CC BY
141
ОБЗОРЫ
Экспрессия генов, трансфицированных в мезенхимные стволовые клетки человека
С А. Смирнихина
Медико-генетический научный центр РАМН, Москва
Expression of genes transfected in human mesenchymal stem cells
SA. Smirnikhina
Research Centre for Medical Genetics of RAMS, Moscow
В статье представлен обзор о способах трансфекции МСК и их эффективности. Проведен анализ экспрессии трансфицированных генов при стабильной и транзиторной трансфекции. Указаны возможные причины снижения экспрессия трансгенов и пути ее повышения.
Ключевые слова: деацетилирование гистонов, мезенхимные стволовые клетки, метилирование ДНК, трансфекция, экспрессия, 5-азацитидин.
The article provides review about transfection methods of mesenchymal stem cells and their efficiency. The expression of tranfected genes by stable and transient transfection was analyzed. The possible decrease reasons of transgene expression level and ways to its increasing were shown.
Keywords: histone deacetylation, mesenchymal stem cells, DNA methylation, transfection, expression, 5-azacytidine.
Клеточная терапия с использованием мультипо-тентных мезенхимных стволовых клеток человека (МСК) считается одним из наиболее перспективных направлений медицины. За последние 10 лет опубликовано более 10 тыс. статей с описанием морфологии, особенностей пролиферации, дифференцировки и успешном применении для лечения болезней как самих МСК, так и их производных in vivo (на животных и у людей). МСК сейчас используют практически во всех областях медицины: от пластической хирургии до возмещения больших дефектов тканей и органов [1—4].
Использование МСК в регенеративной медицине неслучайно. Эти клетки есть у каждого человека, и их достаточно просто выделить и культивировать. МСК содержатся в костном мозге, жировой ткани, пуповинной крови, а также, по многочисленным свидетельствам, во многих других органах. МСК из всех этих источников характеризуются общими чертами: адгезивность, экспрессия определенного спектра поверхностных маркеров и способность к дифферен-цировке в несколько клеточных линий [5—8]. В последнее время источником МСК считают жировую ткань (ЖТ), потому что из нее можно выделить намного больше клеток -1 г жира содержит 5x103 МСК, что в 500 раз больше чем в 1 г костного мозга [9]. По другим данным, клеток, получаемых из ЖТ, боль-
x
васкулярной фракции [10], в которой 5,1% МСК, то x
получения материала является минимально инвазивной и осуществляется под местной анестезией.
При аллотрансплантации МСК относительно не-иммуногенны и даже отмечено, что они могут незначительно подавлять иммунный ответ реципиента, что позволяет им длительно выживать после введения для оказания терапевтического эффекта [12]. Более
того, у МСК описано еще одно свойство, позволяющее широко применять их в клеточной терапии: при парентеральном введении МСК стремятся к очагу некоторых видов опухолей [13—17].
Помимо всех выше перечисленных достоинств, МСК экспрессируют широкий спектр цитокинов и факторов роста, которые оказывают паракринные эффекты: осуществляют иммуномодуляцию и трофику [18], стимулируют гемопоэз in vitro [19, 20]. Также есть данные, что МСК оказывают проангио-генный эффект, причем у МСК, выделенных из жировой ткани, он выше, чем у МСК из костного мозга [21]. Кроме того, МСК усиливают неоангиогенез за счет дифференцировки в эндотелиальные клетки и выделения множества ангиогенных факторов, таких как VEGF, bFGF и ангиопоэтин-1 [22—24].
Трансфекция МСК
Несмотря на положительный терапевтический эффект МСК, введенных в организм, всегда желательно его усилить. Одним из методов усиления терапевтического эффекта является трансфекция, то есть введение в клетку генетического материала, способного экспрессироваться, таким образом, трансфекция необходима как элемент генной и клеточной терапии.
Трансфекция известна еще с середины 60-х годов; тогда ее начали применять для трансформации бактериальных клеток [25, 26]. В это же время стали изучать мультипотентные клетки из костного мозга [27]. Тогда их рассматривали как прогениторные гемопоэтические клетки, поэтому в литературе можно встретить публикации по трансфекции этих клеток. Трансфекция же мезенхимных стволовых клеток началась лишь в конце 90-х [28, 29].
Существуют три основные задачи, которые можно достичь путем трансфекции МСК: добиться дифференцировки МСК в определенные клетки; получить
e-mail:smirnikhinas@gmail.com
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
культуру с гиперэкспрессией какого-либо полезного для лечения заболевания гена (фактора роста, ангиогенеза, цитокина и т.п.); обеспечить экспрессию генов, повышающих выживаемость МСК, трансплантируемых зачастую в поврежденные, затронутые воспалением ткани, находящиеся в состоянии гипоксии.
Наиболее применимой является трансфекция МСК с целью дальнейшей дифференцировки их в определенную линию. Дифференцировки можно добиться и путем простого культивирования с определенными факторами, однако при трансфекции МСК дифференцируются быстрее и более эффективно. Кроме того, генетическая модификация позволяет дифференцировать клетки в такие узкоспециализированные линии клеток, которые невозможно получить путем культивирования с различными химическими соединениями.
Описано много примеров дифференцировки МСК in vitro, при которой получают культуру клеток с заданными свойствами, пригодных для трансплантации в поврежденный орган [30—32]. В то же время, есть данные и о дифференцировке МСК in vivo. Например, после трансфекции МСК геном Osx (остерикса), их трансплантируют лабораторным животным. Диффе-ренцировка происходит уже in vivo. Указывается на 85% эффективность такого подхода для лечения повреждений свода черепа [33].
С помощью трансфекции SF-1 (стероидогенный фактор 1) можно дифференцировать МСК в линию клеток, продуцирующих стероидные гормоны, для заместительной гормональной терапии при стероидной недостаточности [34]. Для лечения ишемической болезни сердца также можно применять трансфицированные МСК. При трансфекции их геном EFNB2 ГэфринБ2) клетки дифференцируются в эндотелиальные клетки сосудов, которые можно использовать в терапии [35]. Также при помощи трансфекции генами TERT (обратной транскриптазы теломераза) и Myocd Гмышиного миокардина А) в МСК можно добиться их дифференцировки в сокращающиеся кардиомиоциты [36]. Есть данные о том, что МСК с помощью трансфекции можно дифференцировать в клетки гиалино-подобного хряща iTGF-betal — трансформирующий фактор роста бета 1) [37], адипоциты (неспецифические siRNA) [38] и некоторые другие типы клеток.
Трансфекция МСК может проводиться с целью гиперэкспрессии определенных факторов. Так, трансфицированные геном Л/-/0-7 (гем-оксигеназы-1) МСК вводили крысам с постинфарктными изменениями сердца. Показано, что такие клетки лучше выживали, стимулировали экспрессию различных факторов роста и оказывали больший терапевтический эффект, чем введенные неизмененные МСК [39]. Аналогичное исследование проведено в Китае. Крысам с инфарктом миокарда вводили МСК, трансфицированные геном VEGF165 (фактор роста эндотелия сосудов 165). Такие клетки стимулировали ангиогенез и ми-огенез больше, чем нетрансфицированные МСК [40]. Для лечения респираторного дистресс-синдрома успешно применяли трансплантацию МСК, трансфицированных геном ANGPT1 (ангиопоэтина 1). Такие клетки оказывают, прежде всего, противовоспалительный эффект. В этом исследовании, как и в предыдущих, показано, что трансфицированные МСК эффективнее нетрансфицированных [41].
