CC BY
154
Влияние возраста на ангиогенные свойства мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани
А.Ю. Ефименко, Е.Е. Старостина, Н.И. Калинина, Е.В. Парфенова Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва
Age effects on angiogenic properties of adipose tissue mesenchymal stem cells
A.Yu. Efimenko, E.E. Starostina, N.I. Kalinina, E.V. Parfyenova M.V. Lomonosov Moscow State University, Moscow
Мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани (МСК-ЖТ) способны стимулировать ангиогенез посредством продукции факторов роста и стабилизации растущих сосудов. МСК-ЖТ являются перспективным материалом для аутологичной клеточной терапии. Однако с возрастом пациентов активность их МСК-ЖТ, а, следовательно, и эффективность клеточной терапии могут снижаться. Целью нашей работы было оценить ангиогенные свойства МСК-ЖТ при старении.
Материал и методы. МСК-ЖТ были выделены из подкожной жировой ткани мышей линии BaIB/с возраста 1—2, 12, 18 и 24 мес., а также 12 доноров трех возрастных групп (12 (5; 12) лет, 45 (41; 45) лет и 65 (59; 76) лет). МСК-ЖТ 2-го пассажа помещали на 48 ч в условия 1% или 20% содержания кислорода. Оценивали способность клеток стимулировать ангиогенез in vitro и in vivo.
Результаты. Способность МСК-ЖТ мышей стимулировать формирование капилляроподобных структур in vitro и васкуляризацию подкожных имплантатов Матригеля in vivo с возрастом снижалась в среднем на 60%. Содержание мРНК сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и плацентарного фактора роста (PIGF) в этих клетках снижалось, а фактора роста гепатоцитов (HGF) и компонентов системы внеклеточного протеолиза (рецептор к урокиназе, металлопротеиназы 2 и 9 типов, ингибитор активатора плазминогена-1) — возрастало с возрастом животных. Стимуляция экспрессии VEGF, PIGF и HGF в условиях гипоксии была выражена слабее в случае МСК-ЖТ старых животных. Экспрессия PIGF и ангиопоэтина-1, а также секреция VEGF и HGF МСК-ЖТ человека отрицательно коррелировали с возрастом донора.
Таким образом, при старении способность МСК-ЖТ стимулировать ангиогенез снижается в результате подавления экспрессии ключевых ангиогенных факторов.
Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани, старение, ангиогенез.
Mesenchymal stem cells of adipose tissue (MSC-AT) are capable to stimulate angiogenesis by producing growth factors and stabilizing growing vessels. Mesenchymal stem cells of adipose tissue are a promising material for autologous cell-based therapy. However, as people age, the activity of their MSC-AT and, therefore the efficacy of cell-based therapy can decrease.
Materials and Methods. MSC-AT were isolated from subcutaneous adipose tissue of BalB/c line mice aged 1-2, 12, 18 and 24 months as well as 12 donors of three age groups (12, 45 and 65 years). MSC-AT of the 2nd passage were placed in 1% or 20% oxygen concentrations for 48 h. Cell ability to stimulate angiogenesis in vitro and in vivo was assessed.
Results. The ability of mouse MSC-AT to stimulate formation of capillary-like structures in vitro and vascularization of subcutaneous Matrigel implants in vivo decreased with the age by 60 % at average. The mRNA concentration of vascular endothelial growth factor (VEGF) and placenta growth factor (PlGF) decreased in these cells, while that of hepatocyte growth factor (HGF) and cellular protease system components (urokinase receptor, type 2 and 9 metalloproteinases, inhibitor of plasminogen-1 activator) increased with the animal age. Stimulation of the VEGF, PlGF and HGF expression under hypoxia conditions was less in MSC-AT of old animals. The expression of PlGF and angiopoetin-1 as well as the secretion of VEGF and HGF by human MSC-AT demonstrated negative correlation with the donor age.
Thus, the ability of adipose tissue mesenchymal stem cells to stimulate angiogenesis decreases with the age as a result of inhibition of the key angiogenic factors expression.
Key words: adipose tissue mesenchymal stem cells, ageing, angiogenesis.
На сегодняшний день накоплено значительное количество данных, свидетельствующих о том, что при старении организма происходят изменения количества и/или функциональных свойств всех типов прогениторных клеток, в том числе мезенхимальных стволовых клеток (МСК) [1—5]. МСК, выделенные из жировой ткани (МСК-ЖТ), считаются перспективным типом клеток для терапии различных заболеваний ишемического генеза благодаря способности стимулировать рост кровеносных сосудов, в частности, за счет секреции ангиогенных цитокинов и факторов роста. Локальное и системное введение МСК-ЖТ способствует увеличению количества сосудов в тканях с нарушенным кровоснабжением, приводит к улучшению кровотока в них и уменьшению или исчезновению симптомов ишемии, как было показано
e-mail: [email protected]
на моделях ишемии конечности [6—14] и инфаркта миокарда у животных [6, 15—22].
Предполагается, что восстановление кровотока в ишемизированной ткани с помощью трансплантации МСК-ЖТ обусловлено несколькими механизмами. Во-первых, эти клетки секретируют ангиогенные факторы роста, включая сосудистый эндотелиальный фактор роста (УБЭР), фактор роста гепатоцитов (ИЭР) и основный фактор роста фибробластов (ЬРЭР), которые способствуют миграции и пролиферации эндотелиальных клеток и их предшественников, а также формированию новых сосудов [7, 9, 11, 12, 14, 23, 24]. Во-вторых, МСК-ЖТ могут дифференцироваться в гладкомышечные и эндотелиальные клетки растущих сосудов, а также стабилизировать их, выполняя функцию перицитов [8, 15, 25, 26].
