CC BY
144
Микробиология
Экспресс-метод выбора антибиотика для лечения больных муковисцидозом
В.В. Тец, Г.В. Тец, K.M. Кардава, Е.И. Смирнова, Т.Е. Гембицкая
Работа посвящена изучению возможности использования тест-системы "ВыборАнтибиотика" для экспресс-диагностики инфекций у больных муковисцидозом. Представлены результаты сравнительной оценки эффективности нового и стандартного методов исследования. Показана возможность назначения антибиотиков через 6-20 ч на основе данных, полученных с помощью системы "ВыборАнтибиотика". Изучены бактерии и устойчивые микробные ассоциации, ранее не описанные у больных муковисцидозом.
Ключевые слова: муковисцидоз, микробиологическая диагностика, "ВыборАнтибиотика", неизвестные ранее бактерии.
Введение
Практическая медицина нуждается в возможности быстрого выбора антибиотика, способного справиться с инфекцией.
Основные методы, разработанные в 1950-х годах и считающиеся классическими, требуют нескольких дней и, как оказалось, часто не дают корректных результатов. Получаемые в этих исследованиях данные позволяют только определить чувствительность выделенного микроба к антибиотику, при этом чаще всего неизвестно, были ли в изучаемом материале другие микроорганизмы и какова их чувствительность к этим препаратам. Нередко из патологического материала вообще не удается выделить бактерии.
Молекулярные методы определения антибио-тикочувствительности пока также не дают достоверных результатов. Они занимают сравнительно мало времени и позволяют выявить гены
ФГБОУ ВО "Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова" МЗ РФ.
Виктор Вениаминович Тец - профессор, зав. кафедрой микробиологии и вирусологии.
Георгий Викторович Тец - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаборатории иммунологии Научно-исследовательского центра.
Кристина Малдесовна Кардава - ст. лаборант кафедры микробиологии и вирусологии.
Екатерина Игоревна Смирнова - ассистент кафедры микробиологии и вирусологии.
Татьяна Евгеньевна Гембицкая - профессор, рук. отдела терапевтической пульмонологии НИИ пульмонологии.
Контактная информация: Тец Виктор Вениаминович, vtetzv@yahoo.com
устойчивости к антибиотикам в патологическом материале. Однако оказалось, что в геномах разных бактерий имеется много генов антибиоти-коустойчивости, которые не проявляют активности на фенотипическом уровне и не влияют на реальную чувствительность бактерий к лекарственным препаратам [1]. Подобная гипердиагностика устойчивости может способствовать неоправданному уменьшению числа препаратов, используемых в терапии.
Таким образом, в лабораторной диагностике заболеваний, вызванных бактериями, возник серьезный кризис, который тормозит эффективное лечение пациентов. Существование этой проблемы стало очевидным в последние 20 лет. За этот период значимо увеличилось количество известных заболеваний бактериальной этиологии. Установлено, что большая часть бактерий, окружающих человека и способных вызывать у него патологию, остаются неизвестными, поскольку пока не найдены способы их культивирования. Эти микробы так и называются - "пока не культивируемые". Предполагают, что они могут расти только в присутствии симбионтов и получают от них то, что пока не научились добавлять в питательные среды.
Попытка совместить решение двух задач лабораторной диагностики: выращивание пока не культивируемых бактерий и быстрый выбор препарата для лечения - предпринята в лабораторной тест-системе "ВыборАнтибиотика" (ТСВА). Эта тест-система содержит новую среду, обеспечивающую рост максимально возможного числа бактерий и, что очень важно, их сообществ [2, 3]. Действие антибиотиков на бактерии оценивается
Микробиология
на основании нового подхода. Его смысл заключается в том, что антибиотики добавлены в среду исходя из той концентрации, которая создается в очаге поражения. Именно такая концентрация может действовать на бактерии в очаге вне зависимости от свойств бактерий, известных как возбудители данной патологии.
В алгоритм действия тест-системы заложена идея о том, что в материале от больного могут содержаться известные и неизвестные бактерии и их различные ассоциации и главная цель - узнать, действует ли антибиотик в заданной концентрации на все бактерии из патологического материала. Таким образом, ТСВА не направлена непосредственно на выделение чистых культур, она не идентифицирует напрямую возбудители или их группу, но она позволяет ответить на вопрос, какой препарат будет эффективен для лечения заболевания, при котором эти микробы высеваются. Такой анализ занимает 6-20 ч и позволяет одновременно оценить эффективность действия 10 антибиотиков. В дальнейшем бактерии, выросшие на среде тест-системы, могут быть дополнительно изучены для выделения чистых культур и их идентификации.
