5 %, значения Threshold/Порог - 0,05. Полученные данные обрабатывали с применением стандартных статистических методов [3].
результаты и обсуждение
Для исследования синтезировали зонд, компле-
ментарный нуклеотидной последовательности hmsH гена возбудителя чумы, длиной 24 нуклеотида, несущий на 5ч-конце 6-карбоксифлуоресцеин (FAM), а на 3-конце - Black Hole Quencher-1 (BHQ1) [1].
В ходе ряда экспериментов установлено, что для синтеза зондов в традиционном реакционном цикле амидофосфитного синтеза олигонуклеотидов время конденсации необходимо увеличить с 1 до 6 мин для того, чтобы максимально обеспечить присоединение флуорофора 6-карбоксифлуоресцеина к олигонуклеотидной цепи, а для аммонолиза использовать концентрированный водный раствор аммиака при температуре 45 °С в течение 12 ч.
Очистка зондов от примесей является необходимым условием для освобождения от неполноценных олигонуклеотидов без флуорофора и гасителя, разрушившихся в ходе синтетических реакций и используемых при этом растворителей, присутствие которых в ПЦР может искажать результаты вплоть до полного ингибирования. Поэтому на следующем этапе нашей работы была проведена оценка эффективности различных методов очистки полученных меченых олигонуклеотидов (таблица).
В результате проведенных экспериментов установлено, что наибольший количественный выход зонда отмечен при использовании для его очистки RP-картриджей в ручном режиме - (27,9±0,81) ОЕ.
Практически одинаковое количество зонда получено при проведении электрофореза в денатурирующих условиях в 20 % полиакриламидном геле размером 8*10 см с 7 М мочевиной с дальнейшей очисткой на RP-картриджах в полуавтоматическом и ручном режиме: (4,5±0,92) и (4,6±1,18) ОЕ соответственно. При использовании полиакриламидного геля размером 20*20 см увеличение выхода зонда не отмечено: (6,8±1,36) и (3,31±0,87) ОЕ соответственно. Более того, при очистке олигонуклеотидов после электрофореза на геле размером 20*20 см с помощью RP-картриджей в ручном режиме, их ко-
Наименование зонда Характеристика метода Тип буфера Тип элюата
hms_p1 Электрофорез в денатурирующих условиях (7 М мочевина) в 20 % полиакриламидном геле (20*20 см) с дальнейшей очисткой на RP-карт-риджах, с помощью системы OPS-201 (в полуавтоматическом режиме) 0,1 М водный раствор ацетата аммония 30 % водный раствор ацетонитрила
hms_p2 Электрофорез в денатурирующих условиях (7 М мочевина) в 20 % полиакриламидном геле (20*20 см) с дальнейшей очисткой на RP-карт-риджах (в ручном режиме) 0,1 М водный раствор ацетата аммония 30 % водный раствор ацетонитрила
hms_p3 Электрофорез в денатурирующих условиях (7 М мочевина) 20 % полиакриламидном геле (8*10 см) с дальнейшей очисткой на RP-картриджах, с помощью системы OPS-201 (в полуавтоматическом режиме) 0,1 М водный раствор ацетата аммония 30 % водный раствор ацетонитрила
hms_p4 Электрофорез в денатурирующих условиях (7 М мочевина) 20 % полиакриламидном геле (8*10 см) с дальнейшей очисткой на RP-картриджах (в ручном режиме) 0,1 М водный раствор ацетата аммония 30 % водный раствор ацетонитрила
hms_p5 Очистка на RP-картриджах (в ручном режиме) водный раствор 2 М триэти-ламиноацетата и 0,1 М триэ-тиламиноацетат в 8 % водном растворе ацетонитрила 20 % водный раствор ацетонитрила
hms_p6 Высокоэффективная жидкостная хроматография «Waters» на колонке Macherey-Nagel Nucleosil размером 250/4,6 мм с носителем С18 с размером частиц 5 мкм и размером пор 300 А. Сбор фракций в течение 2,5 мин 0,1 М водный раствор ацетата аммония и 50 % ацетонитрил в 0,1 М водном растворе ацетата аммония 0,1 М водный раствор ацетата аммония и 50 % ацетонитрил в 0,1 М водном растворе ацетата аммония
использованные в работе методы очистки олигонуклеотидов, меченных флуорофорами FAM и BHQ1
Рис. 1. Очистка зонда hms_p6 методом ВЭЖХ:
1 - пик выхода зонда меченного FAM и BHQ1
личество было в два раза меньше, чем при работе в полуавтоматическом режиме.
Применение ВЭЖХ позволило получить до (7,7±0,68) ОЕ зонда. Установлено, что элюция зонда отмечалась на 22-й минуте (рис. 1).
На следующем этапе экспериментов изучены аналитические свойства зондов. С этой целью готовили реакционные смеси, содержащие различные концентрации зонда: от 4 до 1 пмоль и праймеров -8 и 6 пмоль. Для анализа использовали препараты ДНК, выделенные из бактериальных суспензий штамма Y pestis C-624 (hmsH+) с концентрацией 1106-1103 м.к./мл. С полученной ДНК проводили ПЦР на амплификаторах типа «RotorGene» (3000, 6000, Q) (рис. 2).