Старение оказывает, в целом, негативное влияние на функциональную активность прогенитор-ных клеток жировой ткани. Так, было показано, что возраст пациентов обратно пропорционален количеству CD34+/CD133 + клеток-предшественниц в стромально-васкулярной фракции подкожного жира и их способности образовывать тубулярные структуры на Матригеле [27]. При старении снижается уровень пролиферации МСК-ЖТ и их остеогенный потенциал [28]. Возрастные изменения МСК костного мозга могут являться причиной снижения эффективности клеточной терапии инфаркта миокарда этими клетками в группе старых мышей по сравнению с молодыми [2, 29]. Изменение дифферен-цировочного потенциала и пролиферации МСК-ЖТ человека может являться важным патогенетическим фактором развития заболеваний, ассоциированных с возрастом, включая атеросклероз, сахарный диабет второго типа и гипертоническую болезнь.
В отдельных работах было показано, что с возрастом снижается продукция VEGF культивированными МСК-ЖТ крысы, уменьшается их пролиферативный потенциал и способность формировать тубулярные структуры на Матригеле [30, 31]. Тем не менее, данных о влиянии возраста на ангиогенные свойства МСК-ЖТ недостаточно.
В условиях гипоксии в МСК-ЖТ повышается экспрессия факторов, вовлеченных в регуляцию ангиогенеза, что определяет, в том числе, их активность в ишемизированных тканях при трансплантации. Культивирование клеток при низком содержании кислорода (1%) является одним из способов стимуляции ангиогенных свойств МСК-ЖТ ex vivo [9, 23, 32, 33, 34], поэтому в нашем исследовании МСК-ЖТ, полученные от молодых и старых доноров, были культивированы как в стандартных, так и в гипоксических условиях.
Таким образом, целью работы являлась оценка ангиогенных свойств МСК-ЖТ при старении.
Материал и методы
Доноры
В исследование были включены 12 доноров, у которых были выделены образцы подкожной жировой ткани в ходе операции по поводу общей хирургической (аппендицит, паховая грыжа), гинекологической (миома матки) патологии или травмы нижней конечности. Критериями исключения считали наличие острых или хронических воспалительных заболеваний, онкологической патологии, тяжелой анемии и других гематологических заболеваний, аутоиммунные патологии, алкоголизм, пороки сердца, патологию миокарда, в том числе инфаркт миокарда в анамнезе, инсульт. Все доноры или их законные представители подписывали добровольное информированное согласие на взятие у них образца жировой ткани.
Доноры были разделены на 3 возрастные группы: младшая (12 (5; 12) лет, n = 3), средняя (45 (41; 45) лет лет, n = 5) и старшая (65 (59; 76) лет, n = 4). В каждой группе было по одному донору мужского пола, остальные — женского.
Животные
Исследование проводили на МСК-ЖТ самцов мышей линии Balb/c, предоставленных биоклиникой ФГУ РКНПК Росмедтехнологий. Содержание и использо-
вание лабораторных животных соответствовало правилам, принятым в институте. В эксперименте животные были разделены на несколько возрастных групп: молодые (1—2 мес., n = 16), взрослые (12 мес., n = 6), старые (18 мес., n = 9; 24 мес., n = 7).
Выделение МСК-ЖТ
МСК-ЖТ человека были выделены из подкожного жира, эксплантированного в ходе операции. МСК-ЖТ лабораторных животных были получены из подкожной жировой клетчатки, расположенной по латеральной поверхности нижней части туловища мышей.
Выделение клеток проводили согласно ранее опубликованному протоколу [35] с некоторыми модификациями. Полученные клетки высаживали в чашки Петри в количестве 5х104/см3 и инкубировали при 37°С, 5% СО2. На следующий день выполняли смену среды для удаления неприкрепившихся клеток. Клетки культивировали на необработанном белками клеточного Матрикса пластике в среде DMEM с низкой концентрацией глюкозы (HyClone), содержащей 10% фетальную бычью сыворотку, 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина. При достижении 80% конфлюентности монослоя клетки пассировали. В экспериментах использовали МСК-ЖТ 2 и 3 пассажей, достигшие 70—80% конфлюентности.
Моделирование гипоксии
Для изучения влияния гипоксии на МСК-ЖТ мыши мы использовали метод, опубликованный практически одновременно S. Ohnishi с соавт. (2007) и E. Potier с соавт. (2007) [36, 37]. Клетки 2—3 пассажей в течение 24 ч депривировали в среде роста, не содержащей сыворотку, а затем помещали в условия 1% (гипоксия) или 20% (нормоксия) содержания кислорода на 48 ч. Клеточные культуры исследовали немедленно после изъятия из гипокси-ческого инкубатора.
Выделение РНК из клеток
Выделение РНК из культивированных клеток проводили с использованием Qiagen RNeasy Mini Kit, согласно руководству, приложенному к набору. Концентрацию РНК определяли по поглощению раствора РНК при длине волны 260 нм с помощью прибора NanoDrop200.
Количественная ПЦР с обратной транскрипцией
в реальном времени
Синтез кДНК проводили с использованием набора Fermentas Reverse Transcription Reagents, согласно руководству, приложенному к набору. ПЦР в реальном времени проводили на приборе Rotor-Gene R6-3000 (Corbett Research) с использованием SYBR Green PCR Master Mix (10 мкл), 1 мкл кДНК и 1 мкл смеси праймеров в концентрации 1—5 мкМ. Условия для ПЦР выдерживали следующие: 95°С в течение 10 мин, затем 40 циклов 95°С — 15 с, п°С — 20 с (где n — температура, эмпирически подобранная для каждой пары праймеров), 72°С — 20 с. Использованные праймеры представлены в таблице.
Содержание исследуемых мРНК нормировали по уровню сигнала, получаемого для кДНК L7, b-actin и gapdh (гены домашнего хозяйства). Все эксперименты были дублированы для каждого образца клеток.
