CC BY
105
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕИСТВ1 МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ОПУХОЛИ МЕТОДАМИ ФЛЮОРЕСЦЕНТ1 БИОИМИДЖИНГА
УДК 575.1/.2:611 -018.82:612.419 Поступила 13.07.2012 г.
А.В. Мелешина, аспирант кафедры биомедицины1;
Е.И. Черкасова, к.б.н., зав. лабораторией биоинженерии тканей1;
Е.А. Сергеева, к.ф.-м.н., научный сотрудник2;
М.С. Клешнин, младший научный сотрудник2;
И.В. Турчин, к.ф.-м.н., зав. лабораторией биофотоники2;
Е.В. Киселева, к.б.н., научный сотрудник3;
Э.В. Дашинимаев, к.б.н., научный сотрудник3;
М.В. Ширманова, к.б.н., научный сотрудник4;
СА Лукьянов, д.б.н., академик РАН, зав. лабораторией молекулярных технологий5;
зав. лабораторией флюоресцентного биоимиджинга4;
Е.В. Загайнова, д.м.н., зам. директора по науке НИИ ПФМ4; зав. кафедрой биомедицины1
Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского —
Национальный исследовательский университет, Н. Новгород, 603950, проспект Гагарина, 23;
2Институт прикладной физики РАН, Н. Новгород, 603155, ул. Ульянова, 46;
3Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва, 119334, ул. Вавилова, 26;
4Нижегородская государственная медицинская академия, Н. Новгород, 603005,
пл. Минина и Пожарского, 10/1;
5Институт биоорганической химии РАН им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова,
Москва, 179971, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
Цель исследования — изучение патогенеза развития опухоли при взаимодействии с мезенхимными стволовыми клетками, трансфицированными геном красного флюоресцентного белка, с применением метода прижизненного биоимиджинга.
Материалы и методы. Использовали мезенхимные стволовые клетки из клеток стромы жировой ткани (СКЖТ), выделенных из кусочков жировой ткани человека. СКЖТ были трансфицированы геном красного флюоресцентного белка Turbo FP635 (ЗАО «Евроген», Россия) методом лентивирусной трансфекции. Опухоли были привиты мышам линии nude подкожной инъекцией опухолевых клеток Hela Kyoto (рак шейки матки). Меченные флюоресцентным белком СКЖТ вводили животным на разных стадиях канцерогенеза (0 и 8 дней после прививки опухолевой культуры) различными способами: локально — в область формирования опухолевого узла и системно — внутривенно в хвостовую вену. Были сформированы следующие группы животных: 1-я — ранняя стадия канцерогенеза (сразу после инъекции) и системное введение СКЖТ; 2-я — ранняя стадия канцерогенеза и локальное введение СКЖТ; 3-я — стадия сформированной опухоли (8 дней) и системное введение СКЖТ. Контролем служили животные с привитой опухолью без введения стволовых клеток.
Результаты. СКЖТ, выделенные и охарактеризованные с помощью иммуноцитохимического анализа, имели фенотип мезенхимных стволовых клеток (экспрессировали cD105, cD49d, sTRO-1) и дифференцировались в условиях in vitro в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях при культивировании в индукционных средах. Эффективность трансфекции СКЖТ геном красного флюоресцентного белка Turbo FP635 составила 75%. Показано, что исследуемый тип стволовых клеток — СКЖТ, меченных красным флюоресцентным белком Turbo FP635, при системном введении способен мигрировать в селезенку, а при системном и местном введениях — в костный мозг, легкие и ткани опухоли реципиента. Методы флюоресцентного биоимиджинга и лазерной сканирующей микроскопии могут быть использованы для изучения взаимодействия опухоли и мезенхиальных стволовых клеток. Они эффективно дополняют друг друга в получении общих знаний о распределении мигрирующих флюоресцентных клеток.
Для контактов: Мелешина Александра Викторовна, тел. моб. +7 920-035-55-09; e-mail: almele@ya.ru
Ключевые слова: мезенхимные стволовые клетки (МСК); клетки стромы жировой ткани (СКЖТ); красный флюоресцентный белок Turbo FP635; опухоль Hela Kyoto; прижизненный биоимиджинг; лазерная сканирующая микроскопия; трансфекция; канцерогенез.
