CC BY
47
■ мм
ш
Новости клеточных технологий. Клеточная биология
материала удалось обнаружить только 2 мышечных волокна, с подтверждённым синтезом этого белка. Предварительное облучение реципиентов значительно усиливало включение донорских клеток (с 0,82% до 4,2%). Таким образом, слияние ГК с мышечными волокнами не обеспечивает синтеза саркогликана, также как и скопление донорских клеток между миоцитами хозяина.
На модели кардиомиопатии 8дсС-/-мышей также наблюдали высокий епдгаЛтегЛ донорских клеток в миокард хозяина, степень которого напрямую зависела от предшествующего облучения реципиентов и времени, прошедшего после трансплантации. Степень слияния клеток была аналогичной таковой в скелетных мышцах. Однако не было обнаружено ни одной клетки, экспрессирующей саркогли-кан, вне зависимости от положения У+ ядра (внутри или вне кардиомиоцита хозяина). Прямая локальная трансген-дерная аллогенная трансплантация первичных миобластов, выделенных от новорожденных доноров, напротив, приводила к восстановлению синтеза саркогликанов (всего комплекса семейства) миоцитами хозяина через механизм слияния. Наконец, локальное внутримышечное введение ГК, также, как и системная ТКМ (нефракционированного), не
приводило к восстановлению синтеза саркогликана. Результаты исследования противоречат предшествующим работам [2-6] по изучению возможностей регенерации мышечной ткани методом трансплантации клеток костного мозга. В комментарии к этой статье высказано предположение о повторении опытов 1_ар1Соз с другими типами клеток костного мозга, такими как мезенхимальные и МАРС. Кроме того, чтобы сделать окончательные выводы о механизмах восстановления генной экспрессии дефектной мышцы методом клеточной трансплантации, необходимо провести эксперименты с другими метками (например, _acZ под мио-специфичными промотерами), с хроматин-ремоделирую-щими агентами (для снятия эпигенетической модификации гистонов) и т.д. Поскольку опыты с мышечными стволовыми клетками (миобластами - более «продвинутыми» в диф-ференцировке) были успешны, возникает гипотеза о недостаточной «декодировке» генной экспрессии в дефектной клетке посредством донорского (нормального) ядра более незрелой клетке (рис.). Авторы работы призывают воздержаться от клинических исследований по применению ТКМ и ГК с целью лечения мышечных дистрофий и кардиомио-патий.
ЛИТЕРАТУРА:
1. LaBarge M.A., Blau H.M. Biological progression from adult bone marrow to mononucleate muscle stem cell to multinucleate muscle fiber in response to injury. Cell 2002; 11: 589-601.
2. Camargo F.D. et al. Single hematopoietic stem cells generate skeletal muscle through myeloid intermediates. Nat Med 2003; 9: 1520-7.
3. Gussoni E. et al. Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation. Nature 1999; 40: 390-4.
4. Ferrari G. et al. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors. Science 1998; 279: 1528-30.
5. Jackson K.A. et al. Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells. J. Clin. Invest 2001; 107: 1395-402.
6. Orlic D. et al. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature 2001; 410: 701-5.
7. Alvarez-Dolado M. et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature 2003; 425: 968-73.
8. Shi D. et al. Myogenic fusion of human bone marrow stromal cells, but not hematopoietic cells. Blood 2004; 104; 1: 290-4.
9. Abedi M. Robust conversion of marrow cells to skeletal muscle with formation of marrow-derived muscle cell colonies: a multifactorial process. Exp Hematol 2004; 32: 426-34.
10. Willenbring H. et al. Myelomonocytic cells are sufficient for therapeutic cell fusion in liver. Nat Med 2004; 10: 744-8.
11. Hack A.A. et al. Differential requirement for individual sarcoglycans and dystrophin in the assembly and function of the dystrophin-glycoprotein complex. J Cell Sci 2000; 113: 2535-44.
Подготовил А.В. Берсенев; по материалам J Clin Invest 2004; 114: 1577-85.