Еще одним важным направлением в лечении заболеваний является создание инсулин-продуцирую-щих клеток. Для этого МСК трансфицируют геном hPPI
(препроинсулина) и через 3 недели получают культуру, синтезирующую инсулин и С-пептид, которую можно применять для лечения сахарного диабета [42].
Использование неизмененных МСК ограничено также временем их жизни в поврежденном органе. Показано, что МСК с трансфицированным геном Вс1-2 (антиапоптотический белок) показывают лучшую выживаемость, реваскуляризацию и улучшение работы сердца при постинфарктной дисфункции левого желудочка [43].
Таким образом, трансфекция МСК является важным и зачастую необходимым элементом генной и клеточной терапии. Доказано, что эффективность терапии трансфицированными МСК намного выше, чем при использовании неизмененных МСК. Кроме того, получить некоторые линии клеток можно только с использованием трансфекции. Анализ литературы показывает, что трансфекция МСК широко проверена и возможность ее не вызывает сомнений.
Наиболее эффективными «инструментами» доставки целевых генов являются векторы на основе лентивиру-сов. Такие векторы используются с середины 90-х годов [44, 45] с целью стабильной трансфекции. Эффективность и длительность персистирования вектора в клетке очень высока, благодаря свойству ленти-вируса встраиваться в геном [46]. Однако встраивание само по себе является опасным, так как может приводить к инсерционному мутагенезу [47]. Интеграция в геном происходит хаотично на различных хромосомах. Но при этом в одном из исследований было показано, что из 28 различных вставок, картированных в человеческом геноме, 24 были обнаружены в кодирующей области ранее идентифицированных генов [48].
Менее эффективными, но тоже часто применяемыми векторами для трансфекции являются другие типы ретровирусных векторов. Они используются реже, потому что обладают всеми отрицательными качествами лентивирусов (встраивание в геном, длительная персистенция в клетке), а эффективность трансфекции с их использованием ниже [49—52].
Некоторые вирусные методики позволяют проводить транзиторную трансфекцию. Одним из примеров является аденовирусный вектор. Он отличается высокой эффективностью трансфекции для разных типов клеток и генов разной величины [53]. Для рекомбинантного аденовирусного вектора показано, что генетическая конструкция с целевым геном функционирует в клетке в виде эписомы. Это означает, что во время деления клетки такой ген не репродуцируется. Этот вектор обладает высокой эффективностью трансфекции и не встраивается в геном, и поэтому является самым используемым в настоящее время. Однако аденовирусные векторы очень иммуногенны [54] и могут даже приводить к тяжелому комбинированному иммунодефициту [55].
При использовании вирусных векторов существует большой риск из-за их потенциальной онкогеннос-ти, токсичности и иммуногенности [56—61].
Суммируя данные, можно отметить, что вирусные векторы являются эффективными средствами для трансфекции целевого гена в клетки. Однако побочные эффекты их применения столь существенны, что необходимо использовать другие, более безопасные методы.
В норме невирусные векторы функционируют экстрахромосомно и, таким образом, при их использовании уменьшается риск вставки в геном и инсерци-
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
онного мутагенеза. Они также не вызывают иммунологических реакций, которые характерны для вирусных векторов. Однако их самый большой недостаток — низкая эффективность трансфекции по сравнению с вирусными системами [54].
Обычно используются методы на основе липофек-ции [62, 63], электропорации [64] и нуклеофекции [65]. Однако их эффективность даже при отлаженной методике ниже, чем у вирусных векторов. Более того, из-за своей токсичности данные методы зачастую приводят к массивной клеточной гибели [66, 67].
Липофекция является наиболее простой методикой, но самой токсичной для клеток и наименее эффективной [67]. Электропорация требует тщательного подбора условий для разных типов клеток и сопряжена с достаточно большой гибелью клеток, хотя по эффективности этот метод значительно выше, чем липофекция [68—70]. Относительно недавно был предложен оптимизированный метод электропорации непосредственно в ядро клетки — нуклеофекция [71, 72]. Все чаще для трансфекции МСК применяют именно этот метод, потому что его эффективность может достигать 90%, что сопоставимо лишь с вирусными векторами [65, 73].
Помимо перечисленных выше невирусных методов трансфекции применяются также в качестве векторов искусственные хромосомы [74—77], наносферы [78], метод электропорации единичной клетки [79] и другие.
Выбор метода трансфекции определяется задачами исследования. Если трансфицированные клетки предполагается использовать для терапии, то наименее предпочтителен метод липофекции, так как липо-фектные конструкции очень токсичны. Однако его с успехом можно применять для исследовательских целей, так как этот метод самый простой. Нуклеофекция, так же как и электропорация, подходит как для исследовательских целей, так и для терапевтических.
Возможность трансфекции МСК подтверждается множеством исследований. Клетки можно трансфицировать разными генами. Условно их можно разделить на гены-репортеры и целевые гены. При использовании первых, экспрессию можно увидеть чаще всего на нефиксированных живых клетках с помощью флюоресцентного микроскопа или специфической окраски. К ним относятся гены 6ЯР, еБЕР, УБР, Овйес!, 1ас! [80, 78, 80, 81]. Такие гены служат лишь моделью для оптимизации протокола трансфекции и дальнейшего ведения культуры. Чаще всего гены-репортеры используют как первый этап, после чего переходят на целевые гены. Это могут быть различные факторы дифференцировки, факторы ангиогенеза и многие другие гены (см. выше).
С помощью нуклеофекции успешно введена кДНК гена зеЯ/ EБFRvlll (ген кодирующий антитела эсРу к продукту гена ЕБЕ^НП в МСК человека. Трансфицированные клетки экспрессировали на своей поверхности одноцепочечные антитела (эсЕу) к продукту гена ЕБР^Ш (рецептор эпидермального фактора роста), который регистрируется как минимум у половины опухолей. Создав клеточную культуру с антителом к данному гену, ученые стремились разработать таргетную терапию онкологических заболеваний путем миграции МСК к клеткам опухоли [82]. Успешно трансфицированы МСК геном \/ЕБЕ165. Показано, что экспрессия этого гена в МСК достоверно увеличилась после трансфекции [83].
С помощью электропорации в МСК можно ввести ген ЕРО (эритропоэтина) и индуцировать дифферен-цировку МСК в эритроидные колонии [84].
Нуклеофекцией удалось стимулировать МСК к диф-ференцировке в остеогенном направлении. При трансфекции генами hBMP-2 и hBMP-9 (костного морфогенетического белка) МСК наблюдали повышенное отложение кальция в культурах, а при трансплантации лабораторным мышам клетки образовывали эктопические участки костей [85].
Как видно из этого раздела, трансфекция МСК проходит успешно. Для этого разработаны различные методики. Однако трансфицированные клетки апробированы пока только в исследованиях на животных.