English
The study of the Interaction of Mesenchymal stem Cells and the Tumour using the Methods of Fluorescent Bioimaging
AV. Meleshina, Postgraduate, the Department of Biomedicine1;
Е.I. Cherkasova, PhD, Head of Tissue Biological Engineering Laboratory1;
ЕA sergeeva, PhD, Research Worker2;
М.S. Kleshnin, Junior Research Worker2;
I.V. Turchin, PhD, Head of Biophotonics Laboratory2;
Е.V. Kiseleva, PhD, Research Worker3;
E.V. Dashinimaev, PhD, Research Worker3;
М.V. shirmanova, PhD, Research Worker4;
sA Lukyanov, D.Bio.Sc., Academician of Russian Academy of Sciences, Head of Molecular Technologies Laboratory5; Head of Fluorescence Bioimaging Laboratory4;
Е.V. Zagaynova, D.Med.Sc., Deputy Director for Science of Scientific Research Institute of Applied and Fundamental Medicine4; Head of the Department of Biomedicine1
1Nizhny Novgorod State University named after N.I. Lobachevsky — National Research University,
Gagarin Avenue, 23, Nizhny Novgorod, Russian Federation, 603950;
2Institute of Applied Physics of Russian Academy of Sciences, Ul’yanova St., 46, Nizhny Novgorod,
Russian Federation, 603155;
3Institute of Developmental Biology named after N.K. Koltsova of Russian Academy of Sciences,
Vavilova St., 26, Moscow, Russian Federation, 119334;
4Nizhny Novgorod State Medical Academy, Minin and Pozharsky Square, 10/1, Nizhny Novgorod,
Russian Federation, 603005;
5Shemyakin and Ovchinnickov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences,
Miklukho-Maklaya St., 16/10, Moscow, Russian Federation, 179971
The aim of the investigation is to study the pathogenesis of tumour development when interacting with mesenchymal stem cells transfected by a gene of red fluorescent protein using the method of vital bioimaging.
Materials and Methods. There were used adipose-derived adult stem (ADAS) cells taken from human adipose tissue. ADAS were transfected by a gene of red fluorescent protein Turbo FP635 (Close Joint Stock Company “Eurogene”, Russia) by the method of lentiviral transfection. Tumours were implanted to nude mice by subcutaneous injection of Hela Kyoto tumour cells (cervical cancer). ADAS labeled by fluorescent protein were injected to animals at different stages of carcinogenesis (0 and 8 days after tumour culture injection) by various ways: locally — in the tumour node forming region, and systemically — intravenously, in caudal vein. There were formed the following groups of animals: 1st group — an early stage of carcinogenesis (immediately after the injection) and systemic injection of ADAS; 2nd group — an early stage of carcinogenesis and local injection of ADAS; 3rd group — the stage of developed tumour (8 days) and systemic injection of ADAS. The control group consisted of the animals with induced tumour without stem cells injection.
Results. ADAS isolated and characterized with the help of immunocytochemical analysis had the phenotype of mesenchymal stem cells (there were expressed CD105, CD49d, STRO-1) and were differentiated in vitro in adipogenic, osteogenic, and chondrogenic approaches in induction media cultivation. The efficiency of transfection of ADAS by red fluorescent protein Turbo FP635 was 75%. The stem cells under study — ADAS labeled by red fluorescent protein Turbo FP635 in systemic injection were shown to be able to migrate in spleen, and in systemic and local injection — in bone marrow, lungs, and recipient’s tumour tissues. The methods of fluorescent bioimaging and laser scanning microscopy can be used to study the interaction between the tumour and mesenchymal stem cells. They effectively complement each other in gaining general knowledge of the distribution of migratory fluorescent cells.
Key words: mesenchymal stem cells (MSC); adipose-derived adult stem (ADAS) cells; red fluorescent protein Turbo FP635; tumour Hela Kyoto; vital bioimaging; laser scanning microscopy; transfection; carcinogenesis.
В настоящее время изучение роли стволовых клеток (СК) в туморогенезе идет по двум направлениям: фундаментальная наука исследует клеточную пластичность и генетические механизмы, лежащие в основе возникновения и развития раковых заболеваний, прикладная — возможности использования СК различного происхождения для клеточной терапии при лечении и профилактике онкологических заболеваний.
При изучении различных экспериментальных моделей «опухоль-стволовая клетка» установлено, что СК способны спонтанно трансформироваться в злокачественные клетки [1] и поддерживать развитие уже существующих опухолей [2, 3]. В исследованиях на животных (in vivo) [4] показано, что СК способствуют опухолевому росту и активно участвуют в неоан-гиогенезе опухоли; в создании ниши для поддержа-
уттжтжтжтжттттжтжтжтжтттт^ттттжтттт^ттттитттттітттттг/' 8 СТМ J 2012 - 4 А.В. Мелешина, Е.И. Черкасова, Е.А. Сергеева, М.С. Клешнин, И.В. Турчин, Е.В. Киселева, ...
ния роста и жизнедеятельности опухолевых клеток; в модулировании иммунного ответа организма для снижения толерантности к неоплазии; в образовании метастазов [4].
С другой стороны, данные исследований in vitro [5] свидетельствуют, что СК также способны негативно воздействовать на рост опухолевых клеток в культуре, а именно: снижать уровень пролиферации опухолевых клеток; участвовать в апоптозе опухолевых клеток; ингибировать инвазию опухолевых клеток.
Таким образом, роль СК различного происхождения (гемопоэтических, стромальных, тканеспецифичных, мезенхимных) в онкогенезе остается предметом активных исследований. Новые знания важны как для понимания механизмов поддержания неопластического роста, так и для поиска новых подходов к терапии опухолей.
