Экспрессия гена аmt1;6, кодирующего транспортер аммония у Chlamydomonas reinhardtii Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

2012 ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА Сер. 3 Вып. 4

ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ

УДК 577.218

Е. С. Минаева, Е. В. Ермилова

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА AMT1;6, КОДИРУЮЩЕГО ТРАНСПОРТЕР АММОНИЯ У CHLAMYDOMONAS REINHARDTII

Аммоний представляет собой наиболее предпочтительный источник азота для многих организмов, включая одноклеточную зеленую водоросль Chlamydomonas reinhardtii. Поэтому неудивительно, что транспортные системы аммония широко распространены среди различных организмов: бактерий, грибов и высших растений. У C. reinhardtii перенос аммония, так же как у высших растений, осуществляется двумя транспортными системами: с высоким сродством к аммонию (HATS) и с низким сродством к аммонию (LATS). В геноме C. reinhardtii выявлено 8 генов семейства AMT1 (CrAMT1), кодирующих белки-транспортеры аммония [1]. Филогенетический анализ генов показал, что семейство CrAMT1 имеет промежуточное эволюционное положение между Amtl-белками высших растений и дрожжей, с одной стороны, и бактерий — с другой.

Наличие у C. reinhardtii такого набора транспортеров аммония, вероятно, отражает стратегию одноклеточного организма, направленную на обеспечение клеток азотом в меняющихся условиях среды за счет различных, дополняющих друг друга систем с разной активностью и сродством к субстрату. Одноклеточный организм должен контролировать поступление аммония в клетку, где он может быть ассимилирован в цитоплазме или хлоропласте, аккумулирован в вакуолях или экспортирован обратно в среду. Кроме того, клетки Chlamydomonas, как и высшие растения, должны выводить избыток аммония из цитоплазмы и хлоропласта, а также из митохондрий при активном фотодыхании [2-6]. Другой причиной, объясняющей наличие большого числа Amtl-белков у Chlamydomonas по сравнению с высшими растениями, может быть необходимость для одноклеточного организма заново поглощать выведенный аммоний. В отличие от высших растений, у которых межклеточные взаимодействия и система апопласта обеспечивают процессы разбавления / концентрирования избыточного или недостающего аммония, Chlamydomonas нуждается в эффективных механизмах вывода аммония при высоких и токсических концентрациях, а также в наличии систем его повторного поглощения даже при очень низкой внеклеточной концентрации [7]. Эти процессы могли бы осуществлять Amtl-транспортеры, локализованные в плазматической мембране, которые, однако, регулируются иначе, чем транспортеры, ответственные за поглощение аммония.

© Е. С. Минаева, Е. В. Ермилова, 2012

Системы активного экспорта аммония из клеток мало изучены и пока описаны только у некоторых высших растений, например ячменя [4-6]. Одним из подходов для выбора кандидата на роль экспортера аммония из клеток является анализ экспрессии генов, кодирующих транспортеры аммония при выращивании организмов на средах с разными источниками азота. Насыщение клеток азотом ингибирует дальнейшее поглощение аммония и экспрессию генов AMT1 [6, 8-10]. По нашим данным ген, CrAMT1;6 в отличие от других CrAMTl-генов демонстрировал высокий уровень экспрессии в среде с аммонием [11], что предполагает его роль как экспортера аммония. Для проверки этого предположения проанализирована экспрессия гена CrAMT1;6 при разном содержании аммония в среде и цитоплазме.

Материалы и методы исследования

Штаммы и условия культивирования. В работе использовались штаммы C. rein-hardtii 6145с (WT), CC-124 и 305cw15, любезно предоставленные профессором Э. Фернандесом (Испания). Вегетативные клетки выращивали синхронно в режиме освещения люминесцентными лампами 12 ч свет : 12 ч темнота при 23°С (освещенность 2000 лк) [12]. Для получения прегамет жидкую культуру синхронно растущих клеток в начале светового периода отмывали средой без азота, ресуспендировали в среде без азота и инкубировали в темноте в течение 24 ч. Гаметы получали из прегамет путем их освещения на протяжении 2 ч (освещенность 2000 лк).

