CC BY
57
УДК 579.222
Вестник СПбГУ. Сер. 3. 2013. Вып. 2
Т. В. Лапина, Ж. М. Залуцкая, А. В. Аникина, Е. В. Ермилова
АККУМУЛЯЦИЯ И ЭКСПОРТ ГЛИЦЕРИНА ОДНОКЛЕТОЧНОЙ ЗЕЛЕНОЙ ВОДОРОСЛЬЮ СНЬАМУООМОКАБ ЯБШНАЯБТ11
Одно из фундаментальных свойств микроорганизмов состоит в их способности быстро и эффективно адаптироваться к изменениям в окружающей среде, большинство из которых воспринимаются одноклеточными организмами как стрессовые воздействия [1]. Процессы адаптации происходят на разных уровнях регуляции, и один из компонентов, вовлеченных в адаптивные системы многих микроорганизмов, как прокариот, так и эукариот, представлен специфической группой органических соединений, получивших название «совместимые растворимые вещества». Спектр соединений, используемых микроорганизмами в качестве совместимых, достаточно ограничен. К ним относятся некоторые сахара (трегалоза), полиолы (глицерин и гликозилгли-церин), аминокислоты (пролин и глутамат) и их производные (пролинбетаин, эктоин), а также четвертичные амины и их серосодержащие аналоги (глицинбетаин, карнитин, диметилсульфониопропионат), ^ацетилированные диаминокислоты и небольшие пептиды (Щ-ацетилорнитин и ^ацетилглутиминилглутимин амид). Эти соединения предотвращают отток воды из цитоплазмы клетки наружу и выполняют протекторную функцию, которая лучше всего проанализирована при действии гиперосмотического стресса. В этом случае их называют также осмолитами или осмопротекторами. Некоторые из них могут быть также криопротекторами и термопротекторами. Такая мультифункциональность в адаптивных ответах микроорганизмов показана, в частности для глицерина.
Роль глицерина в процессах адаптации наиболее подробно изучена у бактерий и дрожжей. У Chlamydomonas reinhardtii также была описана способность к синтезу глицерина в условиях гиперосмотического стресса [2, 3]. Вместе с тем неизвестно, синтезируют ли глицерин другие типы клеток, например гаметы. Не изучалась также возможная роль этого осмопротектора в адаптации Chlamydomonas к другим стрессовым воздействиям, таким как гипо- и гипертермия.
Нами проанализирована способность гамет синтезировать глицерин в условиях гиперосмотического стресса, а также действие гипо- и гипертермии на аккумуляцию/ экспорт глицерина вегетативными клетками C. reinhardtii.
Лапина Татьяна Викторовна — канд. биол. наук, научный сотрудник, Санкт-Петербургский государственный университет; e-mail: [email protected]
Залуцкая Жаннета Михайловна — канд. биол. наук, старший научный сотрудник, Санкт-Петербургский государственный университет; e-mail: [email protected]
Аникина Арина Витальевна — студентка, Санкт-Петербургский государственный университет; e-mail: [email protected]
Ермилова Елена Викторовна — д-р биол. наук, профессор, Санкт-Петербургский государственный университет; e-mail: [email protected], [email protected] © Т. В. Лапина, Ж. М. Залуцкая, А. В. Аникина, Е. В. Ермилова, 2013
Материалы и методы исследования
Штаммы и условия культивирования. В работе использовали штаммы C. rein-hardtii: CC-124 (nitlagglmt-) и CC-1690 (mt+), любезно предоставленные профессорами Э. Харрис (Коллекция Культур Chlamydomonas Университета г. Дюк, США) и Э. Фернандес (Коллекция Культур Chlamydomonas Университета г. Кордоба, Испания). Вегетативные клетки выращивали синхронно в среде TAP [4] в режиме освещения люминесцентными лампами 12 ч свет : 12 ч темнота при 23 °С (освещенность 2000 лк) [5]. Прегаметы, незрелые гаметы, получали из синхронной культуры вегетативных клеток, находящихся в логарифмической фазе роста. Для этого клетки ресуспендирова-ли в среде ТАР без азота и инкубировали в темноте в течение 24 ч. Гаметы получали из прегамет путем их освещения в течение 2 ч (освещенность 2000 лк) [6].
Жизнеспособность вегетативных клеток и гамет оценивали в процентах и определяли их окрашиванием растворами метиленового синего (0,2%) или эванс голубого (0,1%) с использованием светового микроскопа (окуляр х12, объектив х20) [7].