Одним из важных полимикробных заболеваний, для которого идентифицированы не все возможные возбудители, является муковисцидоз [4-6].
В связи с изложенным целью работы было изучение возможности использования ТСВА у больных муковисцидозом и сравнение полученных при помощи этой тест-системы результатов с данными стандартных методов лабораторного исследования, проведенных согласно существую щим рекомендациям.
Материал и методы
Материалом для исследования служила мокрота больных муковисцидозом (n = 10). Время между забором материала и включением его в исследование не превышало 6 ч, материал хранили при температуре 4°С.
Использовали следующие питательные среды: Уриселект 4 (Bio-Rad Laboratories SAS, Франция), колумбийский и шоколадный агары (bioMérieux, Франция). Идентификацию изолированных бактерий проводили с учетом тинкто-риальных, морфологических, культуральных и биохимических свойств в соответствии с рекомендациями [7].
Микроскопия: мазки окрашивали по Гра-му, использовали микроскоп Axiostar plus (Carl Zeiss, Германия), оснащенный иммерсионным объективом A-Plan 100х/1.25, окуляр 10х (Carl Zeiss, Германия).
Биохимическую активность микроорганизмов определяли с помощью системы Vitek 2 (bioMérieux, Франция).
Идентификацию бактерий по протеому (совокупность экспрессируемых в клетке белков) проводили при помощи масс-спектрометрии MALDI-TOF (matrix assisted laser desorption/ion-ization-time of flight - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация с времяпролет-ным разделением) с пробоподготовкой на микро-титрационных планшетах AnchorChip (Bruker Corporation, США). Идентификация проводилась относительно MALDI Biotyper Database (Bruker Taxonomy Tree) (Bruker Corporation, США).
Чувствительность к антибиотикам определяли методом дисков (HiMedia Laboratories Pvt Ltd, Индия; Научно-исследовательский центр фармакотерапии, Россия).
Тест-системы "ВыборАнтибиотика" также использовали для культивирования бактерий и оценки действия на них антибиотиков (амокси-циллин/клавуланат, азитромицин, цефтриак-сон, левофлоксацин, меропенем, линезолид, то-брамицин, ванкомицин, клиндамицин, рифам-пицин) ("Новые Антибиотики", Россия).
Результаты
При использовании ТСВА рост максимально возможного количества бактерий, имеющихся в патологическом материале, происходит в контрольных лунках, не содержащих антибиотиков. Остальные 10 лунок ТСВА содержат антибиотики в той концентрации, в какой они встречаются в очаге инфекции. Поскольку среда, использованная в системе, обеспечивает рост разных бактерий в минимальные сроки, первый учет результатов проводили уже через 6 ч после засева и инкубации при 37°С, а окончательный учет - через 18-20 ч инкубации.
После 6-20 ч роста на среде в ТСВА для каждого из больных были определены препараты, эффективные по отношению ко всем бактериям, давшим рост в этих условиях. Через 48-72 ч в стандартных лабораторных схемах исследования из того же материала были получены чистые культуры бактерий, для которых чувствительность к антибиотикам определялась методом дисков. При сравнении результатов, полученных двумя принципиально разными методами, было выявлено значительное их сходство (рисунок).
Обращает на себя внимание, что максимальное совпадение выявленной чувствительности к антибиотикам приходится на препараты широкого спектра действия, такие как амоксицил-лин/клавуланат, цефтриаксон, тобрамицин и
Антибиотикорезистентность бактерий у больных с легочной формой муковисцидоза, определенная с помощью стандартного метода исследования и с использованием ТСВА.
рифампицин. В то же время у препаратов, имеющих меньший спектр активности по отношению к различным неродственным бактериям, в ТСВА была обнаружена меньшая активность, чем при исследовании чистых культур (табл. 1). Очевидно, что возникновение подобной ситуации было неизбежным, поскольку в ТСВА чувствительность к антибактериальным препаратам одновременно определялась у смеси бактерий, в то время как в стандартном лабораторном исследовании действие антибиотиков оценивали на чистых культурах.