Выделение РНК. Тотальная РНК была выделена из каждого образца с использованием TRIZOL Reagent Invitrogen™ в соответствии с инструкциями производителя. После экстракции пробы РНК были растворены в 20 мкл сверхчистой воды (Тип I), обработанной 0,1% диэтилпирокарбонатом (DEPC). Пробы РНК были обработаны ДНКазой I (Fermentas) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрации РНК до и после обработки ДНКазой I, а также соотношения А260/А280 и А260/А230 были определены спектрофотометром (SmartSpec Bio-Rad). Для анализа использовались образцы с соотношениями: А260/А280 от 1,9 до 2,1 и А260/А230 более 2,0. Оценку качества РНК до и после обработки ДНКазой I проводили с помощью электрофореза в агароз-ном геле с последующей визуализацией с использованием гель-документационной системы BioDoc-It™ Imaging System (UVP).

Проведение обратной транскрипции. кДНК были синтезированы из 2 мкг тотальной РНК с использованием OligodT и обратной транскриптазы SuperScriptIII (Invi-trogen™) в соответствии с инструкциями производителя. Количество синтезированной кДНК определяли с использованием спектрофотометра (SmartSpec Bio-Rad, США).

ПЦР в реальном времени. Реакции ПЦР в реальном времени проводили в стри-пованных оптических пробирках для ПЦР в реальном времени (Bio-Rad, США) c использованием SYBRGreen I (Amersham™) для визуализации синтеза двухцепочечных ДНК. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 2,5 мкл 10-кратного реакционного буфера; 1,25 мкл 0,5 мМ смеси dNTP; 1 мкл смеси прямого и обратного праймеров (10 мкМ); 1,25 мкл 50 мМ раствора MgCl2; 0,1 мкл HotStart Taq полимеразы (5 е.а./мкл); 1,25 мкл 0,1 мМ раствора SYBRGreenI в DMSO; 200 нг кДНК. Реакции ПЦР в реальном времени проводили, применяя амплификатор MiniOpticon RealTime PCR System (BioRad), в следующих условиях: 96 °С 5 мин; 40 циклов (96 °С 30 с, 60 °С 30 с, 72 °С 1 мин); 72 °С 5 мин; 4 °C. Каждая реакция ПЦР была проведена в тройном повторе. Для оценки

специфичности амплификации с использованием программного обеспечения прибора были сняты кривые плавления продуктов амплификации со следующими параметрами: температура — от 65 до 95 °С, шаг 0,2 °С, время удержания 0,5 с.

Для реакций ОТ-ПЦР и ПЦР в режиме реального времени использовались следующие пары праймеров — AMT1;6 (прямой 5'-CGCCGCGCTGGTGTTTATAATG-CAC-3', обратный 5 '-CGGTGCCGGTGTTGTGGCTGGAGTA-3 ') и UBI (прямой 5'-GTACAGCGGCGGCTAGAGGCAC-3', обратный 5'-AGCGTCAGCGGCGGTTGCA-GGTATCT-3')

Для ПЦР в реальном времени была использована кДНК, полученная из РНК, выделенной в трех независимых экспериментах.

Эффективность амплификации и определение С проводили с помощью программного обеспечения Opticon3 (Bio-Rad). Полученные данные использовали далее в Microsoft Excel для анализа экспрессии генов.

Для оценки уровня экспрессии генов интереса применяли показатели АС и ААС с геном UBI в качестве референс-гена по формулам (1) и (2)

Уровень экспрессии гена интереса = 2a(UBI) - а(ген интеРеса), (1)

Уровень экспрессии гена интереса =2-ААа, (2)

где ААС = АС (прегаметы или гаметы) - АС (вегетативные клетки). АС = С (ген интереса, прегаметы или гаметы) - С(UBI, прегаметы или гаметы).

Определение активности глутаминсинтетазы. Активность глутаминсинтета-зы определялась по описанному ранее методу [13]. Cуспензию клеток Chlamydomonas (10 мкг хлорофилла) центрифугировали (3000 g, 5 мин) и ресуспендировали в 0,8 мл раствора 1 (HEPES 66,7 мМ, pH 7,0 доводится NaOH, L-глутамин 40 мМ, MnCl2 4 мМ, ADP 0,5 мМ). Замораживали на 10 мин (-70 °С). После размораживания вносили 0,1 мл свежеприготовленного раствора 2 (1,2 М : 1,2 М гидроксиламин хлорид : NaOH) перемешивали на вортексе в течение 10 с. Далее вносили 50 мкл раствора 3 (Na2HAsO4 • 7H2O 124,8 мг/мл), перемешивали на вортексе и инкубировали суспензию на свету при 30 °С в течение 10 мин. После этого добавляли 2 мл раствора 4 (37% HCl 3,87 мл, ТХУ 6 г, FeCl3 • 6H2O 16,65 г, вода до 500 мл), центрифугировали 10 мин (10 000 g) и измеряли поглощение при A540 на спектрофотометре (Bio-Rad, США). Активность глутаминсинтетазы (мкмоль/мин • мг хлорофилла) вычисляли по формуле:

Активность GS = A540/(0,32 • Хл • t),

где A540 — длина волны, Хл — количество хлорофилла (мг), t — время инкубации (мин).