Мезенхимные СК являются предшественниками клеток тканей мезенхимального происхождения и обладают уникальными иммунными и проангиогенными свойствами. Клетки с характеристиками мезенхимных СК помимо костного мозга найдены во многих органах и тканях взрослого организма: скелетных мышцах, стенках сосудов, зубной пульпе, в жировой ткани и др. Мезенхимные СК жировой ткани (СКЖТ) не отличаются по морфологии, иммунному фенотипу и диффе-ренцировочным потенциям от таковых клеток костного мозга, однако при этом имеют несколько несомненных достоинств:
доступность и нетравматичность получения (источником являются липоаспираты жировой ткани пациента);
простота введения и поддержания в культуре;
широкий спектр возможных дифференцировок.
Для анализа участия СК в онкогенезе и наблюдения распределения их в организме реципиента, как правило, используются флюоресцентные методы биомедицинского имиджинга. Благодаря появлению ярких флюоресцирующих агентов, работающих в области «окна прозрачности» тканей, разработке технологий конъюгации и направленной доставки флюорофора, а также появлению компактных источников и высокочувствительных приемников оптического излучения методы флюоресцентного биоимиджинга помогли совершить настоящий прорыв в исследовании многих биологических процессов [6-8]. Большинство методов флюоресцентного биоимиджинга основаны на экзогенном введении флюорофора (или его предшественника) в организм (клетку) и обнаружении флюоресценции маркированных объектов в естественном окружении. В качестве маркеров (генетических меток) наибольший интерес предствляет использование флюоресцентных (GFP-подобных) белков различных групп, гены которых внедряются в исследуемые клетки (раковых линий, мезенхимных СК), что позволяет отслеживать местоположение маркированных клеток и их продуктов, а также происходящие с ними изменения [9].
Среди методов флюоресцентного биоимиджинга на первый план выходят наблюдения in vivo на уровне организма, которые открывают возможности обозревать
биологический объект в его целостности, а также продолжительно изучать функции и процессы на одном животном, учитывая индивидуальные особенности. Наиболее простой реализацией прижизненного флюоресцентного имиджинга на уровне организма является поверхностный флюоресцентный имиджинг, который дает возможность оперативно (1-2 с) оценить размеры флюоресцирующей области, находящейся вблизи поверхности исследуемого биологического объекта. Использование высокочувствительных приемников позволяет обнаруживать также глубинную флюоресценцию, при этом изображение глубинных источников флюоресценции существенно размывается из-за сильного рассеяния света биотканями.
Цель исследования. В рамках данной работы нами решались следующие задачи:
1) выделение, изучение и трансфекция красным флюоресцентным белком стромальных стволовых клеток жировой ткани;
2) изучение патогенеза развития опухоли при взаимодействии со стволовыми клетками с применением метода прижизненного поверхностного флюоресцентного имиджинга;
3) исследование миграции меченых стволовых клеток в потенциальные ниши организма.
Материалы и методы.
Клеточная культура. Использовали стромальные клетки жировой ткани, выделенные из липоаспиратов или кусочков жировой ткани человека, полученных при абдоминальной пластической операции. СКЖТ выделяли по методу Р.А. Zuk [10] с модификациями. Для выявления потенции данных клеток дифференцироваться в адипогенном, хондрогенном и остеогенном направлениях СКЖТ культивировали в соответствующих индукционных средах [10, 11]. Для определения маркеров мезенхимальных СК проведен иммуноцитохимический анализ [12]. СКЖТ были трансфицированы геном красного флюоресцентного белка Turbo FP635 (ЗАО «Евроген», Россия) методом лентивирусной трансфекции. Этот белок имеет максимум поглощения на длине волны 585 нм и пик эмиссии на длине волны 635 нм (рис. 1).
Опухолевые модели. Использованы самки бести-мусных мышей линии nude в возрасте 6 мес массой 20 г. Опухоли были привиты в левое бедро подкожной инъекцией 5 млн опухолевых клеток Hela Kyoto (рак шейки матки), суспендированных в 100 мкл фосфатносолевого буфера.
Дизайн эксперимента. Меченные флюоресцентным белком СКЖТ вводили животным на разных стадиях канцерогенеза: 0 дней (сразу после инъекции) и 8 дней после прививки опухолевой культуры. Клетки в количестве 1,5 млн были инъецированы животным различными способами: локально — в область формирования опухолевого узла и системно — внутривенно в хвостовую вену. Были сформированы следующие группы (каждая из трех животных):
1-я — ранняя стадия канцерогенеза (0 дней) и системное введение СКЖТ;
2-я — ранняя стадия канцерогенеза и локальное введение СКЖТ;
\ *
ь
' > 7 /4
1 \ , f
1 - Jr 1 -
ч N4>.-
и
7 ^ W
V 'г1
і і л
/ w r Si
\к i f1
iuY fc \’ «V Л <y^Ur
\ , t i /7 iy vvM / /
Ф4?% ■» *4. J Ml —^
7 V
V? ■ Йь V
Рис. 1. СКЖТ, трансфицированные геном белка Turbo FP635: а — флюоресцентное изображение (флюоресцентный микроскоп Olympus X71, Япония/Германия; возбуждение флюоресценции — 545-580 нм, регистрация — 610-650 нм), х10; б — спектр возбуждения и эмиссии белка Turbo FP635 (www.evrogen.ru)
3-я — стадия сформированной опухоли (8 дней) и системное введение СКЖТ;
контрольная группа — с привитой опухолью без введения СК.
