CC BY
67
28
БИОМАРКЕРЫ
M. Yu. Lebedev1, M.N. Sholkina1, S.B. Korablev1, V. V Novikov3
EXPRESSION OF ACTIVATION RECEPTORS ON PERIPHERAL BLOOD LYMPHOCYTES IN PATIENTS WITH BURN, TRAUMA INJURE OF BRAIN AND MECHANICAL TRAUMA IN EARLY POSTTRAUMATIC PERIOD
‘Research Institute of Traumatology and Orthopedy, Nizhni Novgorod 2Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Nizhni Novgorod
ABSTRACT
Our study is devoted to research of expression of activation antigens (CD25, CD71 and CD26) on peripheral blood lymphocytes in patients with bum, trauma injure of brain (TBI) and mechanical trauma in early posttraumatic period. It was shown that in acute period of all traumas there is increase of relative number of CD25+ and CD71+lymphocytes. In patients with TBI and mechanical trauma the contents of these cells is statistically authentically increased during all first week after a trauma. In burned there is only tendency to increase of this cells. The increase of CD26+ lymphocytes number in early posttraumatic period was in patients with TBI and burned patients. The intensity of luminescence of all investigated lymphocytes was reduced in comparison with a control in all cases. Thus, our researches have shown, that results of traumas are identical changes of cells immunity. It expresses in increase of number of lymphocytes with activation immunophenotype. Probably, it can be contraindication to assignment by the patient with various traumas of immunity drugs, immediately influential in processes of T-lymphocytes activation such as drugs of cytokines and their inductors.
М.Ю. Лебедев1, М.Н.Шолкина1, С. Б, Кораблев1, В.В. Новиков2
ЭКСПРЕССИЯ АКТИВ АЦИОННЫХ РЕЦЕПТОРОВ НА ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У ПАЦИЕНТОВ С ТЕРМИЧЕСКОЙ, ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ И
МЕХАНИЧЕСКОЙ ТРАВМОЙ В РАННЕМ ПОСТТРАВМАТИЧЕСКОМ ПЕРИОДЕ
'НИИ травматологии и ортопедии, Н. Новгород 2НИИ молекулярной биологии и региональной экологии ННГУ им. Н.И.Лобачевского, Н. Новгород
РЕЗЮМЕ
Данная работа посвящена исследованию экспрессии активационных антигенов (CD25, CD71 и CD26) на лимфоцитах периферической крови пациентов с тяжелой термической, черепно-мозговой (ЧМТ) и механической травмой в раннем посттравматическом периоде. Установлено, что в острый период всех видов травм происходит увеличение относительного количества CD25+ и CD71+-лимфоцитов. У пациентов с черепно-мозговой и механической травмой содержание этих клеток статистически достоверно повышено на протяжении всей первой недели после травмы. У тяжелообожженных имеется только тенденция к увеличению относительного количества CD25+ и CD71 +-лимфоцитов. Значительное увеличение содержания СЮ26+-лймфоцитов в раннем посттравматическом периоде прослеживалось у пациентов с ЧМТ и тяжелообожженных. Интенсивность свечения всех лимфоцитов с активационным фенотипом во всех случаях была сниженной по сравнению с контролем. Таким образом, наши исследования показали, что все виды травм вызывают одинаковые изменения показателей клеточного иммунитета в сторону увеличения количества лимфоцитов с активационным фенотипом. Вероятно, это может являться противопоказанием к назначению больным с различными видами травм рада иммуно-тропных препаратов, непосредственно влияющих на процессы активации Т-лимфоцитов (препараты цитокинов и их индукторов).
ВВЕДЕНИЕ
Современные подходы к лечению последствий тяжелой травмы различной этиологии невозможны без учета функционального состояния иммунной системы пострадавших [2; 3; 4; 9; 16], Несмотря на определенные различия в механизмах развития посттравмати-ческих иммунных нарушений у тяжелообожженных, пациентов с черепно-мозговой и механической травмой [9; 11; 12] имеются общие тенденции в изменении содержания лимфоцитов периферической крови. Изменения выражаются в снижении общего числа лимфоцитов, в уменьшении количества В- и Т-лимфоци-тов [2; 4; 6; 7], нарушении соотношения Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток с изменением иммунорегу-ляторного индекса [9; 11].
Вместе стем для диагностики иммуннойнедостаточ-ностнеобходимаинформацияофункциональномсосго-янш иммунокомпетентных клеток. Самые разнообразные проявления функциональной активности иммуноци-тов сводятся к единому базисному процессу-активации клеток и как следствие этого к изменению их мембранного рецепторного репертуара. В первую очередь, изменяется плотность экспрессии так называемых активационных рецепторов или маркеров активации.