Анализ функции трансфицированных генов
Существует 2 вида трансфекции: стабильная (длительная) и транзиторная (транзиентная, временная). Основное их отличие состоит в том, что при стабильной трансфекции длительность гиперэкспрессии измеряется месяцами (до полугода), а при транзиторной трансфекции гиперэкспрессия трансгена существует недолго — от 7 до 21 дней (в зависимости от типа клеток, генетической конструкции и метода трансфекции).
Meyerrose et al. показали, что при трансфекции МСК ретровирусным носителем экспрессия целевого гена длится до 75 дней [86]. При использовании лентивирусного вектора с еБЕР количество экспрессирующих клеток не уменьшилось даже через 5,5 мес. после трансфекции (на 3-й день было 76% позитивных клеток, через 5,5 мес. — 87,9%). Экспрессия, определенная измерением флюоресценции, за это время лишь незначительно снизилась [87]. Данные примеры отражают стабильную трансфекцию МСК.
Как уже было отмечено ранее, аденовирусный вектор обеспечивает временную трансфекцию. При введении вектора с геном I/ЕБЕ165 в МСК пик экспрессии пришелся на 7-й день (35%), длительность же составила 14 дней. [40]. При использовании вектора с геном еБЕР пик флюоресцентных клеток пришелся на 4-й день после трансфекции (65%). Начиная с 16 и до 24 дня уровень GFP-позитивных клеток сильно упал (до 2%), к 32-му дню только в 0,5% клеток экспрессировался ген БЕР [88]. Palmer с коллегами наблюдал 80% эффективность и длительность экспрессии 21 день с использованием аденовирусного вектора с геном ТБЕф1 (хондрогенного фактора) [89]. При трансфекции гена HSVI-tk (тимидинкиназы) в МСК пик трансфекции пришелся на 24 ч после нее, после чего начал медленно снижаться. Через месяц экспрессия трансгена не отличалась от контрольной нетрансфицированной группы МСК [90].
Липофекция, как и аденовирусный вектор, позволяет лишь временно трансфицировать клетки. Длительность экспрессии при этом методе примерно такая же. В исследовании Yang et al. МСК трансфицировали еБЕР и геном HIE-1— (фактором индуцируемом гипоксией). Слабую флюоресценцию увидели через 12 ч, через 24 ч появилась интенсивная флюоресценция, пик ее пришелся на 72 ч, длилась интенсивная флюоресценция 1 нед., после чего стала снижаться [62]. При использовании аналогичной плазмиды другие исследователи наблюдали флюоресценцию 14 дней [80]. В отдельных работах продемонстрирована возможность получения с помощью липофекции стабильно трансфицированных МСК. В стабильно трансфицированных МСК (линия HFCL) конструкцией
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
с колониестимулирующим фактором (р1ПЕБ1пео/ ИОМ-СБР) оценили интеграцию, транскрипцию и экспрессию трансгена, подтвердив не только успешную стабильную трансфекцию, но и продукцию биологически активного белка в клеточном супернатанте [91 ].
При использовании нуклеофектора отмечено, что пик экспрессии приходится на 4-й день после
трансфекции, далее наблюдается медленное снижение, а после 14 дня резкое снижение экспрессии до 21 дня [92]. В другом исследовании с геном БРР показано, что даже после сортировки трансфицированных клеток через 2 нед. только 25% экспрессируют ген-репортер, а через 3 нед. — 10% [69].
Тип трансфекции помимо генетической конструкции определяется еще и наличием селекции или сортировки. Сортировку проводят с использованием специальных приборов — сортеров. При этом отбираются только трансфицированные клетки, далее такую линию культивируют. Селекцию же проводят при помощи антибиотика (например, 0418), к которому невосприимчивы клетки с плазмидой, несущей ген устойчивости. При этом клетки без генетической конструкции погибают. Эти методы позволяют добиваться стабильной трансфекции даже при использовании плазмид [93].
У каждого вида трансфекции есть свои плюсы и минусы. Так, для стабильной трансфекции плюсом является то, что можно создать клеточную культуру, стабильно экспрессирующую какой-либо фактор. После трансплантации клеток это позволит в течение длительного времени рассчитывать на терапевтический эффект. Однако, длительная «работа» трансплантата в организме реципиента может рассматриваться и как отрицательный момент, так как такие клетки хуже поддаются контролю. Поэтому транзиторная трансфекция, несмотря на короткий период гиперэкспрессии трансгена, более предпочтительна, так как позволяет легче управлять элиминацией из трансфицированных клеток. Кроме того, в ряде случаев, например при направленной дифференцировке МСК, необходима лишь кратковременная экспрессия трансгена, которая должна быть прекращена для успешного применения полученных клеток.
Влияние трансфекции на состояние стволовых
клеток (морфология, пролиферация]
Как отмечалось ранее, трансплантированные МСК выполняют важную паракринную функцию, стимулируя выработку факторов роста, ангиогенеза, интерлейкинов. Поэтому важно, чтобы после трансфекции МСК сохраняли свои свойства, морфологию и способность к пролиферации и дифференцировке.
Для лентивирусной трансфекции показано, что она не влияет на дифференцировочный потенциал МСК [50]. При использовании ретровирусного вектора также доказано, что МСК сохраняют свою способность к дифференцировке, иммунофенотип, миграционные возможности и плюорипотентность [86, 94]. Аденовирусные векторы также не влияют на жизнеспособность и дифференцировочный потенциал МСК [88, 95].
В отношении химической трансфекции ситуация не такая благоприятная: выше уже отмечалась токсичность липофекции. Так, при использовании Уро-1есЬатте2000 отмечено значительное изменение морфологии МСК: клетки становились больше в размерах, появлялись видимые везикулы в цитоплазме. Также отмечалась значительная гибель МСК по срав-
нению с нетрансфицированным контролем. Использование этого реактива ведет к значительному снижению пролиферации и адипогенного потенциала МСК. Более того, ирс^ес£апшпе2000 и иро!есЫп приводят к снижению колониеформирующей способности МСК. В отличие от них, Ридепе не ведет ни к каким изменениям в МСК [67]. По другим данным липофекция не влияет на пролиферацию МСК [62].
При использовании электропорации не отмечено ее влияние на клеточный рост, снижение дифферен-цировочного потенциала и изменение иммунофенотипа [67]. При нуклеофекции гибель МСК не увеличивается [65].
Как уже отмечалось, низкая эффективность и длительность трансфекции требует проведения селекции антибиотиками и увеличения времени культивирования или сортировки, а это может привести к потере стволовости [51, 96].
Кроме метода трансфекции, есть зависимость и от того, чем трансфицируют МСК. Так, показано, что при трансфекции БРР меняется морфология МСК. Наблюдается 2 типа клеток: мелкие фибробластоподобные и большие полигональные. При низких дозах БРР в культуре присутствует только один тип — полигональные клетки [89]. Это важно иметь в виду, потому что БРР, как уже упоминалось, используется зачастую для отработки протокола трансфекции и культивирования.
Подводя итог по влиянию трансфекции на состояние стволовых клеток, следует отметить, что липофекция не только токсична для МСК и вызывает их массовую гибель, но и способна менять их свойства и влиять на пролиферацию. Для применения в терапевтических целях лучше выбирать вирусные методики или на основе электропорации.