Последовательности олигонуклеотидных праймеров
Ген Прямой праймер Обратный праймер
VEGFa AGAGCAGAAGTCCCATGAAGTGA T CAAT CGGACGGCAGTAGCT
PlGF CCAAGGGGAAGAGGAAGAGGAGTA GCAGGGACGAGTCGGCTAATAA
bFGF GCGCCGCCTTCCCACCAG AGCCAGCAGCCGTCCATCTTCCT
HGF TCATTGGTAAAGGAGGCAGCTATA CTGGCATTT GATGCCACT CTTA
TGFb TGCCCCTATATTTGGAGCCTGGAC GCCCGGGTT GT GTTGGTT GTAGAG
uPA GAATGCGCCTGCTGTCC AGGGTCGCTTCTGGTTGTC
uPAR CGTTACCTCGAGTGTGCGTCCTG AGCCT CGGGT GTAGT CCT CAT C
MMP2 AGTTCCCGTTCCGCTTCC AGCCT CGGGT GTAGT CCT CATCC
MMP9 GCGGTGTGGGGCGAGGTG CCAGGGGGAAAGGCGTGTGC
ENDS AGTTT GGT CTTGCTGCTGGTG AAGTCCCGGAAGAAGAGTTTTG
TBS1 GCGCGGAGCT GGAT GTA AATGTCTTCTGGGGTGGTTC
PAI-1 GCTTCATGCCCCACTTCTTCAA ACCAGGCGT GTCAGCT CGT CTA
L7 CTCCGT CTGCGGCAGAT C CAGCATGTTAATT GAAGCCTT GTT
ActB AGT GT GACGTT GACATCCGTA GCCAGAGCAGTAATCTCCTTCT
GAPDH GACCCCTTCATTGACCTCAACTAC TGGTGGTGCAGGATGCATTGCTGA
Оценка уровня секреции VEGF и HGF МСК-ЖТ в среду культивирования
Анализ содержания в среде культивирования МСК-ЖТ человека VEGF и HGF проводили с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием наборов реагентов компании R&D Systems (США), согласно руководству, приложенному к набору. Предварительно кондиционированную в течение 48 ч среду, полученную при культивировании МСК-ЖТ от разных доноров, концентрировали в їО раз с использованием специальных реагентов (Centricon, Millipore) и измеряли количество VEGF и HGF в каждой пробе с двукратными повторами.
Формирование капилляроподобных структур эндотелиоцитами
Влияние кондиционированной среды МСК-ЖТ на рост кровеносных сосудов in vitro оценивали на модели образования капилляроподобных структур на Ма-тригеле. Для этого эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) Э—4 пассажа высаживали на 48-луночный планшет (Эх1О4 клеток на лунку), покрытый Матригелем, обедненным ростовыми факторами. В культуральную среду HUVEC добавляли кондиционированную среду в соотношении 1:Э. Каждый образец кондиционированной среды использовали не менее чем в двух лунках. В качестве отрицательного контроля использовали культуральную среду HUVEC, не содержащую сыворотку, в качестве положительного контроля — среду роста HUVEC, содержащую ЭО% фетальную бычью сыворотку. Планшет помещали в COg-инкубатор при З7°С на Э4 ч, после чего оценивали образование капилляроподобных структур с помощью светового микроскопа (Leica,
Германия). Суммарную длину трубчатых структур в
5 случайно выбранных полях зрения в каждой лунке подсчитывали на изображениях, полученных при использовании объектива х10, с помощью программы MetaMorph 5.0 (Universal Imaging).
Ангиогенез в подкожном имплантате Матригеля
Влияние МСК-ЖТ, полученных от молодых (МСК-ЖТмол) и старых (МСК-ЖТстар) животных, на рост кровеносных сосудов in vivo оценивали на модели ангиогенеза в подкожных имплантатах Матригеля, введенных старым мышам в возрасте 18 мес. (n = 3), как описано нами ранее [33].
Статистический анализ
Статистическую обработку результатов выполняли с использованием пакета статистических программ SigmaStat 9.0. При подтверждении нормальности распределения признака критериями Колмогорова — Смирнова и Шапиро — Уилка для сравнения двух независимых групп использовали t- критерий Стьюден-та, в противоположном случае применяли непараметрический метод — U-критерий Манна — Уитни. Для сравнения зависимых групп использовали парный t- критерий Стьюдента для нормально распределенных выборок и критерий Вилкоксона для парных сравнений в случае выборок с распределением, отличным от нормального. Для сравнения трех и более независимых групп использовали при нормальном распределении признака параметрический однофакторный анализ вариаций (ANOVA), в случае несоответствия распределений признаков закону нормальности применяли ранговый анализ вариаций по Краскелу — Уоллису. Данные в тексте и на графиках
представлены в виде среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM) или как медиана (25-й и 75-й про-центили), если не указано иначе. Различия считали статистически значимыми при уровне значимости p < 0,05.
Результаты
Способность МСК-ЖТ мышей стимулировать
ангиогенез in vitro и in vivo снижается с возрастом
Ангиогенный потенциал МСК-ЖТмол и МСК-ЖТстар сравнивали по способности стимулировать васкуляризацию имплантатов Матригеля, введенных подкожно старым мышам (18 мес.). С помощью двойного иммунофлуоресцентного окрашивания срезов Матригеля на маркеры эндотелия сосудов CD31 и перицитов NG2 (рис. 1Б) было установлено, что МСК-ЖТстар в меньшей степени стимулировали васкуляризацию подкожных имплантатов Матригеля, чем МСК-ЖТмол, однако различия наблюдали на уровне тенденции — без статистической значимости (плотность сосудов 954 (759; 1020) и 1379 (1109; 1517) соответственно, p = 0,091; плотность капилляров — СD31+-образований без просвета или длиной менее 20 мкм — 523 (455; 531) и 979 (688; 1087) соответственно, р = 0,069) (рис. 1А).
На модели образования капилляроподобных структур эндотелиальными клетками на Матригеле in vitro мы обнаружили, что кондиционированная среда от МСК-ЖТстар стимулировала формирование тубулярных структур достоверно в меньшей степени (р = 0,01), чем среда от МСК-ЖТмол (рис. 2А, Б). Гипоксия приводила к повышению общей длины образованных тубулярных структур, причем в схожей степени в случаях «старых» и «молодых» клеток (13±3% для МСК-ЖТмол, 11 ±4% для МСК-ЖТстар).