Для определения концентрации хлорофилла 1 мл культуры центрифугировали (3 мин, 5000 g) и ресуспендировали в 1 мл 95°-ного спирта, затем перемешивали на вортексе и центрифугировали (5 мин, 12 000 g). Поглощение полученного супернатанта измеряли на спектрофотометре (Bio-Rad, США) при длине волны 665 и 649 нм.

Концентрацию хлорофилла рассчитывали по формуле:

С = 6,1 • A665 + 20,04 • A 649.

Результаты исследования и их обсуждение

Как отмечалось, у СЫатуйотопа$ выявлено восемь генов семейства СгЛМТ1 [1]. Анализ экспрессии СгЛМТ1;6 на разных этапах гаметогенеза показал, что в отличие от других генов семейства &ЛМТ1 [11], уровни мРНК снижались в прегаметах и гаметах по сравнению с вегетативными клетками, выращенными в среде, содержащей 7,5 мМ аммония (рис. 1). Мы предположили, что наблюдаемый эффект связан с отсутствием

и и <о

1,2 г

0,8

0,4

■

Вегетативные Прегаметы клетки

Гаметы

Рис. 1. Уровни относительной экспрессии гена СгЛМТ1;6 на разных стадиях жизненного цикла С. теткатйШ

аммония в среде, а не с процессом дифференцировки в ходе гаметогенеза. Для проверки предположения клетки штамма 305, синхронно выращенные в среде с аммонием, в начале световой фазы были перенесены в среду с нитратом в качестве источника азота и в среду без азота. Как видно из данных, представленных на рис. 2, уровень экс-

1,6 г

и и

и &

у

г>

1,2

0,8

0,4

■

Аммоний 1 ч

2ч

1ч

2ч

Нитрат

ТАР - N

Рис. 2. Уровни относительной экспрессии гена СгЛМТ1;6 в клетках штамма 305 С. тгткатйШ, инкубированных в средах с аммонием и нитратом в качестве источников азота

Среда без азота (ТАР^) использовалась в качестве контроля.

прессии гена снижался уже через 1 ч. В мутанте 305 нарушен ген NIA1, кодирующий нитратредуктазу — фермент, необходимый для ассимиляции нитрата [1]. Наблюдаемое уменьшение транскрипции гена интереса, по-видимому, связано с тем, что культивирование в среде с нитратом воспринимается клетками штамма 305 как условие голодания по источнику азота. Это подтверждается результатами, полученными на среде без источника азота, где также наблюдалось снижение экспрессии CrAMT1;6 уже через 1 ч инкубирования (см. рис. 2). Однако при культивировании штаммов с нарушениями в нитратредуктазе в среде с нитратом происходит его аккумуляция в цитозоле [14]. Не исключено, что наблюдаемое снижение транскриптов CrAMT1;6 в клетках на среде с нитратом может быть связано с ингибирующим действием нитрата.

Для оценки потенциального отрицательного действия нитрата экспрессия CrAMT1;6 была дополнительно проверена у штамма дикого типа 6145 с (рис. 3). Экспрессия гена несколько снижалась через 1 ч, однако уже через 2 ч, с началом формирования внутриклеточного аммония из нитрата [14], ее уровни достигали исходных значений и не изменялись при более длительном культивировании. Таким образом, редукция нитрата в аммоний и его формирование представляют необходимый этап для экспрессии гена интереса.

1,8 г Т

1,4-

1,0 -0,6 -0,2-

Аммоний 1ч 2 ч 24 ч

ч_____'

V---

Нитрат

Рис. 3. Уровни относительной экспрессии гена ^ЛМТ1;б в клетках штамма 6145с С. тгткатйШ, выращенных на средах с аммонием и нитратом в качестве источников азота

Чтобы подтвердить, что аммоний выступает в роли сигнала, необходимого для транскрипции ^ЛМТ^б, уровни транскрипта были проверены в клетках, выращенных на среде с мочевиной в качестве единственного источника азота в присутствии ингибитора глутаминсинтетазы — метионинсульфоксимина (MSX). У С. тпкагйШ мочевина в отличие от аминокислот транспортируется в клетки и затем в цитоплазме гидролизуется до аммония. Действие MSX в концентрации, блокирующей активность фермента (рис. 4), приводит к временному увеличению внутриклеточной концентрации аммония. В этих условиях происходило возрастание экспрессии гена ^ЛМТРб (рис. 4). Таким образом, аммоний стимулирует экспрессию гена ^ЛМТРб.