Цель настоящего исследования - изучение динамики Т-лимфоцитов и их субпопуляций (Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов), а также экспрессии активационных антигенов на лимфоцитах периферической крови пациентов с тяжелой термической, черепно-мозговой и механической травмой в раннем по-сттравматическом периоде как начальном этапе формирования иммунных нарушений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Обследовано 138 пациентов с различными видами травм, из них 45 - пострадавших от термической травмы, в возрасте от 18 до 67 лет с площадью ожогового поражения от 30 до 65 % поверхности тела. Черепно-мозговую травму (ЧМТ) средней и тяжелой степени имели 58 пациентов, у 18 - повреждения головного мозга средней и тяжелой степени тяжести сочетались с переломами костей скелета (СЧМТ). Изолированные переломы длинных трубчатых костей были у 17 больных. В течение первых 3 суток после травмы исследования проводили ежедневно, в дальнейшем -через сутки. Все пострадавшие обследовались на но-сительство маркеров вирусных гепатитов В и С, ВИЧ и сифилиса. Результаты всех анализов были отрицательными. Направленные иммунокорригирующие мероприятия обследуемым больным не назначались.
Мононуклеарные клетки выделяли на одноступенчатом фиколл-тразограффовом градиенте (1,077 мг/мл) по методу, описанному Д.К. Новиковым [5]. Жизнеспособность клеток оценивали по тесту стрипановым синим. Жизнеспособность составляла 96-98 %. Клетки выделяли не позднее 2 часов после забора крови. Мембранные рецепторы исследовали методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью широкой панели моноклональных антител (МКА) серии ИКО [14].
Количество основных субпопуляций лимфоцитов определяли с помощью МКА ИКО-90 (против СЮЗ-антигена), ИКО-86 (против С04-антигена) и ИКО-31
(против CD8-airmreHa). Поверхностные активадион-ные антигены выявляли с помощью ИКО-92 (против CD71-amnreHa), ИКО-Ю5 (против С025-антигена), ИКО-147 (против СВ26-антигена). Все моноклональные антитела получены и охарактеризованы А.Ю. Барышниковым [1]. Подсчитывали число светящихся клеток на 100 лимфоцитов. Клетки с морфологией моноцитов и нейтрофилов при подсчете не учитывали. Интенсивность свечения оценивали визуально.
В качестве контрольной группы исследовали кровь 35 клинически здоровых добровольцев (средний возраст - 36 лет). Экспрессия активационных антигенов оценивалась вне периода эпидемии гриппа.
Полученные результаты статистически обрабатывали по методу Стьюдента. Результаты выражали в виде М±т. При р<0,05 результаты считались достоверными. Корреляционный анализ проводили линейным параметрическим методом (рассчитывали коэффициент Пирсона). Статистические расчеты проводили с использованием пакета программ “Statistica” (StatSoft-Russia, 1998).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние ожоговой, черепно-мозговой и механической травмы на число CD3+, CD4+ и CD8+-лимфоцитов периферической крови
Исследования показали, что популяционный состав лимфоцитов изменяется в самые ранние сроки с момента ожоговой, черепно-мозговой и механической травмы. В первую очередь это относится к числу CD3+H С04+-лимфоцитов, достоверное снижение которых выявлялось уже в первые сутки (табл. 1). Уменьшение относительного числа Т-лимфоцитов и Т-хелперов сопровождалось значительным снижением интенсивности их свечения. Изменение количества CD8+-KneroK и снижение интенсивности их свечения на первой неделе после травмы было выражено в меньшей степени. Достоверное уменьшение числа С08+клеток было обнаружено только у пациентов с ЧМТ на 4-7 сутки от момента травмы. У пациентов с переломами длинных трубчатых костей имелась тенденция увеличению содержания цитотоксических Т-лимфоцитов иусилению интенсивности их свечения в первые трое суток после повреждения. При других видах травм достоверных различий между числом CD8+-icneroK у пациентов и клинически здоровых лиц не было вьивлено. При этом соотношение СВ4+/С08+-лимфоцитов, так называемый иммунорегу-ляторный индекс, был, как правило, снижен за счет уменьшения числа Т-хелперов. Продолжительность снижения количества СЮЗ+и С04+-клеток охватывала весь острый период ожоговой и травматической болезни. Тяжелообожженные и пациенты с СЧМТ отличались крайне низкой интенсивностью свечения Т-клеток и их субпопуляций. У пациентов с ожоговой травмой в большинстве случаев не нормализовывались показатели Т-лимфоцитов и Т-хелперов и по прошествии 2 месяцев после травмы.