Линейные размеры клеток определяли микроскопически (объектив х40, окуляр х12) с помощью окуляр-микрометра. Объем клеток рассчитывали по формуле V = 4/3nr12r2, где r1 — малый радиус клетки, r2 — большой радиус клетки как среднее значение по результатам измерения 300 клеток.
Определение глицерина при гиперосмотическом стрессе. В опытах была использована концентрация соли, при которой секреция глицерина вегетативными клетками Chlamydomonas близка к максимальной [3]. Клетки в экспоненциальной фазе роста осаждали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 5 мин, и образовавшийся осадок ресуспендировали в среде ТАР, содержащей 200мМ NaCl.
Для определения глицерина использовали ферментативный метод, в котором глицерин фосфорилируется глицеринкиназой в присутствии АТФ [8]. Полученный глицерин-3-фосфат затем превращается в дегидроацетонфосфат под действием гли-церофосфатдегидрогеназы, что приводит к возрастанию концентрации НАДН, поглощение которого измеряли при длине волны 340 нм. Секретируемый глицерин определяли в супернатанте. Аккумулированный глицерин определяли в пробах, полученных из 2 х 107 клеток, после прогревания пробы в течение 10 мин при 80 °С и последующего осветления центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин [3].
Результаты исследования и их обсуждение
Секреция/аккумуляция глицерина гаметами в условиях гиперосмотического стресса. В природе переход C. reinhardtii к половому циклу развития является ответом микроорганизма на неблагоприятные условия, и, прежде всего, на недостаток азота в среде. При отсутствии в среде источников азота в вегетативных клетках запускается программа гаметогенеза, приводящая к формированию на свету гамет, фенотипически неотличимых от вегетативных клеток [6].
При формировании зиготы гаметы противоположных типов спаривания сливаются, утрачивая при этом клеточную стенку. Для того чтобы клетки не разрушались после утраты клеточной стенки, необходимо поддержание осмотического баланса. Роль осмотического баланса в регуляции процесса объединения гамет показана, например у Saccharomyces cerevisisae [9]. Нас интересовало, не увеличивается ли уровень глицерина в образующихся гаметах по сравнению с вегетативными клетками, и обла-
80-
60-
§
и 40-| и
5
6
& 20Ч
О-1
24
Время, ч
48
72
400-
дают ли они способностью к осмоадаптации. Как видно из результатов, представленных на рис. 1, оба типа клеток демонстрировали сходную динамику накопления/секреции глицерина в течение первых 6 ч действия стресса: внутриклеточное увеличение глицерина фиксировалось уже через один час. При этом уровень глицерина в гаметах по сравнению с вегетативными клетками не возрастал.
а Показано, что накопление
глицерина гаметами (см. рис. 1) достигало максимальных значений через 24 ч, тогда как регулируемая секреция глицерина в окружающую среду начинала происходить через 1-2 ч и непрерывно увеличивалась в течение 72 ч с начала действия стрессора. Таким образом, гаметы, так же как вегетативные клетки, обладают способностью к осмоадаптации. Однако, как видно из полученных результатов, вегетативные клетки синтезируют большие количества глицерина, чем гаметы. Эти данные согласуются с результатами изменения объема гамет и вегетативных клеток в процессе адаптации к гиперосмотическому стрессу. Так, объем гамет, составляющий в среднем 30,99 ± 8,5 мкм3, после инкубирования в среде с 0,2М №С1 достигал значений 53,16 ± 17,1 мкм3, т. е. происходи-
ло его увеличение в 1,8-1,9 раза. Объем вегетативных клеток изменялся в 6 раз и через 72 ч действия стрессора достигал 498,25 ± 363 мкм3 (исходный объем клеток — 74,56 мкм3). Не исключено, что разница в уровнях синтезированного глицерина отражает более низкую биосинтетическую способность гамет C. reinhardtii по сравнению с вегетативными клетками.
Действие высоких и низких температур на аккумуляцию/секрецию глицерина. Известно, что у ряда организмов глицерин выполняет протекторную функцию не только в условиях осмотического стресса, но также при действии гипо- и гипертермии [1012]. Для выяснения возможной роли глицерина в процессах адаптации C. reinhardtii к действию высоких и низких температур вегетативные клетки микроорганизма были подвергнуты тепловому и холодовому шоку.
300-
200-
100-
о-1
о
24
48
72
Время, ч
Рис. 1. Накопление (а) и секреция (б) глицерина вегетативными клетками (•) и гаметами (о) C. ттНиМи СС-124 в результате действия гиперосмотического стресса (0,2М №С1)
Во вставках представлена динамика накопления/секреции глицерина в течение первых 6 ч действия стрессора.