11
Пластичность стволовых клеток костного мозга: участие клеток в химеризации
кожи и дифференцировке
Степень пластичности мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (МСК) продолжает широко обсуждаться в научных кругах. Ряд работ посвящен изучению возможности дифференцировки клеток костного мозга в клетки кожи с перспективами их использования в лечении дефектов этого органа. Классическими работами по этой тематике являются исследования групп Krause и Korbling. Авторы получили ряд интересных фактов, свидетельствующих о возможном участии МСК в репарации кожного эпителия. Так, Korbling обнаружил Y+ клетки, экспрессирующие цито-кератины в базальном слое кожного эпителия после транс-гендерной пересадки гемопоэтических стволовых клеток человеку с частотой ~ 2-7% [1]. В работе Krause на мышиной модели, были обнаружены подобные клетки с частотой встречаемости 1,2 - 2,7% [2]. Однако, в исследовании Hematti не было получено подобной химеризации кожи, несмотря на применение высокочувствительных методов (RT-PCR), что могло бы поставить под сомнение результаты предыдущих работ [3]. В опытах по трансплантации GFP+ костного мозга диким мышам-реципиентам с моделью
повреждения кожи было показано, что значительное число клеток мигрирует как в поврежденные, так и в неповрежденные участки кожи. Повреждение стимулировало приживление и дифференцировку клеток костного мозга в коже [4, 7]. Недавно было показано, что усиление миграции клеток костного мозга в области кожного дефекта, и их диффе-ренцировка в элементы эпидермиса не обусловлена феноменом слияния [5]. В другом эксперименте повреждение усиливало включение клеток костного мозга с уровня менее чем 1% до 4%, но явления дифференцировки в цито-кератин-позитивные клетки были настолько редки, что исследователи ставят под сомнение степень пластичности донорских клеток [6]. Таким образом, предшествующие эксперименты по трансплантации фракционированного костного мозга продемонстрировали способность к миграции и химеризации кожи (как повреждённой, так и здоровой) и указали на возможную способность к дифференцировке в её отдельные структуры. Однако неясно, какие именно клетки и сигналы обуславливают способность к химериза-ции кожи, дифференцировке и стимуляции заживления ран.
■ мм
ш
Новости клеточных технологий. Клеточная биология
Серия работ по местному применению пластик-адгезивной фракции костного мозга (называемой исследователями ме-зенхимальными стволовыми клетками - МСК), продемонстрировала, что в ране ускоряется образование грануляционной ткани и инициируется процесс регенерации. Раневое микроокружение индуцировало пролиферацию МСК и вызывало усиление синтеза коллагена [8-10]. Другим возможным механизмом заживления является дифференци-ровка клеток костного мозга в фибробласты в зоне дефекта и синтез ими белков экстрацеллюлярного матрикса [8]. В журнале Tissue Engineering опубликовано исследование китайских ученых, демонстрирующее способность отдельной фракции костного мозга (МСК) химеризовать кожу после внутривенной трансплантации на мышиной модели. Предшествующая работа этой группы [15] продемонстрировала, что Sca-1-/Flk-1+ клетки костного мозга мышей хорошо делятся в пластик-адгезивной культуре и не несут гемопоэтических маркёров, обладая «культуральным» сходством с МСК. В экспериментальной модели использовали самцов белых мышей (BALB/c, H-2Kd) и самок черных мышей (C57BL/6, H-2Kb). У самцов белых мышей был получен костный мозг, из которого с помощью магнитной сортировки выделены МСК с фенотипом CD45-/Ter119-/Flk-1 +. Клетки были размножены в культуре в течение 2-4 недель. После культивирования они экспрессировали CD13, CD29, CD44 и были негативны по CD34. Для полного исключения контаминации гемопоэтическими клетками производили удаление Sca-1+, в результате чего чистота культуры перед трансплантацией составила 91,57% Flk-1+. В качестве клеточной метки использовали красный трей-сер CM-DiI.
