CC BY
61
■ мм
ш
Новости клеточных технологий. Клеточная биология
ЛИТЕРАТУРА:
1. Lloyd A.C. Limits to lifespan. Nat Cell Biol 2002; 4: E25-E27.
2. Lustig A.J. Crisis intervention: the role of telomerase. PNAS 1999; 96: 3339-41.
3. Romanov S.R. et al. Normal human mammary epithelial cells spontaneously escape senescence and acquire genomic changes. Nature 2001; 409: 633-7.
4. Zimmermann S. et al. Lack of telomerase activity in human mesenchymal stem cells. Leukemia 2003; 17; 6: 1146-9.
5. Parsch D. et al. Telomere length and telomerase activity during expansion and differentiation of human mesenchymal stem cells and chondrocytes. J Mol Med 2004; 82; 1: 49-55.
6. Li J.Y. et al. Telomerase activity of human bone marrow
10.
mesenchymal stem cells. Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban 2004; 33; 6: 481-485.
Mihara K. et al. Development and functional characterization of human bone marrow mesenchymal cells immortalized by enforced expression of telomerase.Br J Haematol 2003; 120; 5: 846-9. Shi S. et al. Bone formation by human postnatal bone marrow stromal stem cells is enhanced by telomerase expression. Nat Biotechnol 2002; 20: 587-91.
Milyavsky M. et al. Prolonged culture of telomerase-immortalized human fibroblasts leads to a premalignant phenotype. Cancer Res 2003; 63: 7147-57.
Serakinci N. et al. Adult human mesenchymal stem cell as a target for neoplastic transformation. Oncogene 2004; 23; 29: 5095-8.
Подготовил А.В. Берсенев; по материалам Cancer Res 2005; 65: 3035-3039.
Перспективы трансплантации стромальных клеток костного мозга для лечения муковисцидоза
16
7.
8
9.
Муковисцидоз (МВ) - одно из распространённых (среди представителей европейской расы) аутосомно-рецессив-ное наследственное заболевание, возникающее в результате мутации гена CFTR (transmembrane conductance regulator), регулирующего транспорт иона хлора через мембрану эпителиальной клетки. При этом усиливается абсорбция натрия и воды, и происходит «высушивание» слизи, продуцируемой экзокринными железами. Избыточно вязкий секрет закупоривает протоки, вследствие чего образуются множественные кисты и развивается системная дисфункция экзокринных желёз. МВ является актуальным в структуре заболеваемости и смертности (основной причиной которой является прогрессирующая дыхательная недостаточность и присоединение инфекций) среди детей и подростков [1].
За последние несколько лет было предложено несколько протоколов генотерапии МВ, использующей генетические конструкции CFTR [2-4]. Оптимальной терапевтической мишенью для доставки вектора с CFTR считается дыхательный эпителий (ДЭ), однако его трансфекции in vivo препятствуют избыток слизи, отсутствие рецептора для вируса на поверхности клетки, быстрая деградация ДНК и плохая интеграция вектора [2-4]. Альтернативный подход к заместительной клеточной генотерапии недавно был предложен группой Wang-Prockop. Он заключается в применении аутогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (МСК), трансфецированных конструкцией CFTR, как потенциального источника нового (здорового) ДЭ. Подоплёкой к применению МСК для терапии МВ послужили следующие данные:
- указания на возможность дифференцировки (или слияния) МСК в эпителиальные клетки дыхательных путей in vitro и in vivo [5, 6, 8];
- хорошая миграция МСК в дефектные лёгкие in vivo [7, 8];
- неплохая трансфецируемость МСК различными генетическими конструкциями с уверенной экспрессией трансгена [9];
- возможность использования аутологичного материала и экспансия МСК in vitro в миллиард раз за 2 месяца культивирования [10, 11].