При старении изменяется профиль экспрессии генов, кодирующих ангиогенные факторы МСК-ЖТ, культивированных в стандартных или гипоксических условиях
Ранее нами было показано, что в МСК-ЖТ, полученных от старых животных, происходят изменения, характерные для стареющих клеток: укорочение те-ломер, снижение скорости пролиферации, усиление оксидативного стресса (повышение продукции активных форм кислорода и N0 и снижение экспрессии глутатион-пероксидазы) [38].
Поскольку предполагается, что способность МСК-ЖТ стимулировать рост кровеносных сосудов обусловлена в значительной степени продукцией па-ракринных факторов, мы проанализировали профиль экспрессии генов факторов, регулирующих процессы ангиогенеза, в МСК-ЖТ животных разного возраста. Мы обнаружили, что экспрессия УБЭБ в 2 раза снижалась с возрастом, были найдены статистически значимые различия между данным показателем для МСК-ЖТ, полученных от животных в возрасте 1—2 мес., и МСК-ЖТ мышей в возрасте 12, 18 и 24 мес., а между последними двумя группами не было обнаружено достоверных различий (рис. 3А). С возрастом также наблюдалось постепенное снижение экспрессии плацентарного фактора роста (РЮБ) — более чем в 4 раза (рис.ЗА). Однако экспрессия ИЭР была в 3 раза выше в группах взрослых и старых животных по сравнению с молодыми (рис. ЗА).
Ранее нами было показано, что инкубация МСК-ЖТ в условиях гипоксии вызывает повышение содержание белка И1Б-1а в этих клетках и активацию экспрессии генов факторов роста, стимулирующих ангиогенез [23, 32, 33]. Гипоксия стимулировала экспрессию УБЭБ, причем ответ клеток на нее также
А
Q.
<
ша
О (Q ^ W
> 2 о а о о « л о ч to «о
И
* ц ф £ о Ф z w
0 (V
га о-S о
1 2 О х
if
га
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
МСК-ЖТмол МСК-ЖТстар МСК-ЖТмол МСК-ЖТстар Всего сосудов Капилляры
Рис. 1. Количество кровеносных сосудов в подкожном имплантате Матригеля, рост которых стимулирован МСК-ЖТ:
А - оценка количества 0031+-образований на срезах имплантатов Матригеля [п = 3, по 5 срезов на образец], данные представлены в виде медианы [10-й, 90-й процентили]; ** - 0,05 < р < 0,1; Б - имплантаты Матригеля, содержащие МСК-ЖТмол и МСК-ЖТстар; иммуногистохимическое окрашивание на маркеры эндотелиоцитов [0031, зеленый] и перицитов [N02, красный]. Ув. х40
зависел от возраста доноров: в случае МСК-ЖТстар стимуляция экспрессии УБЭБ в условиях гипоксии была выражена слабее по сравнению с МСК-ЖТмол и МСК-ЖТвзр (рис. 3Б). Гипоксия приводила к выраженному повышению экспрессии РЮБ, но в группе
самых старых животных (24 мес., п = 7) эта реакция была достоверно снижена (рис. 3Б). Изменение экспрессии ИЗБ в условиях гипоксии было менее выражено у клеток старых мышей по сравнению с МСК-ЖТмол (рис. 3Б).
А
25000
20000
а 2
т *
s S
ц
ч
к
га
3
ю
О
15000
10000
5000
0% ФБС
20% ФБС МСК-ЖТмол МСК-ЖТстар
Рис. 2. Капилляроподобные структуры, образованные эндотелиоцитами под действием культуральных и кондиционированных МСК-ЖТ сред:
А - ангиогенная активность суммарных продуктов секреции МСК-ЖТ in vitro. Кондиционированную среду от МСК-ЖТ добавляли к эндотелиоцитам пупочной вены человека (HUVEC), формирующим капилляроподобные структуры на Матригеле; ФБС - фетальная бычья сыворотка; *- р < 0,05; Б - культуры HUVEC. Образование капилляроподобных структур под действием ангиогенных продуктов МСК-ЖТ. Ув. х 10
А 0,05
0,04
.ед. 0,03
.н О 0,02
0,01
0
В 0,2
0,15
.д е
.н о 0,1 -
0,05
0
Г 0,1
0,08
.д е 0,06
.н т о 0,04
0,02
0
Гипоксия/нормоксия
VEGF
PIGF
HGF
VEGF
PIGF
uPA
uPAR
MMP2
MMP9
PAI-1
ENDS
TBS1
-г * * 8 6 *1 # h=- А
1 "1 | ■ 0 -н “±" ■ і 1-і —* =tid
HGF
[] 1-2 мес. П 12 мес.
I I 18 мес. ■ 24 мес.
Рис. 3. Влияние гипоксии на экспрессию МCК-ЖT мышей разного возраста генов факторов, регулирующих ангиогенез. Содержание мРНК факторов роста определяли с помощью ПЦР в реальном времени: VEGF - сосудистый эндотелиальный фактор роста; PIGF - плацентарный фактор роста; HGF - фактор роста гепатоцитов; uPA - урокиназа; uPAR - урокиназный рецептор; MMP-2 и MMP-9 - матриксные металлопротеиназы-2 и 9 типов; PAI-1 - ингибитор активатора плазминогена-1; ENDS - эндостатин; TBS1 - тромбоспондин 1: *- р < 0,05
0
Помимо ангиогенных факторов роста, в процессы ангиогенеза вовлечены факторы, регулирующие направленную миграцию клеток и включение их в состав стенок образующихся сосудов, а также ремоделирование внеклеточного матрикса, такие как урокиназа (uPA) и её рецептор (uPAR), ингибитор активатора плазминогена-1 (PAI-1), ма-триксные металлопротеиназы-2 и 9 (MMP-2 и ММР-9). Уровень экспрессии MMP-2 и MMP-9 был существенно повышен (в 3 и 5 раз, соответственно) в клетках животных в возрасте 18 мес., но снижен в группе мышей 24 мес. (рис. 3В). Экспрессия uPAR была повышена в МСК-ЖТстар, однако наименьший уровень показателя был характерен не для МСК-ЖТмол, а для МСК-ЖТвзр (рис. 3В). Содержание мРНК uPA было статистически значимо снижено только в клетках мышей в возрасте 12 мес. (рис. 3В). Гипоксия приводила к снижению экспрессии данных факторов, хотя наблюдалось незначи-
тельное повышение содержания мРНК ММР-2 и ММР-9 в клетках мышей в возрасте 12 мес., а экспрессия uPAR повышалась в МСК-ЖТмол.