Механизмы регуляции экспрессии
трансфицированных генов
Как видно из раздела по анализу функции трансфицированных генов, экспрессия при транзиторной трансфекции падает. Это логично, так как генетическая конструкция не встраивается в геном и, с одной стороны, при делении клетки не дуплицируется, то есть снижается ее относительное количество, с другой стороны, она элиминируется за счет внутриклеточной деградации или выбрасывается из клетки. Однако существуют данные о том, что эпигенетические механизмы регуляции экспрессии также являются немаловажным звеном в сайленсинге трансфицированных генов.
Сайленсинг (молчание) гена — это механизм, контролирующий попадающие в клетку генетические элементы и обеспечивающий защиту организма от латентной вирусной инфекции. Зволюционно сайленсинг был направлен на поддержание геномной стабильности организма [97, 98]. Схожие механизмы также лежат в основе инактивации Х-хромосомы, импринтинга и экспрессии тканеспецифических генов. Данная регуляция носит название эпигенетической, а способы достижения сайленсинга — эпигенетической модификацией. В конце 90-х годов XX в. были описаны основные механизмы, лежащие в основе молчания генов у эукариотов. Результаты исследований показывают, что доминантную роль в молчании генов играет метилирование ДНК и деацетилирование гистонов [99, 100].
Метилирование ДНК осуществляется с помощью класса ферментов, называемых ДНК-метилтрансфе-разами, которые ковалентно связывают метальную
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
группу остатка цитозина в пределах Срв-островка [101 ]. Срв-островки расположены в основном в про-моторных областях генов человека [102]. После метилирования ДНК эти регионы распознаются отдельными белками (метил-Срв-связывающие белки (МЕЮ)). Эти белки связывают метилированные Срв-островки и тем самым блокируют доступ факторам транскрипции, которые обычно связываются с промотором. МОВэ также привлекают ферменты — гисто-новые деацетилазы (НОАСз), которые катализируют удаление ацетильной группы из е-аминогрупп специфического остатка лизина и вызывают компактную упаковку ДНК. Конечный результат — это сжатый хроматин, который в дальнейшем уменьшает доступ факторам транскрипции к их промоторным сайтам связывания, приводя к молчанию гена (рис.) [103].
Модель сайленсинга генов на основе метилирования
ДНК и деацетилирования гистонов
[Из статьи КпвИпап М. еЬ а!.. 2006 с модификациями)
На основании вышесказанного можно заключить, что функционально метилирование ДНК и деацети-лирование гистонов тесно связаны и практически не могут проходить отдельно. Так, метилирование ДНК неизбежно приводит к деацетилированию гистонов. Следовательно, при изучении влияния эпигенетических механизмов регуляции на функцию генетической конструкции можно остановиться на одном лишь методе, косвенно подтверждая другие.
Сейчас к эпигенетическим процессам также относят действие микроРНК. Феномен РНК-интерферен-ции заключается в том, что микроРНК обеспечивают специфическое узнавание комплементарных мРНК сложным ферментативным комплексом РНБС, который либо разрушает мРНК, либо комплементарно связывается с ней, приводя к существенному снижению уровня трансляции [104]. МикроРНК сейчас активно изучаются, но данных по их влиянию на экспрессию трансфицированных генов пока нет.
Трансфицированные в клетки генетические конструкции как чужеродные объекты должны подвергаться эпигенетическому контролю. Существует множество работ, доказывающих это положение при стабильной трансфекции [49, 105—109]. При транзиторной трансфекции время нахождения генетической конструкции в клетке невелико, поэтому можно было
предположить, что эпигенетические процессы не успевают включиться в процесс снижения экспрессии. Однако это не так.
Существует прямое доказательство влияния эпигенетической регуляции в клетке (молекулярно-генетические реакции) и косвенное (применение различных препаратов обратного действия). Первое сделать довольно сложно при транзиторной трансфекции, поэтому в литературе есть лишь небольшое количество примеров. Так, при трансфекции вирусом Эпштейна — Барр эмбриональных стволовых клеток человека показано, что промотор Pgk-1 метилирован через 7 дней после трансфекции. Параллельно также были трансфицированы клетки 293-EBNA1, в которых метилирование не было показано [110]. Это позволяет предположить, что сайленсинг трансфицированных генов в результате эпигенетических процессов зависит не только от генетической конструкции, но и от типа клеток.
Намного больше публикаций, косвенно подтверждающих активацию метилирования/деацетилирования. При транзиторной трансфекции макрофагов геном CYP27A1 показано, что 5-азацитидин (деметилирующий агент) усиливает экспрессию трансфицированного гена [111]. Еще одно исследование было проведено на эндотелиальных клетках аорты телят. Их трансфицировали аденовирусным вектором с генами LacZ (галактозидазы) и VEGF165. Было отмечено, что при культивировании клеток с трихостатином А (ингибитор гистоновых деацетилаз) экспрессия трансгенов увеличивается в 3 и более раз. Однако к 14—21 дню падает, как и в случае неприменения этих препаратов [112]. В обоих исследованиях использовали генетические конструкции с СМУ-промотором.
Модификация гистонов играет важную роль в сай-ленсинге трансгенов. Это доказывает исследование Ishiguro (2004). Транзиторно трансфицировали культуры клеток F-MEL и ЗТЗ липосом-опосредованным методом. Использовали генетические конструкции с генами-репортерами под разными промоторами. Сразу после трансфекции клетки культивировали с различными факторами, модифицирующими хроматин и нивелирующими действие эпигенетических регуляторов клетки. В этом исследовании доказано положительное действие всех препаратов на экспрессию всех генетических конструкций (в том числе и под CMV-промотором) на обоих типах клеток. Наиболее эффективным оказался трихостатин А, что подтверждает важную роль гистонового деацетилирования в «патогенезе» сайленсинга трансгенов [113].
Как видно из приведенных выше примеров, при транзиторной трансфекции метилирование ДНК и де-ацетилирование гистонов играют существенную роль в молчании генов. Все эти исследования были проведены с использованием различных клеточных культур, но в отношении МСК человека таких данных нет. Хотя влияние метилирования ДНК при транзиторной трансфекции и доказано на многих клетках, нельзя забывать, что эпигенетические процессы по-разному протекают в разных культурах клеток и, следовательно, в МСК могут не играть существенной роли.
Способы регуляции экспрессии
трансфицированных генов
Доказано, что эпигенетические процессы потенциально обратимы с помощью фармакологических препаратов — деметилирующих агентов и ингибиторов гистоновых деацетилаз.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
Наиболее известным препаратом первой группы является 5-азацитидин [5-аза-С), первоначально разработанный как нуклеозидный антиметаболит для острой миелоидной лейкемии [103]. Позднее его использовали в лечении рака и талассемии [114]. Сейчас азацитидин (видаза) рекомендован FDA для лечения миелодиспластического синдрома [115]. Биохимически 5-аза-С — аналог цитозина, который встраивается во вновь синтезированную ДНК на место део-ксицитидина и формирует ковалентные связи с ДНК-метилтрансферазой [116]. Это взаимодействие ведет к прогрессивному истощению ДНК-метилтранс-феразы в клетке. При этом геном может оказаться гипометилирован. Данный препарат очень токсичен и обладает потенциальным канцерогенным действием.