Введение меченых клеток на ранних стадиях канцерогенеза было основано на предположении, что СКЖТ могут служить источником создания неопластической сосудистой сети и включаться в стромаль-ные структуры опухоли. Локальное введение СК использовали для моделирования взаимодействия тканеспецифичных СКЖТ с опухолевыми тканями в области формирования узла, системное — для моделирования взаимодействия опухоли с СКЖТ, мигрирующими из других ниш (например, костного мозга). На стадии сформированной опухоли (зрелые система кровообращения и строма) СКЖТ вводили для проверки влияния мезенхимных СК на дальнейшее развитие опухоли: усиление роста, инвазия и образование метастазов. Во всех трех группах животных предполагалось зафиксировать возможные дополнительные ниши пролиферации мезенхимных СК (костный мозг, селезенка). Также внимание уделяли органам возможного перераспределения СКЖТ в организме реципиента (легкие) и органам выведения продуктов распада (почки, печень). Опухолевый рост измеряли с помощью штангенциркуля через каждые 2-3 дня.
Расчет объема опухолей. Изменение объема опухолей рассчитывали по формуле Шрека в модификации И.С. Амосова с соавт. [13]:
У=0,5х[(а+Ь)/2]3,
где V — объем опух оли, мм3; a, Ь — разнонаправленные размеры опухоли, мм.
Мониторинг миграции меченых СКЖТ методом поверхностного флюоресцентного имиджинга.
Для прижизненного мониторинга миграции флюоресцентно-меченых клеток в организме реципиента использовали установку для поверхностного флюо-
ресцентного имиджинга, разработанную в ИПФ РАН (Н. Новгород, Россия). В ходе измерений животное помещали в «черную» камеру и освещали широким световым пучком в узком спектральном диапазоне (для возбуждения флюоресценции белка Turbo FP635 использовали излучение на длине волны 585 нм с полосой 20 нм). Флюоресценция, возбужденная на поверхности животного, регистрировалась охлаждаемой CCD-камерой (ORCA II BT-512G, Hamamatsu Photonics K.K., Япония). Для разделения флюоресценции и зондирующего излучения на объектив CCD-камеры был установлен интерференционный фильтр (Chroma Technology Co., США) с полосой пропускания 628672 нм. Время экспозиции CCD-камеры составляло 2 с. Перед проведением измерений животных наркотизировали внутрибрюшинной инъекцией Золетила (Vibrac, Франция) в концентрации 20 мг/мл и горизонтально фиксировали на подставке. Наблюдение флюоресценции белка проводили сразу после инъекции и в дальнейшем каждый день в течение 14 сут.
Наблюдение меченых СКЖТ методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (ЛСМ). Для анализа распределения меченых клеток в организме реципиента по органам ex vivo внутривенной инъекцией Золетила в концентрации 40 мг/мл животных выводили из эксперимента. Далее осуществляли забор образцов органов размером 3-4 мм и мазков костного мозга для исследования на установке ЛСМ (LSM 510 META 23, Carl Zeiss, Германия) на основе моторизированного инвертированного микроскопа (Axiovert 200M), оснащенной спектральным модулем для детектирования спектров эпифлюоресценции в видимом диапазоне с разрешением 10 нм. Конфокальные изображения были получены с помощью масляно-иммерсионного объектива с увеличением 63. Регистрация флюоресцентных изображений осуществлялась при однофотонном возбуждении аргоновым лазером на длине волны 543 нм мощностью 12 мкВт на образце.
Результаты.
Характеристика СКЖТ. Данные клетки были выделены и охарактеризованы с помощью иммуно-цитохимического анализа. Установлено, что СКЖТ имеют фенотип мезенхимных СК (экспрессируют CD105, CD49d, STRO-1) и способны дифференцироваться в условиях in vitro в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях при культивировании в индукционных средах. Для трансфекции использовались СКЖТ на ранних пассажах культивирования. Эффективность трансфекции СКЖТ геном красного флюоресцентного белка Turbo FP635 составила 75% (см. рис. 1, а).
Динамика изменений опухолей. По данным измерений линейного размера опухолей и флюоресцентного биоимиджинга в ходе работы не удалось выявить различий в динамике роста опухолей в экспериментальных моделях (как с введением, так и без введения стволовых клеток). По-видимому, экзогенное введение СКЖТ существенно не влияет на рост опухолей.
Отн. ед.