а о

о &

з

m

К л

5

и о

1,0 г

§ 0,8

а о,б

я

-Ч

S 0,4

в

5 0,2

И

Контроль

1 ч

2ч

4ч

+ MSX

2 ta о ffl й О

■Я В

о

i"! В й

в 8 Е

Рис. 4. Действие MSX на относительный уровень экспрессии гена СтАМТ1;6 ( ) и активность глутаминсинтетазы (□) в вегетативных клетках штамма СС-124 C. reinhardtii, выращенных на среде с мочевиной в качестве источника азота

Полученные нами результаты позволяют предположить, что у C. транспор-

тер АшИ.6 может быть ответственен за вывод аммония из клеток.

Литература

1. González-Ballester D., Camargo A., Fernández E. Ammonium transporter genes in Chlamydomonas: the nitrate-specific regulatory gene Nit2 is involved in Amt1;1 expression // Plant Mol. Biol. 2004. Vol. 56. P. 863-878.

2. Barley mutants lacking chloroplast glutamine synthetase-biochemical and genetic analysis / Wallsgrove R. M., Turner J. C., Hall N. P., Kendally A. C., and Bright S. W. J. // Plant Physiol. 1987. Vol. 83. P. 155-158.

3. Von Wirén N., Gazzarrini S., Gojon A., Frommer W. B. The molecular physiology of ammonium uptake and retrieval // Curr. Opin. Plant Biol. 2000a. Vol. 3. P. 254-261.

4. Britto D. T., Siddiqi M. Y., Glass A. D., Kronzucker H. J. Futile transmembrane NH4+ cycling: a cellular hypothesis to explain ammonium toxicity in plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001a. Vol. 98. P. 4255-4258.

5. Britto D. T., Glass A. D., Kronzucker H. J., Siddiqi M. Y. Cytosolic concentrations and transmembrane fluxes of NH4+/ NH3. An evaluation of recent proposals // Plant Physiol. 2001b. Vol. 125. P. 523-526.

6. Glass A. D. M. Nitrogen use efficiency of crop plants: physiological constraints upon nitrogen absorption // Crit. Rev. Plant Sci. 2003. Vol. 22. P. 453-470.

7. Wang M. Y., Siddiqi M. Y., Ruth T. J., Glass A. Ammonium uptake by rice roots (II. Kinetics of 13NH4+ influx across the plasmalemma) // Plant Physiol. 1993. Vol. 103. P. 1259-1267.

8. AtAMT1 gene expression and NH4+ uptake in roots ofArabidopsis thaliana: evidence for regulation by root glutamine levels / Rawat S. R., Silim S. N., Kronzucker H. J., Siddiqi M. Y., Glass A. D. M. // J. Plant. 1999. Vol. 19. P. 143-152.

9. Three functional transporters for constitutive, diurnally regulated, and starvation-induced uptake of ammonium into arabidopsis zoots / Gazzarrini S., Lejay L., Gojon A., Ninnemann O., Frommer W., Von Wirén N. // The Plant Cell. 1999. Vol. 11. P. 937-947.

10. Differential regulation of three functional ammonium transporter genes by nitrogen in root hairs and by light in leaves of tomato / Von Wirén N., Lauter F. R., Ninnemann O., Gillissen B., Walch-Liu P., Engels C., Jost W., Frommer W. B. // J. Plant. 2000b. Vol. 21. P. 167-175.

11. Regulation by light of ammonium transport systems in Chlamydomonas reinhardtii / Ermilo-va E. V., Zalutskaya Z. M., Nikitin M. M., Lapina T. V., Fernandez E. // Plant, Cell and Environment. 2010. Vol. 33. P. 1049-1056.

12. Gorman D. S., Levine R. P. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardtii // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1965. Vol. 54. P. 1665-1669.

13. Shapiro B. M., Stadtman E. R. Glutamine synthetase (Escherichia coli) // Methods Enzymol. 1970. Vol. 17a. P. 910-922.

14. Five nitrate assimilation related loci are clustered in Chlamydomonas reinhardtii / Quesada A., Galván A., Schnell R. A., Lefebvre P. A., Fernández E. // Mol. Gen. Genet. 1993. Vol. 240. P. 387-394.

Статья поступила в редакцию 7 июня 2012 г.