МСК забирали из крыла подвздошной кости от здоровых волонтёров и от больных МВ. Клетки выделяли и культивировали по протоколу Sekiya-Prokop [10] с масштабированием в системе клеточной фабрики (Nunc). Клетки модифицировали меткой GFP и трансгеном CFTR с последующей лекарственной селекцией. Для дифференцировки МСК применяли специальную систему кокультивирования
с линией дефектного (по СПП) ДЭ или с первичными клетками, выделенными из лёгких больных МВ. Клетки кокуль-тивировали на границе раздела жидкой и газовой (воздушной) фаз. Через 2 (и более) недели кокультивирования нормальных МСК и дефектных клеток ДЭ в такой системе наблюдали появление эпителио-подобных клеток, несущих метку МСК. Кроме того, часть GFP+ (МСК) клеток положительно окрашивалась на эпителиальные маркёры - СК-18 и оссЫт (~ 10% МСК), чего не наблюдалось в контрольных экспериментах (культивирование МСК в сходных условиях). После кокультивирования наблюдали экспрессию CFTR дикого типа, что подтверждали методом RT-PCR отсортированных ^АСБ) GFP+ клеток. То есть, часть МСК от здоровых доноров при кокультивировании подвергалась транс-дифференцировке в клетки ДЭ. Феномен слияния исключали отсутствием клеток, положительно окрашивающихся одновременно как по метке МСК - GFP, так и по метке ДЭ - RFP.
Для оценки клинического потенциала метода выделяли МСК от МВ - гомозигот. Клетки больных МВ имели одинаковую со здоровыми способность к экспансии т vitro и дифференцировке в ткани, имеющие мезенхимальное происхождение - костную и жировую. Дефектные МСК трансфецировали CFTR. Было показано, что генетическая коррекция МСК не влияла на их способность к делению, образованию колоний и способности к диффе-ренцировке (по сравнению клетками до трансфекции и нормальными МСК от здоровых доноров). Устойчивость экспрессии CFTR подтверждали методом RT-PCR. Наконец, при кокультивировании дефектных, трансфецирован-ных CFTR МСК (от больных МВ) с дефектной линией ДЭ через месяц наблюдали восстановление секреции аниона хлора (по радиоактивной метке). Как и в физиологических условиях, хлор секретировался с апикальной части мембраны клеток в ответ на стимуляцию с АМ^. Секреция хлора не зависела от количества МСК (5, 10 или 20%) при ко-культивирвании с дефектными клетками ДЭ. Оптимальное соотношение кокультуры 1:5 (20% МСК).
Таким образом, предложен новый оригинальный метод клеточно-генетической коррекции функции ДЭ у больных МВ. Исследование, проведенное на материале пациентов с МВ, продемонстрировало возможность использования аутологичных ген-модифицированных (или немодифициро-ванных) МСК в клинической практике. Однако до начала клинических испытаний необходимо подтвердить эффективность метода на животных моделях.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 1, 2005
■ мм
ш
Новости клеточных технологий. Клеточная трансплантология
ЛИТЕРАТУРА:
1. Амелина Е.Л., Чучалин А.Г. Муковисцидоз: современный подход к диагностике и лечению. Рус. мед. журнал 1997; 5; 17: 7.
2. Ferrari S. et al. Barriers to and new approaches for gene therapy and gene delivery in cystic fibrosis. Adv Drug Deliv Rev 2002; 54; 11: 1373-93.
3. Wang G. et al. Development of retroviral vectors for gene transfer to airway epithelia. Curr Opin Mol Ther 2000; 2; 5: 497-06.
4. Griesenbach U. et al. Advances in cystic fibrosis gene therapy. Curr Opin Pulm Med 2004; 10; 6: 542-46.
5. Pereira R.F. et al. Cultured adherent cells from marrow can serve as long-lasting precursor cells for bone, cartilage, and lung in irradiated mice. PNAS 1995; 92; 11: 4857-61.
6. Spees J.L. et al. Differentiation, cell fusion, and nuclear fusion during ex vivo repair of epithelium by human adult stem cells from bone marrow stroma. PNAS 2003; 100; 5: 2397-402.
8.
9.
7. Ortiz L.A. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. PNAS 2003; 100; 14: 8407-11.
Kotton D.N. et al. Bone marrow-derived cells as progenitors of lung alveolar epithelium. Development 2001; 128: 5181-8. Zhang X.Y. et al. Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells. Mol Ther 2002; 5; (5 Pt 1): 555-65.
10. Sekiya I. et al. Expansion of human adult stem cells from bone marrow stroma: conditions that maximize the yields of early progenitors and evaluate their quality. Stem Cells 2002; 20; 6: 53041.
11. Colter D.C. et al. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow. PNAS 2000; 97; 7: 3213-8.
Подготовил А.В. Берсенев; по материалам PNAS 2005; 102; 1: 186-191.