2,5
'о 2,0
8 1,5
§
& 1,0
0,5
и
0
23 °С
32 °С
40 °С
Рис. 2. Действие высокой температуры на накопление глицерина C. reinhardtii СС-124 (время действия стрессора 2 ч)
Как видно из рис. 2, при воздействии температуры 32 °С, блокирующей подвижность клеток, и 40 °С количество глицерина достоверно не изменялось. При этом также не происходило секреции соединения в среду, таким образом, глицерин не включен в адаптацию C. тикайII к гипертермии.
Анализ накопления глицерина в процессе холодовой адаптации в вегетативных клетках не выявил увеличения его внутриклеточной концентрации (рис. 3). При одновременном действии на клетки двух стрессоров, осмотического стресса и гипотермии,
8 г
С 6 -
1 4 -
в =
&
60
40
20
23 °С
10°С 10 °С + 0.2М ИаС!
23 °С
10°С 10°С + 0.2М ИаС!
Рис. 3. Действие низкой температуры на накопление (а) и секрецию (б) глицерина С. геткагйШ СС-124
уровни накопления и секреции глицерина были ниже, чем при действии 0,2М №С1 при нормальных температурах (см. рис. 1). По-видимому, это связано с подавлением синтеза белков и снижением ферментативной активности в условиях действия пониженных температур. Можно предположить, что у С. геткагйШ в ходе холодовой адаптации глицерин не является протекторной молекулой. Таким образом, по нашим данным, в условиях гиперосмотического стресса гаметы, так же как вегетативные клетки С. геткагйШ, способны к аккумуляции/экспорту глицерина, который не вовлечен в процессы адаптации к действию низких и высоких температур.
Литература
1. Ермилова Е. В. Молекулярные аспекты адаптации прокариот. СПб.: Химиздат, 2012. 340 с.
2. Ben-Amotz A., Avron M. Accumulation of metabolites by halotolerant algae and its industrial potential // Annu. Rev. Microbiol. 1983. Vol. 37. P. 95-119.
3. León R., Galván F. Halotolerance studies on Chlamydomonas reinhardtii: glycerol excretion by free and immobilized cells // J. Appl. Phycol. 1994. Vol. 6, N 1. P. 13-20.
4. Levine R. P., Ebersold W. T. Gene recombination in Chlamydomonas reinhardtii // Cold Spring Harbor. Symp. Quant. Biol. 1958. Vol. 23. P. 101-109.
5. León R., Galván F. Interaction between saline stress and photoinhibition of photosynthesis in the freshwater green algae Chlamydomonas reinhardtii. Implications for glycerol photoproduction // Plant Physiol. Biochem. 1999. Vol. 37. P. 623-628.
6. Beck C. F., Haring M. A. Gametic differentiation of Chlamydomonas reinhardtii // Int. Rev. Cytol. 1996. Vol. 168. Р. 259-301.
7. Castro-Concha L. A., Escorbedo R. M., de Lourdes Miranda-Ham M. Measurement of cell viability in in vitro cultures // Meth. Mol. Biol. Vol. 318. Plant cell culture protocols, Second edition / ed. by V. M. Loyola-Vargas and F. Vazquez-Flota. Totowa, NJ: Humana Press Inc., 2006. P. 71-76.
8. Wieland O. H. Glycerol: UV-method // Bergmeyer J., Brassl M. Methods in enzymatic analysis. Metabolites 1: Carbohydrates. Weinheim: Verlag-Chemie, 1984. Vol. VI. P. 504-510.
9. Philips J., Herskowitz I. Osmotic balance regulates cell fusion during mating in Saccharomyces cerevisiae // J. Cell Biol. 1997. Vol. 138. P. 961-974.
10. Tamas M. J., Hohmann S. The osmotic stress response of Saccharomyces cerevisiae // Top. Curr. Genet. 2003. Vol. 1. P. 121-200.
11. Hayashi M., Maeda T. Activation of the HOG pathway upon cold stress in Saccharomyces cerevisiae // J. Biochem. 2006. Vol. 139 (4). P. 797-803.
12. Heat stress activates the yeast high-osmolarity glycerol mitogen-activated protein kinase pathway, and protein tyrosine phosphatases are essential under heat stress / Winkler A., Arkind C., Mattison C. P., Burkholder A., Knoche K., Ota I. // Eukaryotic Cell. 2002. Vol. 1. P. 163-173.
Статья поступила в редакцию 11 декабря 2012 г.