Экспрессия ингибиторов ангиогенеза (эндоста-тина (ENDS) и тромбоспондина 1 (TBS1)), а также PAI-1 (в малых концентрациях — стимулятор, в больших — ингибитор ангиогенеза) была снижена в МСК-ЖТвзр, но повышена в клетках старых мышей, хотя статистически значимые различия с клетками молодых животных были получены только для PAI-1 (рис. 3Г). Гипоксия приводила к снижению экспрессии антиангиогенных факторов во всех возрастных группах.
Ангиогенный потенциал МСК-ЖТ человека, полученных от доноров разного возраста Анализ профиля экспрессии в МСК-ЖТ различных факторов, принимающих участие в ангиогенезе (VEGF, PIGF, HGF, ангиопоэтин 1 типа (ANGP1)),
VEGF
PIGF
0,000
0,0020 0,0018 0,0016 0,0014 .0,0012 f 0,0010 і 0,0008 1 0,0006 0,0004 0,0002
0,0000
0,006
0,000
Младше 12 лет 35-48 лет Старше 60 лет Возраст пациентов
НОР
Младше 12 лет 35-48 лет Старше 60 лет Возраст пациентов
ENDS
Младше 12 лет 35-48 лет Старше 60 лет Возраст пациентов
Младше 12 лет 35-48 лет Старше 60 лет Возраст пациентов
ЛЫОР1
Младше 12 лет 35-48 лет Старше 60 лет Возраст пациентов
ТВБ1
Младше 12 лет 35-48 лет Старше 60 лет Возраст пациентов
Рис. 4. Экспрессия генов факторов, регулирующих ангиогенез, в МCК-ЖTлюдей разных возрастных групп.
Содержание мРНК факторов роста определяли с помощью ПЦР в реальном времени: VEGF - сосудистый эндотелиальный фактор роста; PIGF - плацентарный фактор роста; HGF - фактор роста гепатоцитов; ANGP1 - ангиопоэтин 1 типа;
ENDS - эндостатин; TBS1 - тромбоспондин-1. Данные представлены в виде медианы [10-й, 90-й процентили].
*-р < 0,05; **-0,05 <р < 0,1
выявил тенденцию к снижению их продукции с возрастом, однако уровня статистической значимости достигли только различия между пациентами разных возрастных групп по содержанию мРНК PIGF и ANGP1 (рис. 4).
Согласно нашим данным, уровень секретируемо-го в среду культивирования VEGF значимо снижался с возрастом и составлял в среднем 45,05, 11,47 и 7,86 нг/млн клеток, а HGF — 3,71, 2,20 и 0,85 нг/млн клеток для МСК-ЖТ младшей, средней и старшей
возрастных групп соответственно (рис. 5). Стоит отметить, что экспрессия некоторых ингибиторов ангиогенеза — ENDS и TBS1 — также снижалась в МСК-ЖТ доноров среднего возраста по сравнению с младшей возрастной группой (см. рис. 4).
Содержание мРНК компонентов протеолитиче-ских систем, таких как uPAR, PAI-1, MMP-2, MMP-9, увеличивалось с возрастом, хотя небольшой объем выборки не позволяет сделать однозначные выводы о характере этих изменений (рис. 6).
ГО
а *
н
■ о ъ
. S I
160
140
120
100
80
60
40
20
0
VEGF
RAI-1
Младше 12 лет 35-48 лет Старше 60 лет Возраст доноров
ч
О)
а
О)
ю
i I
■ о ъ
Младше 12 лет 35-48 лет Старше 60 лет Возраст доноров
Рис. 5. Уровень секреции VEGF и HGF МСК-ЖТ людей разных возрастных групп.
Содержание VEGF и HGF в кондиционированной среде от МСК-ЖТ, собранной за 48 ч, определяли методом ELISA. Данные представлены в виде медианы (10-й, 90-й процентили). *- р < 0,05; **- 0,05 < р < 0,1
uPAR
RAI-1
Возраст пациентов
Возраст пациентов
100
80
60
40
20
MMP2
MMP9
5
4
3
2
1
0
0
Младше 12 лет 35-48 лет Старше 60 лет Младше 12 лет 35-48 лет Старше 60 лет
Возраст пациентов Возраст пациентов
Рис. 6. Экспрессия генов, кодирующих компоненты протеолитических систем (урокиназной системы и системы матриксных металлопротеаз] в МСК-ЖТ людей разных возрастных групп. Содержание мРНК компонентов системы протеаз определяли с помощью ПЦР в реальном времени: иРАЙ - урокиназный рецептор; РА1-1 - ингибитор активатора плазминогена;
ММР2 и ММР9 - матриксные металлопротеиназы 2 и 9 типов. Данные представлены в виде медианы (10-й, 90-й процентили]. * - р < 0,05, ** - 0,05 < р < 0,1
Обсуждение
Стволовые клетки опосредуют физиологическое обновление и регенерацию тканей организма в течение всей жизни. Возможно, что снижение способности организма к регенерации с возрастом обусловлено изменением функциональной активности стволовых и прогениторных клеток. В данном исследовании мы показали, что с возрастом способность МСК-ЖТ стимулировать рост кровеносных сосудов снижается, по-видимому, в результате изменения профиля экспрессии генов, кодирующих факторы регуляции ангиогенеза.
Подавление функциональной активности клеток-предшественниц при старении может быть обусловлено несколькими механизмами, включая укорочение длины теломер и снижение активности теломеразы [39], ослабление антиоксидантной защиты клеток и/или увеличение оксидативного стресса [40], необратимую модификацию белков, а также нарушение репарации геномной ДНК и изменение паттерна ее метилирования [2].