500 400 300 200 100
Рис. 2. Определение чувствительности установки поверхностного флюоресцентного биоимиджинга in vivo для визуализации СКЖТ, меченных белком Turbo FP635. Наблюдения различного количества меченых стволовых клеток, указаны места инъекций
Мониторинг миграции меченых СКЖТ методом поверхностного флюоресцентного имиджинга in vivo. С целью определения чувствительности установки для детекции меченых СК в предварительных экспериментах изучена флюоресценция подкожно инъецированных флюоресцентных клеток в разных концентрациях. Минимальное количество флюоресцентных СКЖТ, детектируемое установкой, составило 90 тыс. клеток (рис. 2).
В процессе наблюдения за животными с опухолями всех четырех групп с помощью установки для поверхностного флюоресцентного имиджинга получено 90 изображений.
В контрольной группе животных в процессе всего наблюдения роста опухолей регистрировали невысокую автофлюоресценцию тканей, обусловленную присутствием эндогенных порфириновых структур [14, 15], максимум возбуждения которых лежит в районе 400-500 нм, а спектр эмиссии имеет два пика — 635 и 690 нм. Фоновый сигнал на полученных изображениях связан с неидеальностью интерференционного фильтра, которая приводит к появлению артефактов, обусловленных неравномерным рассеянием зондирующего излучения на коже животного (пигментация и дефекты кожного покрова).
В 1-й группе (ранняя стадия онкогенеза и системное введение СКЖТ) флюоресценция меченых СКЖТ отмечена у всех животных в области селезенки, она была обнаружена на 9-й день и сохранялась до 14 сут (рис. 3). В опухолевых тканях у этих животных флюоресценции, соответствующей скоплению меченых СКЖТ, обнаружить не удалось.
Во 2-й группе животных (ранняя стадия онкогенеза и локальное введение СКЖТ) зарегистрирована флюоресценция места инъекции меченых СКЖТ, которая постепенно затухала и к 3-м суткам не визуализировалась совсем. Флюоресценции, соответствующей скоплению меченых СКЖТ в других тканях и органах животного, выявить не удалось. Время наблюдения составило 14 сут (рис. 4).
В 3-й группе животных (сформированная опухоль и системное введение СКЖТ) на 5-е сутки обнару-
Рис. 3. Мониторинг миграции флюоресцентно-меченых СКЖТ методом флюоресцентного биоимиджинга у животных 1-й группы (ранняя стадия канцерогенеза, системное введение СКЖТ). Сплошной линией указано место инъекции опухолевых клеток, пунктирной — место инъекции флюоресцентно-меченых СКЖТ, стрелками — локализация флюоресцентно-меченых СКЖТ
Рис. 4. Мониторинг миграции флюоресцентномеченых СКЖТ методом флюоресцентного био-имиджинга у животных 2-й группы (ранняя стадия канцерогенеза, локальное введение СКЖТ). Квадратом указано место инъекции опухолевых клеток, пунктирной линией — место инъекции флюоресцентно-меченых СКЖТ, пунктирной стрелкой — флюоресценция места инъекции
Рис. 5. Результаты конфокальной лазерной сканирующей микроскопии СКЖТ, меченных белком ТигЬо FP635: а — флюоресцентное изображение клеток (возбуждение флюоресценции 543 нм, регистрация 650-710 нм); б — соответствующий им спектр флюоресценции в диапазоне 597-694 нм, х40
жена флюоресценция СКЖТ в области селезенки. Отмечалось нарастание флюоресценции в последующие дни (вплоть до 10-х суток) аналогично первой группе. Флюоресценции меченых СКЖТ в опухолевом узле и нишах не выявлено.
Мониторинг миграции меченых СКЖТ методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Для верификации результатов, полученных методом поверхностного флюоресцентного имиджинга, был использован метод ЛСМ. Для получения контрольного спектра белка ТигЬо РР635 на установке ЛСМ анализировали спектральные характеристики культуры СКЖТ, экспрессирующей этот белок, для дальнейшего сравнения со спектрами тканей исследуемых органов. В отличие от спектра очищенного плазмидного белка ТигЬо РР635 (см. рис. 1, б) полученный спектр клеток, трансфицированных генным вектором этого белка, имел два выраженных пика — на 613 и 635 нм (рис. 5). Появление дополнительного пика могло быть связано либо с мутацией белка при культивировании СКЖТ, либо с влиянием автофлюоресценции клеток.
В контрольной группе была оценена интенсивность
автофлюоресценции органов и тканей опухоли при возбуждении лазерным излучением на длине волны 543 нм. Установлено, что в коже, мышцах, сердце, мозге, легких, кишечнике и опухолевой ткани автофлюоресценция крайне низкая, однако в тканях селезенки, почек и печени она выражена (рис. 6), при этом спектральные характеристики тканей отличаются от спектра флюоресцентно-меченых СКЖТ и не имеют двух выраженных пиков на 613 нм и 635 нм.