Влияние ожоговой, черепно-мозговой и механической травмы на число лимфоцитов периферической крови с активационным фенотипом
Результаты исследования активационных антигенов показали, что в острый посгтравматический период уве-
Относительное содержание антиген-положительных лимфоцитов периферической крови геиеза после различных видов травм, %
Содержание лимфоцитов Черепно-мозговая травма, п=58 СЧМТ, п=18 Изолированный перелом длинных костей, п=17 Тяжелая ожоговая травма, п=45 Здоровые доноры, п=35
Время от момента травмы (сутки)
1-3 4-7 1-3 4-7 1-3 4-7 1-3 4-7
СБЗ+ 23,1±1,6* 17,2+1,0* 18,0±1,3* 30,0±1,1* 45,2±1,3 31,0±1,4* 27Д±3,8* 33,5+4,7* 54+2,2
СБ4+ 7,2±1,2* 7,2±1,3* 6,7±2,2* 12,0±2,0* 20,0±8,0* 16,4±6,2* 12,9+1,9* 13,6+2,7* 31,4±1,2
СБ8+ 17,8+1,7 13,8±0,7* 18,6+0,4 16,8+1,2 25,4±12,2 19,5+1,0 24,3±1,3 20+5,1 24,8±1,3
С04/ СБ8 0,7±0,4 0,76±0,2 0,36±0,1 0,71 ±0,3 0,8±0,6 0,86±0,3 0,53±0,2 0,55±0,2 1,5-2,5
С025+ 18,8±1,4* 18,9±1,2* 1 31,б±1,2* 20,0+2,0* 22,3+1,3* 19,2±1,5* 16,7±3,1 20±5,7 15,9±1,8
СБ71+ 13,5±2,2 17,3±2,0* 24,0±1,0* 15,1±1,0* 17,7±0,7* 18,8±1,2* 17,5±3,2 13±2,9 11,5±2,3
СЮ26+ 15,5±1,2 19,8±1Д* 11,2±0,9 15,5±1,1 16,0±1,3 13,9±1,4 15,9±2,9 19,9±6,1 14,9±1,5
* Достоверность различия со здоровыми донорами - р<0,05.
лячиваются относительного количества С025+ и СВ71+-лимфоцитов. У пациентов с ЧМТ, СЧМТ и переломами длинных трубчатых костей содержание этих клеток статистически достоверно повышено на протяжении всей первой недели после травмы. У тяжелообоженныхимеет-ся только тенденция к увеличению относительного количества С025+ и СО! 1 +~лимфоцитов в раннем посправма-тическом периоде.
Значительное увеличение содержания СВ26+лимфоцитов в раннем посггравматическом периоде прослеживалось у пациентов с ЧМТ и тяжелообоженных (см. таблицу). У пострадавших с СЧМТ в течение первой недели после травмы количество СВ26+-лимфоцитов было недостоверно увеличено, а у больных с переломами длинных трубчатых костей незначительно снижено по сравнению с контрольной группой.
Интенсивность свечения всех лимфоцитов с активационным фенотипом была сниженной по сравнению сконтролем.
В отличие от пострадавших от механической травмы, у тяжелообожженных при мониторинге количества лимфоцитов с активационным фенотипом была выявлена высокая вариабельность их содержания в пределах непродолжительных интервалов времени. В течение суток относительное содержание СБ25+, СБ71+и СБ26+-лимфоцитов у тяжелообожженных изменялось на 400 - 600 %, тогда как изменения количества клеток с активационным фенотипом у пациентов с ЧМТ, СЧМТ и переломами длинных трубчатых костей происходили в пределах 30-70 %, Вероятно, это объясняет тот факт, что при сопоставимых средних значениях содержания исследуемых антиген-положительных лимфоцитов при всех видах травм у тяжелообожженных не выявлено статистически достоверных изменений.
Корреляционный анализ между количеством клеток с активационным фенотипом и содержанием Т-кле-ток и их субпопуляций показал наличие многочисленных положительных взаимосвязей в период 1-7-х суток от момента травмы. В основном корреляционные взаимосвязи выявляются между количеством СБЗ+- и СХ>8+-клеток, с одной стороны, и уровнем СШ5+, СБ71+ и С02б+-лимфоцитов, с другой.