Во многих исследованиях доказана положительная роль 5-аза-С на экспрессию трансфицированных генов. Так как метилирование ДНК более характерно для стабильной трансфекции, то большинство исследований проведено с использованием ленти-и ретровирусных векторов. Так, Krishnan М. et. al. проводили оценку эффективности 5-аза-С в отношении экспрессии гена Flue на крысиных кардиомио-бластах. Результаты показали, что экспрессия постепенно снижалась в течение 8 мес. С помощью 5-аза-С экспрессию гена удалось значительно увеличить [103]. При стабильной трансфекции мышиных эмбриональных клеток карциномы также доказано, что 5-аза-С ведет к увеличению экспрессии «молчащих» клеточных линий. Показана положительная корреляция дозы препарата и уровня экспрессии [117].
Кроме того, были проведены исследования и in vivo. При введении стабильно трансфицированных клеток U937 мышам ученые наблюдали снижение экспрессии трансгенов — LacZ и HSVtk. После применения 5-аза-С уровень экспрессии существенно вырос [108]. Также было проведено похожее исследование с использованием такого же вектора, но введенного в фибробласты мыши [118]. Результаты обоих исследований похожи, что говорит об одних и тех же механизмах молчания ретровирусов в разных типах клеток.
Как уже отмечалось выше, не только метилирование ДНК играет важную роль в молчании гена-ре-портера, деацетилирование также оказывает большое влияние. Трихостатин А (ТСА) — это антибиотик, ингибирующий ферменты деацетилирования гистонов, что приводит к ослаблению компактной суперспирали хроматина, открывая доступ белкам регуляторам транскрипции к промоторному региону для построения ДНК [119].
Существует множество примеров эффективности данных препаратов в увеличении уровня экспрессии трансгенов. Одно из таких исследований было проведено Bartoli A. et al. на основе ретровирусного вектора с генами-репортерами HSVtk и LacZ, вводимыми в линию клеток U937. Они достоверно доказали восстановление экспрессии гена LacZ в течение 48 ч после применения ТСА in vitro. Реактивация экспрессии носила дозозависимый характер [114]. В другом исследовании также показано, что применение ТСА существенно повышает экспрессию трансфицированного гена [112].
Выше было описано, как взаимосвязаны метилирование ДНК и деацетилирование гистонов. По этой причине часто проводят комбинированное воздей-
ствие деметилирующим агентом и ингибитором гистоновых деацетилаз для увеличения экспрессии трансфицированного гена. Так, применение ТСА в комбинации с 5-аза-С поддерживает экспрессию стабильно трансфицированного гена более чем на 90 дней в клонах клеток U937 [114]. Это еще раз показывает, что все эпигенетические процессы в клетке взаимосвязаны.
Несмотря на всю эффективность данных препаратов, их польза нивелируется нестабильностью и токсичностью при пероральном введении, а также, как выше было отмечено, возможным канцерогенным действие 5-аза-С. Поэтому эти вещества используют в основном для исследовательских целей. Однако для увеличения экспрессии трансгенов до сих пор продолжаются поиски веществ, обладающих меньшей токсичностью. Так, был предложен аналог цитозина — зебуларин [120]. Но его использование также ограничено, как и его предшественников.
Суммируя, можно отметить, что есть эффективные меры борьбы с сайленсингом трансгенов, которые приводят к повышению экспрессии целевых генов in vitro и in vivo. Однако токсичность, канцерогенное действие и потенциальное изменение морфологии МСК ограничивает их применение в клинических целях.
Заключение
Как видно из анализа литературы, МСК сами по себе оказывают положительное действие на организм, однако этого действия бывает недостаточно. Поэтому было предложено использовать трансфекцию с целью усиления терапевтического эффекта. Показано, что трансфицированные определенными факторами МСК оказывают больший эффект, чем нетрансфицированные. Однако трансфекция МСК не так широко используется, как трансфекция других клеток. Это связано, прежде всего, с трудностями культивирования и с тем, что МСК труднее трансфицировать. Поэтому еще не до конца изучены механизмы и поведение МСК после трансфекции. Разработка этого направления, безусловно, перспективна.
При транзиторной трансфекции со временем генетическая конструкция элиминируется из клетки, с этим, в основном, связывают падение экспрессии трансгена. Однако на различных типах клеток доказано, что на этот процесс также оказывают влияние эпигенетические процессы, происходящие в клетке по отношению к введенной конструкции.
Основными механизмами эпигенетической регуляции трансгена являются метилирование ДНК и деацетилирование гистонов. Эти процессы взаимосвязаны, поэтому, доказав наличие одного из них, можно с большой вероятностью утверждать и о наличии другого. Существуют пути увеличения экспрессии введенного гена в результате эпигенетических процессов. Это применение деметилирующих агентов и блокаторов гистоновых деацетилаз, которые оказывают довольно сильное положительное действие, но очень токсичны для организма, а некоторые из них, к тому же, потенциально онкогенны.
Автор выражает благодарность академику Н.П. Бочкову (МГНЦ РАМН) за общие рекомендации и критическую оценку обзора и А.В. Лаврову (МГНЦ РАМН) за помощь в написании статьи.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
ЛИТЕРАТУРА
1. Riordan N.H., IchimT.E., Min W.-P. et al. Non-expanded adipose stromal vascular fraction cell therapy for multiple sclerosis. Journal of Translational Medicine 2009; 7: 29.
2. Psaltis P.J., Zannettino A.C.W., Worthley S.G. et al. Concise review: mesenchymal stromal cells: potential for cardiovascular repair. Stem Cells. 2008; 26: 2201-10.
3. Yoshimura K., Sato K., Aoi N. et al. Cell-Assisted Lipotransfer for Cosmetic Breast Augmentation: Supportive Use of Adipose-Derived Stem/Stromal Cells. Aesth Plast Surg. 2008; 32: 48—55.
4. Schaffler A., Buchler C. Concise review: adipose tissue-derived stromal cells — basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells 2007; 25: 818—27.
5. Мусина P.А., Бекчанова E.C., Сухих Г.Т. Сравнительная характеристика мезенхимных стволовых клеток, полученная из разных тканей человека. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2005; 2: 89—94.
6. Тепляшин А.С., Коржикова С.В., Шарифуллина С.З. и др. Характеристика мезенхимных стволовых клеток человека, выделенных из костного мозга и жировой ткани. Цитология 2005; 47 [21: 130-5.
7. Astori G., Vignati F., Bardelli S. et al. «In vitro» and multicolor phenotypic characterization of cell subpopulations identified in fresh human adipose tissue stromal vascular fraction and in the derived mesenchymal stem cells. J Transl Med. 2007; 5: 55.
8. Zuk P.A., Zhu М., Mizuno H. et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001; 7: 211-26.
9. Mizuno H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review. J. Nippon. Med. Sch. 2009; 76(21: 56-66.
10.Aust L., Devlin B., Foster S.J. et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy 2004; 6: 7-14.
11. Jurgens W.J., Oedayrajsingh-Varma M.J., Fielder M.N. et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell Tissue Res. 2008; 332(31: 415-26.
12. Le Blanc K., Rasmusson I., Sundberg B. et al. Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells. Lancet 2004; 363: 1439—41.
13. Khakoo A.Y., Pati S., Anderson S. A. et al. Fluman mesenchymal stem cells exert potent antitumorigenic effect in a model of Kaposi’s sarcoma. J. Exp. Med. 2006; 203: 1253—47.