Результаты исследования по каждому из больных указывают на то, что для проб № 1, 2 и 5 ни один из 10 препаратов не оказался эффективным в отношении всех бактерий, имевшихся в патологическом материале. Для этих же больных в стандартном методе исследования предлагается несколько эффективных препаратов. Такой результат связан с тем, что при выделении чистой культуры предполагаемого возбудителя теряется часть микробов, которые могли быть причаст-ны к развитию данного заболевания. Это служит одним из объяснений имеющихся в некоторых
Таблица 1. Чувствительность к антибиотикам, определенная разными методами
Номер Эффективные препараты (чувствительность к антибиотикам)
больного ТСВА стандартный метод
1 - Меропенем, левофлоксацин
2 - Амоксициллин/клавуланат, азитромицин, цефтриаксон, левофлоксацин, меропенем, клиндамицин, рифампицин
3 Амоксициллин/клавуланат, левофлоксацин, цефтриаксон, линезолид, тобрамицин, ванкомицин, клиндамицин Цефтриаксон, клиндамицин, рифампицин
4 Ванкомицин Амоксициллин/клавуланат, азитромицин, цефтриаксон, левофлоксацин, меропенем, клиндамицин, рифампицин
5 - Азитромицин, цефтриаксон, левофлоксацин, меропенем, клиндамицин, рифампицин
6 Цефтриаксон, тобрамицин Азитромицин, цефтриаксон, левофлоксацин, меропенем, клиндамицин, рифампицин
7 Азитромицин, цефтриаксон, тобрамицин, клиндамицин, рифампицин Амоксиклав, азитромицин, клиндамицин, меропенем, линезолид, тобрамицин, ванкомицин
8 Амоксиклав, цефтриаксон, линезолид, рифампицин Амоксициллин/клавуланат, азитромицин, клиндамицин, меропенем, линезолид, тобрамицин, ванкомицин
9 Левофлоксацин, линезолид, рифампицин Меропенем, левофлоксацин
10 Амоксициллин/клавуланат Амоксициллин/клавуланат, азитромицин, клиндамицин, меропенем, линезолид, тобрамицин, ванкомицин
Микробиология
случаях несовпадений между данными лабораторного исследования и результатами лечения. Больным, для которых не оказалось эффективных препаратов (по данным ТСВА), может быть подобрана терапия, состоящая из двух антибиотиков. Для этого визуально оценивают рост бактерий в тест-системе в присутствии различных антибиотиков и выбирают препараты, на среде с которыми имеется минимальное количество колоний, не совпадающих по внешнему виду.
Для идентификации бактерий, давших рост в ТСВА, мы провели их дальнейшее исследование. При этом изучали как бактерии, выросшие в контрольных лунках, так и бактерии, выросшие в присутствии 10 использованных антибиотиков. В составе патологического материала, полученного от больных, в ТСВА было идентифицировано больше бактерий, чем при стандартном исследовании (табл. 2).
Кроме чистых культур на среде ТСВА были выделены смешанные сообщества - устойчивые комбинации бактерий, которые можно было многократно пересевать и невозможно разделить на самостоятельно растущие бактерии. У 6 больных комбинации включали грамположительные кокки и грамположительные палочки, у 5 человек выявлены группы из грамположительных кокков, грамположительных и грамотрицатель-ных палочек и у 3 человек - грамположительные кокки и грамотрицательные палочки.
Обсуждение
Полученные результаты свидетельствуют о том, что стандартные методы позволяют выделить только часть микробов из материала от больного. В настоящем исследовании таким способом были выявлены Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli и Enterobacter cloacae и только для них определена чувствительность к антимикробным препаратам. При этом остались невыявленными и неизученными также известные возбудители, встречающиеся при муковисцидозе, - Achromobacter xylosoxidans, Stenotrophomonas maltophilia, которые, по разным данным, включая настоящее исследование, встречаются у 10% больных [8].