Так, с возрастом уменьшается количество МСК костного мозга [4, 41, 42], снижаются их пролиферативная активность и дифференцировочный потенциал [1, 2, 5]. В отличие от костного мозга, количество МСК-ЖТ, оцененное с помощью проточной цитофлуорометрии, не уменьшается с возрастом [43, 44],однако происходит подавление клоногенной способности, пролиферации [31, 45, 46] и дифферен-цировочного потенциала [28, 43, 47] этих клеток. Ранее нами было показано, что в МСК-ЖТ старых животных происходят изменения, характерные для стареющих клеток: укорочение теломер, снижение скорости пролиферации, усиление оксидативно-го стресса (повышение продукции активных форм кислорода и NO и снижение экспрессии глутатион-пероксидазы), а также повышается способность этих клеток к остеогенной дифференцировке [38].
Мы обнаружили, что старение вызывает подавление ангиогенной активности МСК-ЖТ. Похожий результат был получен для МСК костного мозга [48]. Регенераторный потенциал МСК-ЖТ опосредован секрецией паракринных факторов [6, 7, 12, 23, 24], поэтому мы проанализировали экспрессию генов ангиогенных факторов в МСК-ЖТ старых мышей и установили, что содержание мРНК VEGF и PIGF в этих клетках было меньше, чем в МСК-ЖТмол. Показано, что профиль экспрессии генов в МСК изменяется при старении. Так, в МСК костного мозга мышей 2, 8 и 26 мес различаются по экспрессии более 8000 генов [49]. Наши результаты также согласуются с данными о том, что при старении экспрессия VEGF МСК костного мозга [48] и его продукция МСК-ЖТ [30] снижаются.
Снижение экспрессии в МСК ангиогенных факторов, включая VEGF и трансформирующий фактор роста-p, с возрастом сопровождается увеличением экспрессии ингибиторов ангиогенеза, таких как TBS2 [50], TBS1 и PAI-I [51], что вполне согласуется с нашими результатами. В МСК-ЖТ, полученных как от пациентов старше 60 лет, так и от мышей в возрасте 18 мес., была обнаружена повышенная экспрессия генов факторов, вовлеченных в ремоделирование внеклеточного матрикса, таких как uPAR, MMP2, ММР9 и PAI-1, по сравнению с клетками от молодых доноров. Это может свидетельствовать об увеличении «инвазивных» и миграционных свойств
прогениторных клеток с возрастом. На кератиноци-тах человека было показано, что активация системы uPA/uPAR в мигрирующих клетках сопряжена с повышением экспрессии опухолевого супрессора р16/^К4а, который является маркером старения отдельных клеток и организма в целом [52]. Следует также учитывать, что старение оказывает негативное влияние на способность МСК синтезировать компоненты внеклеточного матрикса [5], что в сочетании с усилением активности клеточных протеаз может приводить к модификации околоклеточного микроокружения. В клетках от самых старых животных экспрессия вышеописанных факторов, за исключением РА1-1, снижается, что может быть обусловлено резким замедлением регенераторных процессов в ходе старения, обнаруженным у многих организмов.
Участие РА1-1 в изменении ангиогенеза при старении может быть неоднозначным. РА1-1 является мишенью р53 [53] и играет важную роль в регуляции миграции клеток, сигнальных путей факторов роста, развития фиброза [54] и нарушения фибринолиза, обусловливая тем самым патогенез заболеваний, ассоциированных с возрастом [55]. Наши результаты
об изменении экспрессии РА1-1 с возрастом хорошо согласуются с данными об увеличении РА1-1 в печени и жировой ткани крыс [56] и фибробластов человека [57] при старении. Эффект РА1-1 на ангиогенез, по некоторым данным, дозозависимый: в физиологических концентрациях (до 100 нг/мл) он действует как ангиогенный и туморогенный фактор, а в более высоких — как ингибитор ангиогенеза [58, 59]. В связи с этим необходимо определить, как меняется с возрастом концентрация РА1-1 в кондиционированной среде МСК-ЖТ и каков его вклад в ухудшение ангиогенного потенциала стареющих МСК-ЖТ.
Мы также показали, что возраст может оказывать влияние на экспрессию и продукцию факторов, регулирующих ангиогенез, в МСК-ЖТ человека. Однако представляется крайне затруднительным подобрать сравнимые между собой группы доноров, которые различались бы только по возрасту. Множество других факторов, включая пол донора, наличие у него избыточной массы тела и хронических заболеваний, может влиять на свойства прогениторных клеток.
Мы обнаружили, что ответ на гипоксию МСК-ЖТ старых животных выражен слабее. Схожие результаты были получены для МСК костного мозга старых животных, которые реагировали на культивирование в условиях аноксии и последующую реоксигенацию в меньшей степени, чем клетки молодых животных [48]. Усиление пролиферации МСК-ЖТ старых крыс и секреция этими клетками УБОБ в ответ на гипоксию также были менее выражены по сравнению с клетками молодых животных [30]. Ослабление ответа МСК на гипоксию может быть обусловлено нарушением стабилизации ИIБ-1 а. Так, уменьшение содержания белка И1Б-1а и его транскрипционной активности при старении вызывало подавление экспрессии УБОБ в ответ на гипоксию в гладкомышечных клетках аорты кроликов [60]. Снижение стабильности И1Б-1а с возрастом может быть обусловлено усилением экспрессии ферментов, ответственных за его деградацию, а также нарушением транспорта И1Б-1а в ядро в результате снижения экспрессии импортина-а [61].
Таким образом, при старении способность МСК-ЖТ стимулировать ангиогенез снижается. Наши данные указывают на необходимость разработки методов
предтрансплантационной стимуляции аутогенных МСК-ЖТ у пациентов старшего возраста либо использования для таких пациентов донорских клеток.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Fehrer C., Lepperdinger G. Mesenchymal stem cell aging. Exp. Gerontol. 2005; 40: 926—30.
2. Sethe S., Scutt A., Stolzing A. Aging of mesenchymal stem cells. Ageing Res. Rev. 2006; 5: 91—116.
3. Stolzing A., Sethe S., Scutt A.M. Stressed stem cells: temperature response in aged mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 2006; 15: 478-87.