Установлено, что во всех случаях, вне зависимости от способа очистки зондов, чувствительность реакции 1103 м.к./мл достигается при внесении в реакцию 6 пмоль праймеров и 3 пмоль зонда, что в полной мере соответствует требованиям ТУ 9398034-01898109-2011 на «Набор реагентов для ускоренной идентификации штаммов Yersinia pestis методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени (Ген Yersinia pestis идентификация-РГФ)».
Максимальное накопление флуоресценции в пробирках - до 0,4 ед. - отмечено при проведении ПЦР с зондами hms_p6, hms_p2 и hms_p4, очистку которых проводили с помощью ВЭЖХ, в первом случае, и электрофореза в денатурирующих условиях в 20 % полиакриламидном геле с 7 М мочевиной и на RP-картриджах в ручном режиме. При этом на эффективность очистки не влияли размеры используе-
мого геля (20^20 или 8x10 см). Применение зондов hms_p1 и hms_p3, очистка которых осуществлялась методом электрофореза в денатурирующих условиях в 20 % полиакриламидном геле с 7 М мочевиной и на RP-картриджах в полуавтоматическом режиме, продемонстрировало меньший уровень флуоресцентного сигнала - до 0,35 ед. В ПЦР с зондами hms_p5, очистку которых проводили только с помощью RP-картриджей, интенсивность флуоресценции составляла не более 0,25 ед.
Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования для очистки зондов, меченых флуоресцентными метками FAM и BHQ1, либо системы ВЭЖХ, либо комплексной схемы, предусматривающей проведение электрофореза в денатурирующих условиях в 20 % полиакриламид-ном геле с 7 М мочевиной и последующей очисткой на RP-картриджах в ручном режиме.
В процессе выполнения исследований, посвященных изучению качества модифицированных олигонуклеотидов, нами отмечалась особенность детекции их сигнала в диапазоне 510-555 нм. Из литературных источников известно, что карбоксиф-луоресцеин имеет относительно широкий спектр 500-550 нм [4], и его флуоресценция может детектироваться по «JOE/Yellow» каналу. В проведенных исследованиях нами установлено, что присутствие в реакционной смеси одного зонда, имеющего флуо-рофор FAM и гаситель BHQ1, сигнал с усилением (Gain) равным 10 может слабо детектироваться по «JOE/Yellow» каналу, но при добавлении второго зонда, содержащего флуорофор R6G, флуоресценция в этой части спектра не отмечается. Результаты экспериментов свидетельствуют о возможности при-
t* t ^—~ <K сх 0)
Cil // •JS
iu / ' / / s / /// 5" / ' |///
Г ГИ»«Ц / 1 /4 / 1" В // у/ г 01 / ///
s to м » a x и 0* 1 м и » а и к сх» » >0 « » 25 » » _а*_!
А Б В
12
2 / / / / / 1 1 i" it) / i / / / / / / */ / / s 4 Г I /1 / • /
nam 0.1 / / s /
1 S И t$ » Я X к _а*_ s « is л a * и с*» 0 $ to i$ го a x x с*.
Г Д Е
Рис. 2. Результаты амплификации hmsH гена с праймерами и зондами, очищенными различными способами:
1 - положительный контроль; 2 - Y. pestis С-624 (1106 м.к./мл); 5 - Т pestis С-624 (1 105 м.к./мл); 4 - Т. pestis С-624 (1 104 м.к./мл); 5 - Т pestis С-624 (1103 м.к./мл); 6 - отрицательный контроль. А - 11Ш8_р1 (электрофорез в геле размером 20x20 см и на RP-картриджах в полуавтоматическом режиме); Б - hms_р2 (электрофорез в геле размером 20x20 см и на RP-картриджах в ручную); В - hms_p3 (электрофорез в геле размером 8x10 см и на RP-картриджах в полуавтоматическом режиме); Г - hms_p4 (электрофорез в геле размером 8x10 см и на RP-картриджах в ручную); Д - hms_p5 (на RP-картриджах в ручную); Е - hms_p6 (ВЭЖХ)
менения синтезированных модифицированных олигонуклеотидов в составе наборов для постановки мультиплексной ПЦР-РВ.
Для изучения активности в отдаленных сроках наблюдения зонды помещали в морозильную камеру при температуре минус 20 °С. Затем, в течение двух лет с интервалом 3 месяца, образцы изучали в ПЦР-РВ. Специфическую и аналитическую активность модифицированных олигонуклеотидов проверяли посредством их использования в составе коммерческого препарата «Ген Yersinia pestis идентификация-РГФ» с ДНК, выделенной из бактериальных суспензий штамма Y pestis C-624 (hmsH+). За время наблюдения (2 года) зонды сохраняли свою аналитическую чувствительность, что превышает срок хранения препарата, составляющего 6 мес.