ОБСУЖДЕНИЕ
Изменения в содержании различных субпопуляций Т-лимфоцитовпериферическойкровипослеожоговойиме-ханической травмы довольно подробно описаны [2; 3; 4; 9;Щ. Все авторы сходятся на том, что ожоговое поражение оказывает на клеточное звено иммунитета большее воздействие, чем другие виды травм [9; 12].
Согласно нашим данным при всех видах травм уже в ранний посттравматический период происходит достоверное снижение Т-лимфоцитов и Т-хелперов. Методом непрямой иммунофлюоресценции было обнаружено, что в первые 3 суток от момента травмы снижается число СБЗ4 и С04+-лимфоцитов, но не СБ8+-кле-ток. При этом снижается соотношение СВ4+/СВ8+-кле-ток (иммуиорегуляторного индекса). Самое низкое количество Т-лимфоцитов и Т-хелперов было выявлено у пациентов с ЧМТ и СЧМТ. Ожоговая травма вызывала снижение относительного числа СБЗ+ и С04+-клеток в меньшей степени по сравнению с механической травмой.
Имеющиеся в литературе сведения об активационном фенотипе лимфоцитов периферической крови после тяжелой ожоговой травмы довольно противоречивы. Ряд авторов описывают снижение числа СВ25+ и С071 +-лимфоцитов у ожоговых больных [6; 18; 21]. Результаты других исследований свидетельствуют об увеличении количества этих клеток после термической травмы [13; 15; 17]. При механической травме большинство исследователей указывают на снижении экспрессии лимфоцитами периферической крови активационных антигенов [10; 20]. Наши исследования показали, что на фоне механической и термической травмы у больных растет число клеток с активационным фенотипом.
Особенностью экспрессии маркеров активации у тяжелообоженных является ее крайняя нестабильность во время острого периода. Вероятно, именно высокая вариабельность клеток с активационным фенотипом объясняет разноречивость данных, полученных различными авторами, и отсутствие статистически достоверных различий у данной категории пациентов по срав-
нению с контрольной группой.
В крови больных с механической травмой содержание С025+, СП71+и СВ26+-лимфоцитов значительно стабильнее. У таких пациентов увеличивается содержание СБ25+, СБ71+ и СВ26+-лимфоцитов, что в целом повторяет направленность изменений этих клеток у обожженных.
При всех видах травм выявлено снижение интенсивности свечения клеток с активационным фенотипом. Оно указывает, что активационные процессы в иммунной системе являются начальными элементами развития посттравматической иммунной недостаточности. Так, низкая интенсивность свечения клеток, несущих активационные рецепторы может объясняться сбрасыванием части мембранных форм рецепторов в жидкую фазу (переход в растворимую форму). Такое поведение СЮ25-антигена характерно для ожоговой болезни [19]. Повышение концентрации вСО25-антигена в сыворотке на фоне увеличения количества С025+-клеток скорее указывает на то, что повышение экспрессии данного антигена - и признак активации, и элемент иммуносупрессии. Другими словами, посттравматическая активация иммунокомпетентных клеток - начальная фаза развития последующей иммуносупрессии.
Резкие изменения показателей клеточного иммуни-тета в ранние сроки после механической и ожоговой травмы ставят под вопрос целесообразность проведения иммуностимулирующей терапии в начальном посправма-таческом периоде. Более того, высокая вариабельность количества лимфоцитов с активационным фенотипом, как признак нарушения центральных механизмов иммунорегуляции и переход элементов клеточного иммунитета на уровень саморегуляции может стать противопоказанием к назначению ряда иммунотропных препаратов (цитокинов и их индукторов), непосредственно влияющих на процессы активации Т-лимфоцитов. Скорее всего, на данном этапе наиболее приемлема иммунозамес-тительная терапия, в том числе массивные дозы иммуноглобулинов, а также оправдана иммуносупрессивная терапия, например гормонотерапия и т.д.
Для более полного понимания механизма развития иммунной недостаточности после различных видов травм, видимо, необходимо комплексное изучение роли многих биологически активных молекул, составляющих единую иммунорегуляторную сеть.
Таким образом, наши исследования показали, что все виды травм вызывают однонаправленные изменения показателей клеточного иммунитета. Наиболее выраженное снижение содержания Т-лимфоцитов и их субпопуляций и одновременное повышение количества лимфоцитов сактивационнымфенотипомнаблюдается при черепно-мозговой травме, сочетанной с переломами длинных трубчатых костей.