В опытных группах, где животным вводили меченые СКЖТ, также отмечена выраженная автофлюоресценция тканей селезенки, почек и печени при возбуждении лазерным излучением с длиной волны 543 нм, которая перекрывала флюоресценцию ТигЬо РР635. Однако у этих животных были обнаружены участки флюоресценции, соответствующей спектру клеток с белком ТигЬо РР635, в тканях с низким уровнем автофлюоресценции: опухоли, костном мозге и легких (рис. 7, а), что свидетельствовало о накоплении (пролиферации) меченых клеток в этих нишах.
В опухолевых тканях обнаружена флюоресценция меченых СКЖТ у животных 2-й группы (рис. 7, б). У животных других опытных групп флюоресценции, со-
//////////////////////////////////////////////////////////////////^^^^
12 СТМ | 2012 - 4 А.В. Мелешина, Е.И. Черкасова, Е.А. Сергеева, М.С. Клешнин, И.В. Турчин, Е.В. Киселева, ...
Рис. 6. Результаты конфокальной лазерной сканирующей микроскопии тканей органов ex vivo: а — флюоресцентные изображения (возбуждение флюоресценции — 543 нм, регистрация — 650-710 нм); б — спектры флюоресценции тканей животных в диапазоне 597-694 нм из разных групп; сплошной линией указаны спектры флюоресценции тканей животных, пунктирной — спектр СКЖТ, меченных белком Turbo FP635
ответствующей скоплению меченых СКЖТ, в опухолевой ткани не выявлено.
В костном мозге обнаружены яркие скопления клеток со спектральными характеристиками меченых
СКЖТ у животных 2-й группы. Однако в костном мозге животных 1-й и 3-й групп наблюдалась только слабая автофлюоресценция.
В ткани легких найдены скопления клеток с флюо-
тшшшшшштюшштюшюмшшшжшпшшттшттштшшшшмж Исследование взаимодействия мезенхимных клеток и опухоли методами флюоресцентного биоимиджинга СТМ J 2012 - 4 13
Рис. 7. Результаты конфокальной лазерной сканирующей микроскопии тканей органов ex vivo: а — флюоресцентные изображения (возбуждение флюоресценции — 543 нм, регистрация — 650-710 нм); б — спектры флюоресценции тканей животных в диапазоне 597-694 нм из разных групп; сплошной линией указаны спектры флюоресценции тканей животных, пунктирной — спектр СКЖТ, меченных белком Turbo FP635
ресценцией, соответствующей искомому спектру, у животных 3-й группы, в остальных случаях отмечали лишь слабую автофлюоресценцию.
Обсуждение. Для изучения взаимодействия СКЖТ и опухоли, а также мониторинга миграции СКЖТ в ор-
ганизме реципиента были использованы два метода: поверхностный флюоресцентный имиджинг и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.
Методом прижизненного биоимиджинга у животных с локальным введением CKЖT удалось наблюдать пе-
///////////////////////////////////////////////////////////////////////////^^^^
14 СТМ 1 2012 - 4 А.В. Мелешина, Е.И. Черкасова, Е.А. Сергеева, М.С. Клешнин, И.В. Турчин, Е.В. Киселева, ...
рераспределение меченых СКЖТ из зоны введения. У животных-опухоленосителей с системным введением СКЖТ на ранних стадиях канцерогенеза и при сформированной опухоли флюоресценция меченых СКЖТ была зарегистрирована в области селезенки. Флюоресценция нарастала во времени, что говорит о миграции и/или размножении меченых СКЖТ в этом органе в детектируемых количествах (более 90 тыс. клеток). Полученные результаты подтвердили известные ранее данные о селезенке как о нише для СКЖТ при системном введении [16, 17].
Невозможность обнаружить иные органы накопления СК при перераспределении их внутри организма реципиента в первых трех опытных группах животных методом поверхностного флюоресцентного имиджинга обусловлена низкой интенсивностью флюоресценции меченых СКЖТ по сравнению с автофлюоресценцией тканей животного, что вызвано следующими причинами:
1) малым количеством меченых СКЖТ в соответствующих нишах;
2) глубокой локализацией ниш (например, костный мозг, легкие). Тем не менее при достаточном количестве флюоресцентно-меченых клеток и их неглубокой локализации метод поверхностного флюоресцентного имиджинга может быть применен для подобных исследований.
Методом ЛСМ флюоресцентно-меченые СКЖТ обнаружены в опухолевых тканях животных с локальным введением клеток, что может свидетельствовать о моделировании взаимодействия СК с клетками окружающих опухолевых тканей (в частности, участие в построении кровеносных сосудов опухоли). У животных с системным введением СК в области опухолей меченые СКЖТ не найдены.
Несмотря на то, что методом прижизненного поверхностного флюоресцентного имиджинга флюоресценция тканей селезенки была зарегистрирована в группах животных с системным введением мезенхимных СК, методом ЛСМ дифференцировать флюоресценцию ТигЬо РР635 не удалось. Это может быть связано с выраженной автофлюоресценцией, обусловленной присутствием большого количества эндогенных порфириновых структур, входящих в состав гемоглобина, миоглобина, ферментов каталазы, пероксидазы и многочисленной группы цитохромов. Кроме того, длина волны зондирующего излучения в установке ЛСМ (543 нм) не является оптимальной для возбуждения флюоресценции белка ТигЬо РР635. В свою очередь, в установке для поверхностного флюоресцентного имиджинга возбуждение флюоресценции меченых СКЖТ осуществлялось на длине волны 585 нм, вследствие чего флюоресценцию СКЖТ, меченных ТигЬо РР635, удалось обнаружить на фоне автофлюоресценции органа.