14. Nakamizo A., Marini F., Amano T. et al. Fluman bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of gliomas. Cancer Res. 2005; 65: 3307-18.
15. Nakamura K., Ito Y., Kawano Y. et al. Antitumor effect of genetically engineered mesenchymal stem cells in a rat glioma model. GeneTher. 2004; 11: 1155-64.
16. Studeny М., Marini F.C., Champlin R. E. et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells as vehicles for interferon-h delivery into tumors. Cancer Res. 2002; 62: 3603—8.
17. Studeny М., Marini F.C., Dembinski J.L. et al. Mesenchymal stem cells: potential precursors for tumor stroma and targeted-delivery vehicles for anticancer agents. J. Natl. Cancer. Inst. 2004; 96: 1593—603.
18. Sadan 0., Melamed E., Offen D. Bone-marrow-derived mesenchymal stem cell therapy for neurodegenerative diseases. Expert. Opin. Biol. Ther. 2009; 9C121: 1487-97.
19. Pittenger M.F., MackayA.M., Beck S.C. et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999; 284: 143-7.
20. Majumdar M.K., Thiede M.A., Mosca J.D. et al. Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells tMSCs] and stromal cells. J. Cell. Physiol. 1998; 176: 57—66.
21. Kim Y., Kim H., Cho H. et al. Direct comparison of human mesenchymal stem cells derived from adipose tissues and bone marrow in mediating neovascularization in response to vascular ischemia. Cell Physiol. Biochem. 2007; 20Ш): 867—76.
22. Al-Khaldi A., Al-Sabti H., Galipeau J. et al. Therapeutic angiogenesis using autologous bone marrow stromal cells: improved blood flow in a chronic limb ischemia model. Ann. Thorac. Surg. 2003; 75: 204-9.
23. Lee J.B., Bae Y.C., Sung S.M. et al. Fluman adipose tissue-derived mesenchymal stem cells improve postnatal neovascularization in a mouse model of hindlimb ischemia. Cell Physiol. Biochem. 2006; 17[5-61: 279-90.
24. Kaigler D., Krebsbach P.H, Polverini P.J et al. Role of vascular endothelial growth factor in bone marrow stromal cell modulation of endothelial cells. Tissue Eng. 2003; 9И): 95—103.
25. Spizizen J., Reilly B.E., Evans A.H. Microbial transformation and transfection. Annu. Rev. Microbiol. 1966; 20: 371—400.
26. Ticha P., RytHr V., Kohoutov6 M. Genetic transformation and transfection of Bacillus subtilis spheroplasts. Folia Microbiol. [Praha], 1968; 13t6]: 510-4.
27. Cudkowicz G., Upton A.C., Smith L.H. et al. An Approach to the Characterization of Stem Cells in Mouse Bone Marrow. Ann. NY Acad. Sci. 1964; 114: 571-85.
28. Allay J.A., Dennis J.E., Haynesworth S.E. et al. LacZ and interleukin-3 expression in vivo after retroviral transduction of marrow-derived human osteogenic mesenchymal progenitors. Hum. Gene Ther. 1997; 8t12]: 1417-27.
29. RiewK.D., Wright N.M., Cheng S. et al. Induction of bone formation using a recombinant adenoviral vector carrying the human BMP-2 gene in a rabbit spinal fusion model. Calcif. Tissue Int. 1998; 63C4): 357—60.
30. Dong S.W., Ying D.J., Duan X.J. et al. Bone regeneration using an acellular extracellular matrix and bone marrow mesenchymal stem cells expressing Cbfal. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2009; 73(101: 2226—33.
31. Kang Y., Liao W.M., Yuan Z.H. et al. In vitro and in vivo induction of bone formation based on adeno-associated virus-mediated BMP-7 gene therapy using human adipose-derived mesenchymal stem cells. Acta. Pharmacol. Sin. 2007; 28C6]: 839-49.
32. Sheyn D., Pelled G., Zilberman Y. et al. Nonvirally engineered porcine adipose tissue-derived stem cells: use in posterior spinal fusion. Stem Cells 2008; 26(41: 1056-64.
33. Tu Q., Valverde P., Li S. et al. Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone. Tissue Eng. 2007; 13(10): 2431—40.
34. Gondo S., Okabe T., Tanaka T. et al. Adipose tissue-derived and bone marrow-derived mesenchymal cells develop into different lineage of steroidogenic cells by forced expression of steroidogenic factor 1. Endocrinology 2008; 149(91: 4717—25.
35. Xu X., Tang L. Q., Ma S.C. et al. EphrinB2 gene transfection promotes the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into vascular endothelial cells. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2008; 28[53: 790-4.
36. Madonna R., Willerson J.T., Geng Y.J. Myocardin a enhances telomerase activities in adipose tissue mesenchymal cells and embryonic stem cells undergoing cardiovascular myogenic differentiation. Stem Cells 2008; 26C1 ]: 202-11.
37. Guo C.A., Liu X.G., Huo J.Z. et al. Novel gene-modified-tissue engineering of cartilage using stable transforming growth factor-betal -transfected mesenchymal stem cells grown on chitosan scaffolds. J. Biosci. Bioeng. 2007; 103(61: 547—56.
38. Xu Y., Mirmalek-Sani S.H., Lin F. et al. Adipocyte differentiation induced using nonspecific siRNA controls in cultured human mesenchymal stem cells. RNA. 2007; 13C8): 1179-83.
39. Zeng B., Chen H., Zhu C. et al. Effects of combined mesenchymal stem cells and heme oxygenase-1 therapy on cardiac performance. Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2008; 34t4): 850—6.
40. Gao F., He T., Wang H. et al. A promising strategy for the treatment of ischemic heart disease: Mesenchymal stem cell-mediated vascular endothelial growth factor gene transfer in rats. Can. J. Cardiol. 2007; 23(11): 891-8.
41. Mei S.H., McCarter S.D., Deng Y. et al. Prevention of LPS-induced acute lung injury in mice by mesenchymal stem cells overexpressing angiopoietin 1. PLoS Med. 2007; 4(9): e269.
42. Kim J.H., Park S.N., Suh H. Generation of insulin-producing human mesenchymal stem cells using recombinant adeno-associated virus. Yonsei. Med. J. 2007; 48C13: 109—19.
43. Li W., Ma N.. Ong L.L. et al. Bcl-2 engineered MSCs inhibited apoptosis and improved heart function. Stem Cells 2007; 25(8): 2118-27.
44. Parolin C., Sodroski J. A defective HIV-1 vector for gene transfer to human lymphocytes. J. Mol. Med. 1995; 73C6]: 279—88.
45. Naldini L., Bliimer U., Gallay P. et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science 1996; 272(52591: 263-7.
46. Marshall H.M., Ronen K., Berry C. et al. Role of PSIP1/LEDGF/ p75 in Lentiviral Infectivity and Integration Targeting. PLoS ONE 2007; 2: e1340.
47. Modlich U., Baum C. Preventing and exploiting the oncogenic potential of integrating gene vectors. J. Clin. Invest. 2009; 119(4): 755-8.