Самки черных мышей были облучены в летальной дозе, после чего им производили внутривенную трансгендерную трансплантацию полученной культуры клеток в количестве 10 млн. Через 20 дней после трансплантации у черных самок-реципиентов стали появляться белые волосы с начальной плотностью 1 на 0,5 кв.см., с последующим увеличением их числа и плотности к 40 дню (рис.). После вывода животных из эксперимента исследовали участки кожи, несущие белые волосы. При флюоресцентной микроскопии было выявлено, что меченые трейсером клетки (Dil+) располагались в базальном слое эпидермиса и в волосяных фолликулах. Иммуногистохимическим методом была показана экспрессия этими клетками донорского антигена (H-2Kd). Их донорское происхождение также было подтверждено наличием Y хромосомы (RT-PCR). Почти все донорские клетки локализовались в волосяных фолликулах белых волос, т.е. дифференцировались в придатки кожи. Исследование экспрессии одного из важнейших транскрипционных факторов стволовых клеток эпидермиса - p63, выявило три различные субпопуляции: H-2Kd+/p63+ - стволовые клетки донорского происхождения, H-2Kd+/p63— зрелые клетки кожи донорского происхождения и H-2Kd-/p63+ - собственные стволовые клетки реципиента. В контрольной
группе с трансплантацией Sca-1+ гемопоэтических клеток по аналогичной схеме не было получено подобной химери-зации кожи. Исследователи также исключили возможное изменение окраски волос под влиянием облучения. Выполненная по этой же схеме пересадка МСК костного мозга самцов черных мышей белым самкам не приводила к появлению черных волос даже через 3 мес., несмотря на то что пересаженные клетки обнаруживали, но существенно реже.
Это исследование выгодно отличается от предшествующих работ тем, что авторы экспериментировали с чётко определённой стволовой фракцией костного мозга - Flk-1+ клетками. Впервые была получена очень высокая степень химеризации кожи донора (без её повреждения) при внутривенном введении клеток. Предыдущие исследования не могли ответить, какая именно популяция клеток костного мозга способна к высокому химеризму и дифференци-ровке в элементы кожи как органа-мишени. Интересно, что большая часть клеток донора локализовалась в волосяных фолликулах и дифференцировалась в придатки кожи - волосы. Известно, что волосяной фолликул содержит один из основных стволовых компартментов кожи, поэтому возникает вопрос о слиянии стволовых клеток между собой как об основном механизме химерной дифференцировки. Набор методов, примененный исследователями, выявил наличие нескольких популяций клеток, возникающих не в результате слияния, однако этот феномен полностью не исключен.
Таким образом, клеточной популяцией костного мозга, способной к миграции, высокой степени химеризма и диф-ференцировке в клетки кожи, следует считать Flk-1+ клетки. Однако, выбор именно этого маркёра остаётся дискуссионным. Flk-1 является одним из рецепторов (тирозин-киназовым) сосудистого фактора роста эндотелия (vascular endothelial growth factor - VEGF) [11, 12]. Он экспрессируется, преимущественно на эндотелиоцитах и гемопоэтических прогениторных клетках [12]. Сортировка клеток (эмбриональных стволовых [13] и костного мозга взрослых и фетусов [14]) по Flk-1+ производится, как правило, для получения предшественников сосудистого эндотелия и стимуляции ангиогенеза. Некоторые исследователи относят Flk-1 + к маркёрам МСК, поскольку эти клетки не коэкспрессируют гемопоэтических маркёров (что подтверждают авторы данного исследования) и обладают выраженными адгезивными и пролиферативными свойствами в культуре [15, 16]. Однако Flk-1+ клетки, выделенные из эмбриональных стволовых клеток, способны к восстановлению гемопоэза у SCID-мышей [17]. Таким образом, на сегодняшний день, установлено участие Flk-1+ популяции клеток в гемопоэзе, ангиогенезе и регенерации кожи. Возможно, что Flk-1+ клеточная популяция является одним из кандидатов на более ранний стволовой мультипотент-ный компартмент костного мозга (мышей) [14].
ЛИТЕРАТУРА:
1. Korbling M. et al. Hepatocytes and epithelial cells of donor origin in recipients of peripheral-blood stem cells. N Engl J Med 2002; 46: 738.