Неожиданным результатом эксперимента оказалось присутствие меченых СКЖТ в костном мозге животных с локальным введением СКЖТ на ранней стадии канцерогенеза, тогда как в костном мозге животных других групп данные клетки не найдены.
У животных с системным введением СКЖТ на стадии сформированной опухоли выявлено еще одно мес-
то локализации меченых СКЖТ — легкие. Как известно, в подобных экспериментальных моделях легкие животных выступают в качестве пункта премиграции, где системно введенные СК накапливаются к 3-4-му дню после инъекции, а к 7-му дню эксперимента перераспределяются в организме реципиента. Вероятно, в нашем случае была обнаружена часть популяции СКЖТ и их потомков, которые не покинули ткани легких и к 14-му дню эксперимента.
Заключение. Методы флюоресцентного биоимид-жинга и лазерной сканирующей микроскопии могут быть использованы для изучения взаимодействия опухоли и мезенхимных стволовых клеток. Они эффективно дополняют друг друга в получении общих знаний о распределении мигрирующих флюоресцентных клеток. Исследуемый тип клеток — стволовые клетки жировой ткани, — меченных геном красного флюоресцентного белка Turbo FP635, при системном введении способен мигрировать в селезенку, а при системном и местном введении — в костный мозг, легкие и ткани опухоли реципиента.
Работа выполнена при поддержке проекта РФФИ №11-
02-01199 «Флуоресцентный биоимиджинг системы «опу-холь-стволовая клетка» и гранта Правительства РФ для поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых (договор №11 G34.31.0017 от 24 ноября 2010 г.), «Флуоресцентные белки: новые подходы к изучению механизмов физиологических и патологических процессов в живых системах».
Литература
1. Houghton J., Stoicov C., Nomura S., Rogers A.B., Carlson J., Li H., Cai X., Fox J.G., Goldenring J.R., Wang T.C. Gastric са™^ originating from bone marrow-derived cells. Science 2004; 306: 15681571.
2. Annabi B., Naud E., Lee Y.-T., Eliopoulos N., Galipeau J. Vascular progenitors derived from murine bone marrow stromal cells are regulated by fibroblast growth factor and are avidly recruited by vascularizing tumors. Journal of Cellular Biochemistry 2004; 91: 1146-1158.
3. Sell S. Stem cell origin of cancer and differentiation therapy. Crit Rev Oncol Hematol 2004; 51: 1-28.
4. Bhowmick N.A., Neilson E.G., Moses H.L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature 2004; 432: 332-337.
5. Li L., Tian H., Yue W., Zhu F., Li S., Li W. Human mesenchymal stem cells play a dual role on tumor cell growth in vitro and in vivo. Journal of Cellular Physiology 2010; 226: 1860-1867.
6. Chen J., Tung C.H., Mahmood U., Ntziachristos V., Gyurko R., Fishman M.C., Huang P.L., Weissleder R. In vivo imaging of proteolytic activity in atherosclerosis. Circulation 2002; 105(23): 2766-2771.
7. Detter C., Wipper S., Russ D., Iffland A., Burdorf L., Thein E., Wegscheider K., Reichenspurner H., Reichart B. Fluorescent сardiac imaging. A Novel intraoperative method for quantitative assessment of myocardial perfusion during graded coronary artery stenosis. Circulation 2007; 116: 1007-1014.
8. Haller J., Hyde D., Deliolanis N. Visualization of pulmonary inflammation using noninvasive fluorescence molecular imaging. J Appl Physiol 2008; 104: 795-802.
9. Морозов Е.С., Верхуша В.В., Перский Е.Э. Флюоресцентные белки красной спектральной области. Вестн Харьк Национ университета им. Каразина. Серия Биология 2009; 9(856): 29-38.
10. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Eng 2001; 7: 211-228.
11. DeUgarte D.A., Morizono K., Elbarbary A. Comparison of multi-lineage cells from human adipose tissue and bone marrow. Cells Tissues Organs 2003; 174: 101-109.
12. Lee R.H., Kim B., Choi I., Kim H., Choi H.S., Suh K., Bae Y.C., Jung J.S. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem 2004; 14: 311-324.
13. Амосов И.С., Дегтярев В.А., Силантьева Н.К., Красноваева Г.П. Рентгенологическая оценка результатов лучевого лечения рака легкого с использованием гипокситерапии. В кн.: Использование газовых гипоксических смесей для оптимизации лучевой терапии. Обнинск; 1984; с. 54-55.
14. Девятков Н.Д., Зубкова С.М., Лапрун И.Б., Макеева Н.С. Физико-химические механизмы биологического действия лазерного излучения. Успехи совр биол 1987; 103(1): 31-33.