48. Imren S., Fabry M.E., Westerman K.A. et al. High-level beta-globin expression and preferred intragenic integration after lentiviral transduction of human cord blood stem cells. J. Clin. Invest. 2004; 114C7): 953-62.
49. Di lanni M., Casciari C., Ciurnelli R. et al. Retroviral transfer of herpes simplex virus-thymidine kinase and beta-galactosidase genes into U937 cells with bicistronic vector. Leuk Res. 1997; 21: 951—9.
50. Van Damme A., Thorrez L., Ma L. et al. Efficient lentiviral transduction and improved engraftment of human bone marrow mesenchymal cells. Stem Cells 2006; 24(4): 896-907.
51. Bestor T.H. Gene silencing as a threat to the success of gene therapy. J. Clin. Invest. 2000; 105: 409—11.
52. Chan J., O’Donoghue K., de la Fuente J. et al. Human fetal mesenchymal stem cells as vehicles for gene delivery. Stem Cells 2005; 23: 93-102.
53. Peterson B., Iglesias R., Zhang J. et al. Genetically modified human derived bone marrow cells for posterolateral lumbar spine fusion in athymic rats: beyond conventional autologous bone grafting. Spine 2005; 30: 283-90.
54. Gottfried O.N., Dailey A.T. Mesenchymal stem cell and gene therapies for spinal fusion. Neurosurgery 2008; 63: 380—92.
55. Somia N.. Verma I.M. Gene therapy: trials and tribulations. Nature Reviews Genetics 2000; 1(2): 91—9.
56. Christiano R. Viral and non-viral vectors for cancer gene therapy. Anticancer Res. 1998; 18: 3142—246.
57. Bangari D.S., Mittal S.K. Current strategies and future directions for eluding adenoviral vector immunity. Curr. GeneTher. 2006; 6: 215-26.
58. Bushman F., Lewinski M., Ciuffi A. et al. Genome-wide analysis of retroviral DNA integration. Nat. Rev. Microbiol. 2005; 3: 848—58.
59. Flotte T.R. Gene therapy: The first two decades and the current state-of-the-art. J. Cell Physiol. 2007; 213: 301—5.
60. Li Z., Dullmann J., Schiedlmeier B. et al. Murine leukemia induced by retroviral gene marking. Science 2002; 296: 497.
61. Marshall E. Gene therapy death prompts review of adenovirus vector. Science 1999; 286: 2244—5.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
62. Yang J., Tang Т., Li F. et al. Experimental Study of the Effects of Marrow Mesenchymal Stem Cells Transfected with Hypoxia-lnducible Factor-1— Gene. Journal of Biomedicine and Biotechnology 2009; 2009: 1—10.
63. Floelters J., Ciccarella М., Drechsel M. et al. Nonviral genetic modification mediates effective transgene expression and functional RNA interference in human mesenchymal stem cells. J. Gene Med. 2DD5; 7: 718-28.
64. Wu M.FI., Liebowitz D.N., Smith S.L. et al. Efficient expression of foreign genes in human CD34 1 hematopoietic precursor cells using electroporation. GeneTher. 2DD1; 8(5): 384—90.
65. Aluigi М., Fogli М., Curti A. et al. Nucleofection is an efficient nonviral transfection technique for human bone marrow—derived mesenchymal stem cells. Stem Cells 2006; 24: 454—61.
66. Uchida E., Mizuguchi FI., Ishii-Watabe A. et al. Comparison of the efficiency and safety of non-viral vector-mediated gene transfer into a wide range of human cells. Biol. Pharm. Bull. 2002; 25: 891—7.
67. Flelledie Т., Nurcombe V., Cool S.M. A simple and reliable electroporation method for human bone marrow mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 2008; 17[41: 837-48.
68. Flaleem-Smith FI., Derfoul A., Okafor C. et al. Optimization of high-efficiency transfection of adult human mesenchymal stem cells in vitro. Mol. Biotechnol. 2005; 30: 9-20.
69. Flamm A., Krott N.. Breibach I. et al. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 2002; 8: 235—45.
70. Lakshmipathy U., PelachoB., Sudo K. etal. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells 2004; 22: 531—43.
71.Florwitz E.M., Prockop D.J., Fitzpatrick L.A. et al. Transplantability and therapeutic effects of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in children with osteogenesis imperfect. Nat. Med. 1999; 5: 309-13.
72. Lee K., Majumdar M.K., Buyaner D. et al. Fluman mesenchymal stem cells maintain trangene expression during expansion and differentiation. Mol. Ther. 2001; 3: 857—66.
73. Wiehe J.M., Ponsaerts P., Rojewski M.T. et al. mRNA-mediated gene delivery into human progenitor cells promotes highly efficient protein expression. J. Cell Mol. Med. 2007; 11 [31: 521—30.
74. Fladlaczky G., Praznovszky Т., Cserp6n I. et al. Centromere formation in mouse cells cotransformed with human DNA and a dominant marker gene. PNAS U S A 1991; 88t18]: 8106—10.
75. Praznovszky Т., Кегеэц J., Tubak V. et al. De novo chromosome formation in rodent cells. PNAS USA 1991; 88(24): 11042-6.
76. Vanderbyl S., MacDonald G.N., Sidhu S. et al. Transfer and stable transgene expression of a mammalian artificial chromosome into bone marrow-derived human mesenchymal stem cells. Stem Cells 2004; 22[33: 324-33.
77. Ren X., Katoh М., Floshiya FI. et al. A novel human artificial chromosome vector provides effective cell lineage-specific transgene expression in human mesenchymal stem cells. Stem Cells 2005; 23(101: 1608-16.
78. Gwak S.J., Kim B.S. Poly tlactic-co-glycolic acid] nanosphere as a vehicle for gene delivery to human cord blood-derived mesenchymal stem cells: comparison with polyethylenimine. Biotechnol. Lett. 2008; 30t7]: 1177-82.
79. Valero A., Post J.N., van Nieuwkasteele J.W. et al. Gene transfer and protein dynamics in stem cells using single cell electroporation in a microfluidic device. Lab. Chip. 2008; 8[13: 62—7.
80. Bosch P., Pratt S.L., Stice S.L. Isolation, characterization, gene modification, and nuclear reprogramming of porcine mesenchymal stem cells, biology of reproduction 2006; 1 [743: 46—57.
81. Hung S.-С., Lu C.-Y., Shyue S.-K. et al. Lineage differentiation-associated loss of adenoviral susceptibility and coxsackie-adenovirus receptor expression in human mesenchymal stem cells. Stem Cells 2004; 22: 1321-9.
82. Balyasnikova I.V., Franco-Gou R., Mathis J.M. et al. Genetic modification of mesenchymal stem cells to express a single-chain antibody against EGFRvlll on the cell surface. J. Tissue Eng. Regen. Med. 2009. Epub ahead of print.
83. Yang J.F., Zhou W.W., Tang T. et al. Transfection of human VEGF165 gene into bone marrow mesenchymal stem cells in rats. Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2006; 31 [31: 313—8.
84. Mok P.L., Cheong S.K., Leong C.F. et al. In vitro expression of erythropoietin by transfected human mesenchymal stromal cells. Cytotherapy 2008; 10[23: 116—24.