4. Katsara O., Mahaira L.G., Iliopoulou E.G. et al. Effects of donor age, gender and in vitro cellular aging on the phenotype, functional and molecular characteristics of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 2011; in press.
5. Sun Y., Li W., Lu Z. et al. Rescuing replication and osteogenesis of aged mesenchymal stem cells by exposure to a young extracellular matrix. FASEB 2011; 25(5): 1474-85.
6. Парфенова Е.В., Цоколаева З.И., Трактуев Д.О. и др. Поиск новых «инструментов» для терапевтического ангиогенеза. Молекулярная медицина 2006; 2: 10-23.
7. Gimble J.M., Katz A.J., Bunnell B.A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ. Res. 2007; 100: 1249-60.
8. Planat-Benard V., Silvestre J.S., Cousin B. et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation 2004; 109: 656-63.
9. Rehman J., Traktuev D., Li J. et al. Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells. Circulation 2004; 109: 1292-8.
10. Cao Y., Sun Z., Liao L. et al. Human adipose tissue-derived stem cells differentiate into endothelial cells in vitro and improve postnatal neovascularization in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005; 332: 370-9.
11. Moon M.H., Kim S.Y., Kim Y.J. et al. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells improve postnatal neovascularization in a mouse model of hindlimb ischemia. Cell Physiol. Biochem. 2006; 17: 279-90.
12. Nakagami H., Morishita R., Maeda K. et al. Adipose tissue-derived stromal cells as a novel option for regenerative cell therapy. J. Atheroscler. Thromb. 2006; 13: 77-81.
13. Sumi M., Sata M., Toya N. et al. Transplantation of adipose stromal cells, but not mature adipocytes, augments ischemia-induced angiogenesis. Life Sci. 2007; 80: 559-65.
14. Kondo K., Shintani S., Shibata R. et al. Implantation of adipose-derived regenerative cells enhances ischemia-induced angiogenesis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2009; 29: 61-6.
15. Miyahara Y., Nagaya N., Kataoka M. et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat. Med. 2006; 12: 459-65.
16. Yamada Y., Wang X.D., Yokoyama S. et al. Cardiac progenitor cells in brown adipose tissue repaired damaged myocardium. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006; 342: 662-70.
17. Valina C., Pinkernell K., Song, Y.H. et al. Intracoronary administration of autologous adipose tissue-derived stem cells improves left ventricular function, perfusion, and remodelling after acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 2007; 28: 2667-77.
18. Li B., Zeng Q., Wang H. et al. Adipose tissue stromal cells transplantation in rats of acute myocardial infarction. Coron. Artery Dis. 2007; 18: 221-7.
19. Zhang D.Z., Gai L.Y., Liu H.W. et al. Transplantation of autologous adipose-derived stem cells ameliorates cardiac function in rabbits with myocardial infarction. Chin. Med. J. 2007; 120: 300-7.
20. Mazo M., Planat-Benard V., Abizanda G. et al. Transplantation of adipose derived stromal cells is associated with functional improvement in a rat model of chronic myocardial infarction. Eur. J. Heart Fail. 2008; 10: 454-62.
21. Schenke-Layland K., Strem B.M., Jordan M.C. et al. Adipose tissue-derived cells improve cardiac function following myocardial infarction. J. Surg. Res. 2009; 153: 217-23.
22. Cai L., Johnstone B.H., Cook T.G. et al. IFATS collection: human adipose tissue-derived stem cells induce angiogenesis and nerve sprouting following myocardial infarction, in conjunction with potent preservation of cardiac function. Stem Cells 2009; 27: 230-7.
23. Rubina K., Kalinina N., Efimenko A. et al. Adipose stromal cells stimulate angiogenesis via promoting progenitor cell differentiation, secretion of angiogenic factors, and enhancing vessel maturation. Tissue Eng. Part A. 2009; 15: 2039-50.
24. Madonna R., De Caterina R. Adipose tissue: a new source for cardiovascular repair. J. Cardiovasc. Med. 2010; 11: 71-80.
25. Rangappa S., Fen C., Lee E.H. et al. Transformation of adult mesenchymal stem cells isolated from the fatty tissue into cardiomyocytes. Ann. Thorac. Surg. 2003; 75: 775-9.
Работа выполнена при финансовой поддержке МНТЦ (проект № 3808) и Государственного контракта ГК 02.740.11.0307 от 7 июля 2009 г.
26. Miranville A., Heeschen C., Sengenes C. et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation 2004; 110: 349-55.
27. Madonna R., Cellini C., Renna F. et al. Age-dependent impairment of number and angiogenic potential of adipose tissue-derived progenitor cells. Eur. Heart J. 2008; 29: 4301.
28. Zhu M., Kohan E., Bradley J. et al. The effect of age on osteogenic, adipogenic and proliferative potential of female adipose-derived stem cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 2009; 3: 290-301.
29. Bujak M., Kweon H.J., Chatila K. et al. Aging-related defects are associated with adverse cardiac remodeling in a mouse model of reperfused myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 2008; 51: 1384-92.
30. El-Ftesi S., Chang E.I., Longaker M.T. et al. Aging and diabetes impair the neovascular potential of adipose-derived stromal cells. Plast. Reconstr. Surg. 2009; 123: 475-85.
31. Huang S.C., Wu T.C., Yu H.C. et al. Mechanical strain modulates age-related changes in the proliferation and differentiation of mouse adipose-derived stromal cells. BMC Cell Biology 2010; 11: 18.
32. Калинина Н.И., Ефименко А.Ю., Старостина Е.Е. и др. Гипоксия как основной активатор ангиогенеза и роста жировой ткани. Росс. Физиол. Ж. им. И.М. Сеченова. 2009; 95(3): 283-9.
33. Ефименко А.Ю., Старостина Е.Е., Рубина К.А. и др. Влияние гипоксии и воспалительных факторов на жизнеспособность и ангиогенную активность мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани и костного мозга. Цитология 2010; 52(2): 144-54.
34. Thangarajah H., Vial I.N., Chang E. et al. IFATS Series: Adipose stromal cells adopt a proangiogenic phenotype under the influence of hypoxia. Stem Cells 2008; 27: 266-74.
35. Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P. et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 2002; 13: 427995.
36. Ohnishi S., Yasuda T., Kitamura S. et al. Effect of hypoxia on gene expression of bone marrow-derived mesenchymal stem cells and mononuclear cells. Stem Cells 2007; 25: 1166-77.
37. Potier E., Ferreira E., Andriamanalijaona R. et al. Hypoxia affects mesenchymal stromal cell osteogenic differentiation and angiogenic factor expression. Bone 2007; 40: 1078-87.
38. Efimenko A.Yu., Starostina E.E., Kalinina N.I. et al. Angiogenic properties of aged adipose derived mesenchymal stem cells after hypoxic conditioning. J. Transl. Med. 2011; 9: 10.
39. Flores I., Blasco M. A. The role of telomeres and telomerase in stem cell aging. FEBS Lett. 2010; 584: 3826-30.
40. Dasgupta J., Kar S., Liu R. et al. Reactive oxygen species control senescence-associated matrix metalloproteinase-1 through c-Jun-N-terminal kinase. J. Cell Physiol. 2010; 225: 52-62.
41. Baxter M.A., Wynn R.F., Jowitt S.N. et al. Study of telomere length reveals rapid aging of human marrow stromal cells following in vitro expansion. Stem Cells 2004; 22: 675-82.
42. Stolzing A., Jones E., McGonagle D. et al. Age-related changes in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: consequences for cell therapies. Mech. Ageing Dev. 2008; 129: 163-73.
43. de Girolamo L., Lopa S., Arrigoni E. et al. Human adipose-derived stem cells isolated from young and elderly women: their differentiation potential and scaffold interaction during in vitro osteoblastic differentiation. Cytotherapy 2009; 11(6): 793-803.
44. Harris L.J., Zhang P., Abdollahi H. et al. Availability of adipose-derived stem cells in patients undergoing vascular surgical procedures. J. Surg. Res. 2010; 163(2): e105-12.
45. van Harmelen V., Skurk T., Hauner H. Primary culture and differentiation of human adipocyte precursor cells. Methods Mol. Med. 2005; 107: 125-35.
46. Schipper B.M., Marra K.G., Zhang W. et al. Regional anatomic and age effects on cell function of human adipose-derived stem cells. Ann. Plast. Surg. 2008; 60: 538-44.
47. Khan W.S., Adesida A.B., Tew S.R., et al. The epitope characterisation and the osteogenic differentiation potential of human fat pad-derived stem cells is maintained with ageing in later life. Injury 2009; 40: 150-7.
48. Jiang S., Kh Haider H., Ahmed R.P. et al. Transcriptional profiling of young and old mesenchymal stem cells in response to oxygen deprivation and reparability of the infarcted myocardium. J. Mol. Cell Cardiol. 2008; 44: 582-96.
49. Wilson A., Shehadeh L.A., Yu H. et al. Age-related molecular genetic changes of murine bone marrow mesenchymal stem cells. BMC Genomics 2010; 11: 229.
50. Sadoun E., Reed M.J. Impaired angiogenesis in aging is associated with alterations in vessel density, matrix composition, inflammatory response, and growth factor expression. J. Histochem. Cytochem. 2003; 51: 1119-30.
51. Olson B.A., Day J.R., Laping N.J. Age-related expression of renal thrombospondin 1 mRNA in F344 rats: resemblance to diabetes-induced expression in obese Zucker rats. Pharmacology 1999; 58: 200-8.
52. Darbro B.W., Schneider G.B., Klingelhutz A.J. et al. Coregulation of p16INK4A and migratory genes in culture conditions that lead to premature senescence in human keratinocytes. J. Invest. Dermatol. 2005; 125(3): 499-509.
53. Kortlever R.M., Higgins P.J., Bernards R. Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence. Nat. Cell Biol. 2006; 8: 877-84.
54. Ghosh A.K., Bradham W.S., Gleaves L.A. et al. Genetic deficiency of plasminogen activator inhibitor-1 promotes cardiac fibrosis in aged mice: involvement of constitutive transforming growth factor-beta signaling and endothelial-to-mesenchymal transition. Circulation 2010; 122(12): 1200-9.
55. Cesari M., Pahor M., Incalzi R.A. et al. Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1): a key factor linking fibrinolysis and age-related subclinical and clinical conditions. Cardiovasc. Ther. 2010; 28(5): e72-91.
56. Serrano R., Barrenetxe J., Ortie J. et aI. Tissue-specific PAI-ї gene expression and gIycosyIation pattern in insuIin-resistant oId rets. Am. J. PhysioI. ReguI. Integr. Comp. PhysioI. 200G; 2G7: R1563—G.
57. Wang S., Moerman E.J., Jones R.A. et aI. Characterization of IGFBP-3, PAI-ї and SPARC mRNA expression in senescent fibrebIasts. Mech. Ageing. Dev. 1GG6; G2: ї2ї-З2.
SB. Stefansson S., PetitcIerc E., Wong M. K. et aI. Inhibition of angiogenesis in vivo by pIasminogen activator inhibitor. J. BioI. Chem. 2ООО; 27В: B^S-^.
SG. Devy L., BIacher S., Debras C.G. et aI. The pre- or antiangiogenic effect of pIasminogen activator inhibit ї is dose dependent. FASEB 2ОО2; їВ: W-S4.
ВО. Rivaгd A., Beгthou-SouIie L., Pгincipe N. et aI. Age-dependent defect in vascuIar endotheIiaI grewth factoг expгession is associated with reduced hypoxia-inducibIe factoг ї activity. J. BioI. Chem. 2ООО; 27S: 2G643—7.
Вї. AhIuwaIia A., NaraIa J., Jones M.K. et aI. Impaired angiogenesis in aging myocardiaI microvascuIar endotheIiaI ceIIs is associated with reduced importin aIpha and decreased nuclear tгanspoгt of HIn aIpha: mechanistic impIications. J. PhysioI. PharmacoI. 2ОїО; Вї(2): їЗЗ—G.
Поступила 09.03.2011