15. Карнаухов В.Н. Люминесцентный анализ клеток. Под ред. проф. А.Ю. Буданцева. Пущино: Электронное издательство «Аналитическая микроскопия»; 2004; 131 с.
16. Bell E.L., Klimova T.A., Eisenbart J., Schumacker P.T., Chandel N.S. Mitochondrial reactive oxygen species trigger hypoxia — inducible factor — dependent extension of the replicative life span during hypoxia. Mol Cell Biol 2007; 27: 5737-5745.
17. Wolf D., Rumpold H., Koeck R., Gunsilius E. Mesenchymal stem cells: potential precursors for tumor stroma and targeted — delivery vehicles for anticancer agents. Journal of the National Cancer Institute 2005; 97(7): 540-542.
1. Houghton J., Stoicov C., Nomura S., Rogers A.B., Carlson J., Li H., Cai X., Fox J.G., Goldenring J.R., Wang T.C. Gastric cancer originating from bone marrow-derived cells. Science 2004; 306: 15681571.
2. Annabi B., Naud E., Lee Y.-T., Eliopoulos N., Galipeau J. Vascular progenitors derived from murine bone marrow stromal cells are regulated by fibroblast growth factor and are avidly recruited by vascularizing tumors. Journal of Cellular Biochemistry 2004; 91: 1146-1158.
3. Sell S. Stem cell origin of cancer and differentiation therapy. Crit Rev Oncol Hematol 2004; 51: 1-28.
4. Bhowmick N.A., Neilson E.G., Moses H.L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature 2004; 432: 332-337.
5. Li L., Tian H., Yue W., Zhu F., Li S., Li W. Human mesenchymal stem cells play a dual role on tumor cell growth in vitro and in vivo. Journal of Cellular Physiology 2010; 226: 1860-1867.
6. Chen J., Tung C.H., Mahmood U., Ntziachristos V., Gyurko R.,
Fishman M.C., Huang P.L., Weissleder R. In vivo imaging of proteolytic activity in atherosclerosis. Circulation 2002; 105(23): 2766-2771.
7. Detter C., Wipper S., Russ D., Iffland A., Burdorf L., Thein E., Wegscheider K., Reichenspurner H., Reichart B. Fluorescent cardiac imaging. A Novel intraoperative method for quantitative assessment of myocardial perfusion during graded coronary artery stenosis. Circulation 2007; 116: 1007-1014.
8. Haller J., Hyde D., Deliolanis N. Visualization of pulmonary inflammation using noninvasive fluorescence molecular imaging. J Appl Physiol 2008; 104: 795-802.
9. Morozov E.S., Verkhusha V.V., Perskiy E.E. Vestn Khar'k Natsion universiteta im. Karazina. Seriya Biologiya — Herald of Kharkov National University named after Karasin. Series Biology 2009; 9(856): 29-38.
10. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Eng 2001; 7: 211-228.
11. DeUgarte D.A., Morizono K., Elbarbary A. Comparison of multi-lineage cells from human adipose tissue and bone marrow. Cells Tissues Organs 2003. 174: 101-109.
12. Lee R.H., Kim B., Choi I., Kim H., Choi H.S., Suh K., Bae Y.C., Jung J.S. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem 2004; 14: 311-324.
13. Amosov I.S., Degtyarev V.A., Silant'eva N.K., Krasnovaeva G.P. Rentgenologicheskaya otsenka rezul'tatov luchevogo lecheniya raka legkogo s ispol'zovaniem gipoksiterapii. V kn.: Ispolzovanie gazovykh gipoksicheskikh smesey dlya optimizatsii luchevoy terapii [Radiological estimation of radiotherapy results of lung cancer using hypoxytherapy. In: The use of gas hypoxic mixtures for radiotherapy optimization]. Obninsk; 1984; p. 54-55.
14. Devyatkov N.D., Zubkova S.M., Laprun I.B., Makeeva N.S. Uspekhi Sovr Biol — Advances in Modern Biology 1987; 103(1): 31 -33.
15. Karnaukhov V.N. Lyuminestsentnyy analiz kletok [Cell fluorescence analysys]. Pod red. prof. Budantseva A.Yu. [Budantseva A.Yu. (editor)]. Pushchino: Elektronnoe izdatel'stvo “Analiticheskaya mikroskopiya” 2004; 131 p.
16. Bell E.L., Klimova T.A., Eisenbart J., Schumacker P.T., Chandel N.S. Mitochondrial reactive oxygen species trigger hypoxia — inducible factor — dependent extension of the replicative life span during hypoxia. Mol Cell Biol 2007; 27: 5737-5745.
17. Wolf D., Rumpold H., Koeck R., Gunsilius E. Mesenchymal stem cells: potential precursors for tumor stroma and targeted — delivery vehicles for anticancer agents. Journal of the National Cancer Institute 2005; 97(7): 540-542.
утттттттттттттту/тттттттттт!