85. Aslan H., Zilberman Y., Arbeli V. et al. Nucleofection-based ex vivo nonviral gene delivery to human stem cells as a platform for tissue regeneration. Tissue Eng. 2006; 12[43: 877—89.
86. Meyerrose T.E., De Ugarte D.A., Hofling A.A. et al. In vivo distribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells in novel xenotransplantation models. Stem Cells 2007; 25(1): 220—7.
87. Zhang X.Y., La Russa V.F., Bao L. et al. Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells. Mol. Ther. 2002; 5: 555—65.
88. Stender S., Murphy М., O’Brien T. et al. Adeno-associated viral vector transduction of human mesenchymal stem cells. Eur. Cell Mater. 2007; 13: 93-9.
89. Palmer G.D., Steinert A., Pascher A. et al. Gene-induced chondrogenesis of primary mesenchymal stem cells in vitro. Mol. Ther. 2005; 12[23: 219-28.
90. Roelants V., Labar D., de Meester C. et al. Comparison between adenoviral and retroviral vectors for the transduction of the thymidine kinase PET reporter gene in rat mesenchymal stem cells. Journal of Nuclear Medicine 2008; 49(111: 1836—44.
91. Ma L., Wang G., Li L. et al. Expression of lipofect AMINE mediated human GM-CSF eukaryotic expressing vector in HFCL cells. Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 2000; 21 [121: 624-7.
92. Baksh D., Yao R., Tuan R.S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells 2007; 25[61: 1384-92.
93. Ronsyn M.W., Daans J., Spaepen G. etal. Plasmid-based genetic modification of human bone marrow-derived stromal cells: analysis of cell survival and transgene expression after transplantation in rat spinal cord. BMC Biotechnology 2007; 7: 90.
94. Kucerova L., Altanerova V., Matuskova M. et al. Adipose Tissue-Derived Human Mesenchymal Stem Cells Mediated Prodrug Cancer Gene Therapy. Cancer Research 2007; 67: 6304—13.
95. Knafln-Shanzer S., van de Watering M.J.M., van der Velde I. et al. Endowing Human Adenovirus Serotype 5 Vectors with Fiber Domains of Species В Greatly Enhances Gene Transfer into Human Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells 2005; 10 [231: 1598-607.
96. Partridge K.A., Oreffo R.O. Gene delivery in bone tissue engineering: progress and prospects using viral and nonviral strategies. Tissue Eng. 2004; 10: 295—307.
97. Patkin E.L. Epigenetic mechanisms for primary differentiation in mammalian embryos. Int. Rev. Cytol. 2002; 216: 81—129.
98. Paulsen М., Ferguson-Smith A.C. DNA methylation in genomic imprinting, development, and disease. J. Pathol. 2001; 195: 97—110.
99. Tate P., Skarnes W., Bird A. The methyl-CpG binding protein MeCP2 is essential for embryonic development in the mouse. Nat. Genet. 1996; 12: 205-8.
100. Nan X., Campoy F.J., Bird A. MeCP2 is a transcriptional repressor with abundant binding sites in genomic chromatin. Cell 1997; 88: 471-81.
101. Fazzari M.J., Greally J.M. Epigenomics: beyond CpG islands. Nat. Rev. Genet. 2004; 5: 446—55.
102. Grassi G., Maccaroni P., Meyer R. et al. Inhibitors of DNA methylation and histone deacetylation activate cytomegalovirus promoter-controlled reporter gene expression in human glioblastoma cell line U87. Carcinogenesis 2003; 10(241: 1625—35.
103. Krishnan М., Park J.M., Cao F. et al. Effects of epigenetic modulation on reporter gene expression: implications for stem cell imaging. The FASEB Journal 2006; 20t1): 106—8.
104. Bahadori M. New Advances in RNAs. Arch. Iranian Med. 2008; 11 [41: 435-43.
105. Mclnerney J.M., Nawrocki J.R., Lowrey C.H. Long-term silencing of retroviral vectors is resistant to reversal by trichostatin A and 5-azacytidine. GeneTher. 2000; 7: 653—63.
106. Lorincz M.C., Schubeler D., Goeke S.C. et al. Dynamic analysis of proviral induction and de novo methylation: implications for a histone deacetylase-independent, methylation density-dependent mechanism of transcriptional repression. Mol. Cell Biol. 2000; 20: 842—50.
107. Rosenqvist N.. Hard Af Segerstad C., Samuelsson C. et al. Activation of silenced transgene expression in neural precursor cell lines by inhibitors of histone deacetylation. J. Gene Med. 2002; 4: 248—57.
108. Di lanni М., Terenzi A., Perruccio K. et al. 5-Azacytidine prevents transgene methylation in vivo. Gene Therapy 1999; 4(B): 703—7.
109. Di lanni М., Terenzi A., Di Florio S. et al. In vivo demethylation of a MoMuLV retroviral vector expressing the herpes simplex thymidine kinase suicide gene by 5-azacytidine. Stem Cells 2000; 18: 415—21.
110. Kameda Т., Smuga-Otto K., Thomson J.A. A severe de novo methylation of episomal vectors by human ES cells. Biochemical and Biophysical Research Communications 2006; 349: 1269—77.
111. Escher G., Hoang A., Georges S. et al. Demethylation using the epigenetic modifier, 5-azacytidine, increases the efficiency of transient transfection of macrophages. J. Lipid Res. 2005; 46: 356-65.
112. Gaetano C., Catalano A, Palumbo R. et al. Transcriptionally active drugs improve adenovirus vector performance in vitro and in vivo. Gene Therapy 2000; 7: 1624-30.
113. Ishiguro K, Sartorelli A.C. Activation of transiently transfected reporter genes in 3T3 Swiss cells by the inducers of differentiation/apoptosis-dimethylsu If oxide, h exam ethylene bisacetamide and trichostatin A. Eur. J. Biochem. 2004; 271(121: 2379-90.
114. Bartoli A., Fettucciari K., Fetriconi I. et al. Effect of trichostatin A and 5-azacytidine on transgene reactivation in U937 transduced cells. Pharmacological Research 2003; 48: 111—8.
115. Vidasa. Prescribing information, http://www.accessdata.fda.gov/ drugsatfda_docs/label/2008/050794s0111bl.pdf.
116. Jones P.A., Taylor S.M. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation. Cell 1980; 20: 85-93.
117. He J., Yang Q., Chang L.J. Dynamic DNA methylation and histone modifications contribute to lentiviral transgene silencing in murine embryonic carcinoma cells. J. Virol. 2005; 79(21): 13497—508.
118. Hoeben R.C., Migchielsen A.A.J., Van Der Jagt R.C.M. et al. Inactivation Of The Moloney Murine Leukemia Virus Long Terminal Repeat In Murine Fibroblast Cell Lines Is Associated With Methylation And Dependent On Its Chromosomal Position. Journal of Virology 1991; 2(65): 904-12.
119. Finnin M.S., Donigian J.R., Cohen A. et al. Structures of a histone deacetylase homologue bound to the TSA and SAHA inhibitors. Nature 1999; 401: 188-93.
120. Cheng J.C., Matsen C.B., Gonzales F.A. et al. Inhibition of DNA methylation and reactivation of silenced genes by zebularine. J. Natl. Cancer Inst. 2003; 95: 399-409.
Поступила 31.032010
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010