17
Отечественный опыт изучения эффективности метода «клеточной кардиомиопластики» в эксперименте
Возможности клеточной кардиомиопластики широко обсуждаются на страницах научной прессы. Исследователи решают ряд научных и клинических проблем, связанных с созданием подобных технологий. Ключевыми из них являются: определение фенотипа клеток, наиболее перспективных для лечения инфаркта миокарда; обоснование рациональных путей их введения и установление сроков развития инфаркта, на которых показана трансплантация. Предлагается использовать различные клетки для лечения заболеваний сердца: стромальные клетки костного мозга, скелетные миобласты, гемопоэтические стволовые клетки [5, 9]. Более прогрессивным считается использование определенных фракций малодифференцированных клеток, например 00133+ [7, 8]. Возможными путями доставки являются: интрамиокардиальное введение (в основном, как дополнение при операциях на открытом сердце, например, при выполнении аорто-коронарного шунтирования); интракоронар-ное введение, обсуждаются различные варианты системного введения (теоретическая предпосылка: клетки сами «найдут» поврежденный миокард и «осядут» там) [3]; наконец, мобилизация клеток-предшественников из тканевых ниш (в частности, из костного мозга) введением цито-кинов [4]. Следует отметить, что в нашей стране прослеживается тенденция использования клеточных технологий в клинике, прежде, чем они будут экспериментально фундаментально обоснованы. Над созданием технологии «клеточной кардиомиопластики» в РФ работают несколько лабораторий крупных научно-клинических учреждений, среди них: Российская Военно-медицинская академия (СПб); НИИ ТиИО (Москва), НЦССХ им. Бакулева (Москва), ГМУ им. Павлова, Институт Цитологии РАН, ЦНИИРРИ, ГМПБ 2 (СПб), НИИ кардиологии Томского НЦ СО РАМН. Нельзя не отметить недостаток количества и общий низкий уровень публикуемых в России экспериментальных работ по данной теме. Доказательная база в них строится, в основном, на методах исследования гемодинамики. В то же время, такие важнейшие аспекты как полная фенотипическая характеристика трансплантационного материала, состояние сердечной мышцы, судьба клеток после трансплантации, морфогенез инфаркта миокарда после пересадок клеток часто остаются за рамками исследований. Вот почему публика-
ции фундаментальных работ на эту тему являются новостью, ожидаемой отечественными специалистами. Некоторые коммерческие лаборатории, планирующие развивать «клеточный бизнес», также работают в этом направлении. Так, в 12-ом номере журнала «Цитология» за 2004 год опубликованы результаты исследования, выполненного при участии сотрудников такой лаборатории - «Терапия экспериментального инфаркта миокарда у крыс с помощью трансплантации сингенных мезенхимальных стволовых клеток» [2]. Исследователи культивировали стромальные клетки костного мозга крысы, проводили их иммунофенотипи-рование, индуцировали дифференцировку в различных направлениях (хондрогенное, остеогенное, адипоцитарное, кардиомиоцитарное). Клетки, индуцированные к кардиоми-оцитарной дифференцировке, использовали для внутривенного введения крысам с экспериментальным инфарктом миокарда. Результаты лечебных манипуляций оценивали электрокардиографически, гистологическими и гистомор-фометрическими методами. Всего авторы применили 9 методов исследования, в том числе - иммунофенотипиро-вание клеток полученной культуры, индукцию направленной дифференцировки, ОТ-ПЦР и др. Приходится констатировать недостаточную теоретическую общебиологическую и медицинскую подготовку коллектива авторов. Так, в статье используются как взаимозаменяемые термины «мезен-химные клетки» и «мезенхимальные стволовые клетки» (МСК); авторы не осведомлены об основах анатомии млекопитающих («сердце извлекали из грудной полости»). Кроме таких «неточностей», в теоретический базис статьи заложены суждения о том, что ген фибронектина является маркером «недифференцированных МСК» (разве существуют «дифференцированные» стволовые клетки?). Для детекции хондрогенной дифференцировки авторы предлагают использовать ген коллагена I типа, несмотря на то, что этот белок вырабатывают большинство механоцитов (от фиб-робластов до остеобластов), в то время, как для хондробла-стов характерен синтез почти исключительно коллагена II типа (95%) [1]. Как несомненный успех следует признать то, что авторам удалось получить относительно гомогенную (93,4%) культуру клеток стромы костного мозга крысы по двум изучаемым антигенам - 0090+0045-, однако оста-
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 1, 2005