2. Krause D.S. et al. Multi-organ, multilineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell. Cell 2001; 105: 369.
3. Hematti P et al. Absence of donor-derived keratinocyte stem cells in skin tissues cultured from patients after mobilized peripheral blood hematopoietic stem cell transplantation. Exp Hematol 2002; 30: 943.
4. Badiavas E.V. et al. Participation of bone marrow derived cells in cutaneous wound healing. J Cell Physiol 2003; 196; 2: 245-50.
5. Brittan M. Bone marrow cells engraft within the epidermis and proliferate in vivo with no evidence of cell fusion. J Pathol 2005; 205; 1: 1-13.
6. Borue X et al. Bone marrow-derived cells contribute to epithelial
engraftment during wound healing. Am J Pathol 2004; 165; 5: 1767-72.
7. Fathke C. et al. Contribution of bone marrow-derived cells to skin: collagen deposition and wound repair. Stem Cells 2004; 22; 5: 812-22.
8. Ai G. et al. The experimental study of bone marrow mesenchymal stem cells on the repair of skin wound combined with local radiation injury. Zhonghua Yi Xue Za Zhi 2002; 82; 23: 1632-36.
9. Satoh H. et al. Transplanted mesenchymal stem cells are effective for skin regeneration in acute cutaneous wounds. Cell Transplant 2004; 13; 4: 405-12.
10. Шумаков В.И. и др. Сравнительная оценка эффективности применения аллогенных эмбриональных фибробластов и мезенхи-мальных стволовых клеток костного мозга для терапии глубоких ожоговых ран. Вестник ТиИО 2002; 4: 7-11.
11. Achen M.G. et al. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF
12
■■■ ......
ш
Новости клеточных технологий. Клеточная биология
13
receptor 3 (Flt4). PNAS 1998; 95; 2: 548-53.
12. Chiang M.K., Flanagan J.G. Interactions between the Flk-1 receptor, vascular endothelial growth factor, and cell surface proteoglycan identified with a soluble receptor reagent. Growth Factors 1995; 12; 1: 1-10.
13. Yamashita J. et al. Flk1-positive cells derived from embryonic stem cells serve as vascular progenitors. Nature 2000; 408; 6808: 92-6.
14. Fang B. et al. Multipotency of Flk1+CD34- progenitors derived from human fetal bone marrow. J Lab Clin Med 2004; 143: 4.
15. Deng W. et al. Allogeneic bone marrow-derived flk-1+Sca-1-
mesenchymal stem cells leads to stable mixed chimerism and donor-specific tolerance. Exp Hematol 2004; 32; 9: 861-7.
16. Fang B., Shi M., Liao L. et al. Systemic infusion of FLK1 + mesenchymal stem cells ameliorate carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in mice. Transplantation 2004; 78: 83-8.
17. Miyagi T. et al. Flk-1+ cells derived from mouse embryonic stem cells reconstitute hematopoiesis in vivo in SCID mice. Exp Hematol 2002; 30: 1444.
Подготовил А.В. Волков; по материалам Tissue Eng 2005; 11; 1-2: 110-119.
Выделение и характеристика нейральных стволовых клеток из обонятельной области слизистой оболочки носа млекопитающих
Мультипотентные стволовые клетки взрослого организма за последние годы были выделены из разных тканей и органов. Однако степень пластичности стволовых клеток дефинитивных тканей в настоящее время активно дискутируется. Так, например, было показано, что нейральные стволовые клетки мыши могут дифференцироваться в гемопоэтические и восстанавливать гемопоэз in vivo [1]. Этот результат был воспроизведён ещё одной группой исследователей [2], однако опровергнут другой [3]. Нейраль-ные стволовые клетки были выделены из разных отделов нервной системы человека, включая и обонятельную область слизистой оболочки носа. 4 года назад Roistein F.J. с соавт. впервые выделил нейральные стволовые клетки из обонятельной области слизистой оболочки носа (ОСН) взрослого человека [4], а позже, Zhang получил аналогичные нейросферы в своей лаборатории [5]. Отдельную субпопуляцию, в обонятельной части слизистой оболочки носа человека образуют так называемые обкладочные нейро-эпителиальные клетки (olfactory ensheathing cells), обладающие свойствами нейральных стволовых [6]. Имеются также указания, что клетки базального слоя «обонятельного эпителия» мыши могут дифференцироваться и в экстра-нейрональном направлении [7, 8].