Таким образом, в РосНИПЧИ «Микроб» усовершенствована технология получения препарата для генной диагностики чумы с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов за счет оптимизации синтеза и подбора методов очистки оли-гонуклеотидных зондов, несущих флуорофор-6-карбоксифлуоресцеин (FAM) и гаситель флуоресценции Black Hole Quencher-1 (BHQ1). Определены их специфические и аналитические характеристики, соответствующие требованиям ТУ 9398-03401898109-2011. Показана целесообразность использования для очистки таких олигонуклеотидов, либо комплекса ВЭЖХ, либо электрофореза в 20 % полиакриламидном геле с 7 М мочевиной и последующей хроматографией на RP-картриджах в ручном режиме. Используемые методические подходы получения зондов могут применяться для синтеза других олиго-нуклеотидов, несущих в своей структуре молекулы красителя и гасителя флуоресценции.
внедрение оптимизированной технологической схемы производства препаратов для генной индикации и идентификации особо опасных патогенов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, позволит сократить сроки их изготовления на 50 %, отказаться от приобретения зондов в сторонних организациях и существенно снизить финансовые затраты на 66 %.
конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Куклев В.Е., Осина Н.А., Бугоркова Т.В., Кутырев В.В. Набор и способ для ускоренной идентификации чумного микроба с одновременной дифференциацией вирулентных и авиру-лентных штаммов Y. pestis, определением их плазмидного профиля. Патент РФ № 2473701. 2013.Бюлл. 3 от 27.01.2013.
2. Олиго Кальк: Программа для расчета свойств олигонуклеотидов (праймеров). Интернет-портал биологического факультета Белорусского Государственного Университета. http:// bio.bsu.by/molbiol/index.php?pg=oligocalc (дата обращения 24.04.2017).
3. Поллард Дж. Справочник по вычислительным методам статистики. М.: Финансы и статистика; 1982. 344 с.
4. Ke G., Zhu Z., Wang W., Zou Y., Guan Z., Jia S., Zhang H., Wu X., Yang C.J. A Cell-Sunace-Anchored Ratiometric Fluorescent Probe for EXtracellular pH Sensing. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2014; 6(17):15329-34. DOI: 10.1021/am503818n.
5. Mullah B., Livak K., Andrus A., Kenney P. Efficient synthesis of double dye-labeled oligodeoxyribonucleotide probes and their application in a real time PCR assay. Nucleic Acids Res. 1998; 26(4):1026-31. DOI: 10.1093/nar/26.4.1026.
6. Tatarinova O.N., Lukyanova T.N., Zaitseva M.A., Veremeev K.Y., Karpov V.A., Chuvilin A.N., Petrunin D.D., Pozmogova G.E. Significance of Methods for Purification of Oligodeoxyribonucleotide Probes for the Efficiency of Gene Diagnosis by Real-Time PCR. Bull. Exp. Biol. Med. 2008; 145(3):312-6. DOI: 10.1007/s10517-008-0078-6.
References
1. Kuklev V.E., Osina N.A., Bugorkova T.V., Kutyrev V. V. [The kit and methodology for rapid identification of plague microbe with simultaneous differentiation between virulent and avirulent Y. pestis strains, and specification oftheir plasmid profile]. RF Patent No 2473701. 2013. Bulletin N 3 dated January 27, 2013.
2. [Oligo Calc: software for calculation of oligonucleotide properties (primers)]. Internet-portal of the Biology Department, Belorussian State University. (cited 24 Apr 2017). Available from: http://bio.bsu.by/molbiol/ index.php?pg=oligocalc.
3. Pollard G. [Reference Book on Statistical Computational Methods]. M.; 1982. 344 p.
4. Ke G., Zhu Z., Wang W., Zou Y., Guan Z., Jia S., Zhang H., Wu X., Yang C.J. A Cell-Surface-Anchored Ratiometric Fluorescent Probe for Extracellular pH Sensing. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2014; 6(17):15329-34. DOI: 10.1021/am503818n.
5. Mullah B., Livak K., Andrus A., Kenney P. Efficient synthesis of double dye-labeled oligodeoxyribonucleotide probes and their application in a real time PCR assay. Nucleic Acids Res. 1998; 26(4):1026-31. DOI: 10.1093/nar/26.4.1026.
6. Tatarinova O.N., Lukyanova T.N., Zaitseva M.A., Veremeev K.Y., Karpov V.A., Chuvilin A.N., Petrunin D.D., Pozmogova G.E. Significance of Methods for Purification of Oligodeoxyribonucleotide Probes for the Efficiency of Gene Diagnosis by Real-Time PCR. Bull. Exp. Biol. Med. 2008; 145(3):312-6. DOI: 10.1007/s10517-008-0078-6.
Authors:
Stepanov A.V., Osina N.A., Mayorov N.V. Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe". 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation. E-mail: rusrapi@microbe.ru.
об авторах:
Степанов А.В., Осина Н.А., Майоров Н.В. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: rusrapi@ microbe.ru.
Поступила 23.05.17.