ЛИТЕРАТУРА
1. Барышников А.Ю., Тоневицкий А.Г. Моноклональные антитела в лабораторной практике. - М.: ВНТИЦ, 1997.
2. Горбунов В. И. Лихтерман Л.Б., Ганнушкина И. В. Иммунопатология травматической болезни головного мозга. - Ульяновск, 1996.
3. Горбунов В.И. Травматическая болезнь головного Мозга; периоды течения и иммунопатологические синдромы: Автореф. диссерт. на док. мед. Наук. ~ М. - 2000.
4. Долгушин И.И., Эберт Л.Я., Лифшиц Р.И. Иммунология травмы. - Свердловск: Издательство уральского университета, 1989.
5. Новиков Д.К, Новикова В.И. Клеточные методы иммунодиагностики. - Минск: Беларусь, 1979. - С. 25-27.
6. Смирнов B.C., Фрейдлин И.С. Иммунодефицитные состояния. - С.-Петербург: Фолиант, 2000.
7. Чеснокова И.Г. Изменения в иммунной системе при травматической болезни (клинико-патогенетическое, прогностическое значение и коррекция) // Иммунология. - 2000. - N 6. - С. 39-42.
8. ЯртинА.А. Основы иммунологии.-М.: Медицина, 1999.
9. Barlow Y.T. T-lymphoeyte and immunosuppresion in the burned patient. A review. // Burns. - 1994. - Vol. 20. -P. 487.
10. Decker D., Lindemann C., Low A. et al. Changes in the cytokine concentration (11-6,11-8, Il-lra) and their cellular expression of embrane molecules (CD25, CD30, HLA-DR) after surgical trauma II Zentralbl. Chir. - 1997. -Vol. 122. -№ 3. -P.157-164.
11. Hansbrough J.F., BenderE.M., Zapata-Sirvent R, Anderson J. Altered helper and suppressor lymphocyte population in surgical patients: a measure of postoperative immunosuppression // Am. J. Surg. - 1984. - Vol. 148. ~P. 303-307.
12. Hansbrough J.F., Zapata-Sirvent R„ Hoyt D. Postburn immune suppression: an inflammatory response to the burn wound?// J. Trauma. - 1990.-Vol.30.-N 6.-P. 671— 674.
13. Kataranovski М., Kuuk J., Coli M. et al. Post-traumatic activation of draining lymph node cells, II. Proliferative and phenotypic characteristics II Burns. - 1994. - Vol. 20. -N 5.-P. 403-408.
14. Lebedev M.Ju., Sholkina M.N., Utkina T.M. ei al. Immunophenotype of peripheral blood lymphocytes in burn patients// Rus. J. Immun. -2001. - Vol. 6 - N1. - P. 47-54.
15. Maldonado M.D., Venturoli A., Franco A., Nunez-Roldan A. Specific changes in peripheral blood lymphocyte phenotype from burn patients. Probable origin of the thermal injury-related lymphocytopenia 11 Bums. - 1991. -Vol. 17-N3.-P. 188-192
16. Munster A.M. The immunological response and strategies for intervention In: Herndon DN, editor. Total burn care London, Philadelphia, Toronto, Sydney, Tokyo: Saunders, 1996. - P. 279 - 292.
l7.Schleter B., Konig W., Koller M. et al. Differential regulation of T- and B-lymphocyte activation in severely burned patients // J. Trauma. -1991. - Vol. 31. - N 2. - P. 239-246.
18. Teodorczyk-Injeyan J.A., Sparkes B.G., Mills G.B. et al. Impairment of T cell activation in bum patients: a possible mechanism of thermal injury-induced immunosuppression II Clin. Exp. Immunol. -1986. - Vol. 65. -N 3. -P. 570-581.
19. Teodorczyk-Injeyan J.A., Sparkes B.G., Mills G.B., Peters W.J. Immunosuppression follows systemic T lymphocyte activation in the burn patient II Clin. Exp. Immunol. -1991. - Vol. 85. -N 3. -P. 515-518.
20. Wakefield C.H., Carey P.D., Foulds S. et al Changes in major histocompatibility complex class II expression in monocytes and T cells of patients developing infection after surgery // Br. J Surg. -1993. - Vol. 80. - N 2. - P. 205-209.
21. Zapata-Sirvent R.L., Hansbrough J.F. Temporal analysis of human leukocyte surface antigen expression and neutrophil respiratory burst activity after thermal injury //Bums. -1993. - Vol. 19. -N 1. ~P. 5-11.