Исследование австралийской группы Murrell, опубликованное в онлайн-версии журнала Developmental Dynamics, демонстрирует, что нейральные стволовые клетки, выделенные по схожему протоколу из ОСН человека, крысы и мыши обладают мультипотентностью.
Клетки человека выделяли из биоптатов ОСН (полученных после операций септопластики и турбинэктомии) фер-ментативно-механическим методом. Через 7-10 дней после первичного плэтинга неприкрепившиеся клетки образовывали шаровидные колонии, содержащие около 1000 клеток. Способность к образованию сфер не зависела от возраста донора. Клетки сфер экспрессировали не-стин и нейрональные маркёры, характерные для глии (GFAP, O4, GalC) и нейронов (beta-tubulin III, MAP5), то есть являлись нейросферами. Способность к образованию вторичных и третичных сфер сохранялась после диссоциации первичных нейросфер или их криоконсервирования, что указывало на наличие клеток, обладающих свойством самообновления. Было показано, что клетки нейросфер способны к клональному росту без изменения экспрессии маркёров. Степень экспрессии тех или иных нейромаркёров зависела от присутствия различных факторов дифферен-цировки (NGF, CNTF, ретиноевой кислоты, сыворотки). Спо-
собность к дифференцировке изучали в Transwell системе, представляющей из себя кокультуру нейросфер и дифференцированных клеток различных специализированных тканей (мышечных, гепатоцитов) новорожденных крысят, разделённую полупроницаемой мембраной и исключающей прямой межклеточный контакт. При этом клетки нейросфер изменяли свою морфологию и начинали экспрессировать тканеспецифичные маркёры, в зависимости от вида специализированной ткани в кокультуре. Так, при стимуляции дифференцировки клеток сфер гепатоцитами наблюдали экспрессию ими альбумина и ферритина. Кардиомиоцита-ми - альфа-актина и сердечного тропонина I. Скелетной мышечной тканью - миозин, тропомиозин.
Таким образом, способность клеток нейросфер к диф-ференцировке in vitro зависела от наличия в культуральной среде специфических растворимых факторов, выделяемых клетками специализированных тканей. При трансплантации меченых клеток нейросфер в гаструлу куриного эмбриона, наблюдали их включение во многие ткани. Однако диф-ференцировка донорских клеток (человека) была показана только для сердца и головного мозга. В аналогичном эксперименте был показан энграфтинг клеток «обонятельного эпителия» мыши во множество органов и тканей куриного эмбриона. Показана трансдифференцировка клеток в нервную, мышечную ткани и гепатоциты. В контрольных экспериментах (введение в гаструлу неклеточной суспензии и трансплантация клеток крови без эритроцитов) не было получено доказательств множественного энграфтинга и дифференцировки in vivo.
Таким образом, было показано, что клетки нейросфер человека и мыши способны дифференцироваться in vivo в ткани всех трёх зародышевых листков. В подтверждение достоверности экспериментов Bjornson C.R. (1999), исследователи выполняли внутривенную сингенную трансген-дерную трансплантацию клеток нейросфер (выделенных из ОСН) в организм летально облучённых крыс. Перед трансплантацией все донорские клетки были негативны по CD45 (общий маркёр лейкоцитов) и CD34 (маркёр гемопоэтичес-ких клеток). Однако менее 1% клеток трансплантата эксп-рессировали миелоидный маркёр CD11b, что могло указывать на потенциальную контаминацию клетками крови. Через 9 месяцев степень химеризма реципиента донорскими лейкоцитами составляла 5-20% среди всех выживших животных.
Донорские клетки в крови и селезёнке реципиента ко-экспрессировали маркёры Т- , B-, дендритных, миелоид-