Обнаруженные нами другие бактерии, в том числе спорообразующие, а также неразделенные устойчивые смеси, тоже могут играть роль у больных с легочной формой муковисцидоза. Полученные данные указывают на то, что существующие представления о бактериях, участвующих в формировании патологического процесса у больных муковисцидозом, остаются неполными. Это соответствует результатам других исследователей, свидетельствующим о том,
Таблица 2. Бактерии, выделенные из патологического материала
Номер Бактерии
больного ТСВА стандартный метод
1 Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas
Staphylococcus aureus Candida albicans aeruginosa
2 Staphylococcus aureus Pseudomonas
Pseudomonas aeruginosa aeruginosa
3 Staphylococcus aureus Streptococcus salivarius Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa
4 Micrococcus luteus Pseudomonas
Staphylococcus aureus Streptococcus oralis/mitis Pseudomonas aeruginosa aeruginosa
5 Pseudomonas aeruginosa Achromobacter xylosoxidans Escherichia coli Escherichia coli
6 Pseudomonas aeruginosa Candida albicans Escherichia coli Escherichia coli
7 Stenotrophomonas maltophilia Escherichia coli Staphylococcus aureus
Rothia dentocariosa Enterobacter
Candida albicans cloacae
8 Staphylococcus aureus Candida albicans Staphylococcus aureus
9 Спорообразующие аэробные бактерии семейства Bacillaceae Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa
10 Спорообразующие аэробные бактерии семейства Bacillaceae Staphylococcus aureus Enterobacter cloacae Staphylococcus aureus Enterobacter cloacae
что процесс идентификации бактерий, актуальных для муковисцидоза, еще не завершен. Так, сравнительно недавно в число таких бактерий включена Mycobacterium abscessus [9].
Таким образом, было установлено, что мокрота больных муковисцидозом содержит большее количество разных видов бактерий, чем это было известно в отношении возбудителей этого заболевания. Среди ранее неизвестных бактерий особое значение могут иметь спорообразующие бактерии и устойчивые смешанные микробные ассоциации.
Для быстрого выбора антибиотика при лечении больных муковисцидозом с успехом может использоваться ТСВА. Эта тест-система позволяет сократить время выбора антибиотика, основанного на данных лабораторного анализа, с 48-72 до 5-20 ч.
Список литературы
1. Tetz G., Tetz V., Vecherkovskaya M. Genomic characterization and assessment of the virulence and antibiotic resistance of the novel species Paenibacillus sp. strain VT-400, a potentially pathogenic bacterium in the oral cavity of patients with hematological malignancies. Gut Pathog 2016; 8: 6.
Микробиология
2. Тец Г.В., Тец В.В., Ворошилова Т.М., Смирнова Е.И., Кар-дава К.М., Карамян Т.А., Заславская Н.В., Викина Д.С., Зайцева М.А., Артеменко К.Л., Кауфман А.С. Выбор антибиотика в микробиологическом исследовании инфекций мочевыделительной системы. Клиническая лабораторная 6. диагностика 2016; 2: 114-116.
3. Тец Г.В., Смирнова Е.И., Кардава К.М., Викина Д.С., Заславская Н.В., Тец В.В. Выбор антибиотиков при смешанных инфекциях у пациентов с хронической обструктивной 7. болезнью легких. Практическая пульмонология 2015; 4: 39-41.
4. Воронина О.Л., Кунда М.С., Аксенова Е.И., Орлова А.А., Чернуха М.Ю., Лунин В.Г., Амелина Е.Л., Чучалин А.Г., 8. Гинцбург А.Л. Экспресс-диагностика микроорганизмов, поражающих дыхательные пути больных муковисцидозом. Клиническая лабораторная диагностика 2013; 11: 53-57.
5. Воронина О.Л., Чернуха М.Ю., Шагинян И.А., Кунда М.С., 9. Аветисян Л.Р., Орлова А.А., Лунин В.Г., Авакян Л.В., Капранов Н.И., Амелина Е.Л., Чучалин А.Г., Гинцбург А.Л.
Характеристика генотипов штаммов Burkholderia cepacia complex, выделенных от больных в стационарах Российской Федерации. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2013; 2: 22-29.
Burns J.L., Emerson J., Stapp J.R., Yim D.L., Krzewinski J., Louden L., Ramsey B.W., Clausen C.R. Microbiology of sputum from patients at cystic fibrosis centers in the United States. Clin Infect Dis 1998; 27(1): 158-163. Bergey's manual of systematic bacteriology. Whitman W., Goodfellow M., Kämpfer P., Busse H.-J., Trujillo M., Ludwig W., Suzuki K.-i., Parte A., editors. 2nd ed. V. 5. N.Y.: Springer-Verlag; 2012. 2083p.
Stanojevic S., Ratjen F., Stephens D., Lu A., Yau Y., Tullis E., Waters V. Factors influencing the acquisition of Stenotropho-monas maltophilia infection in cystic fibrosis patients. J Cystic Fibrosis 2013; 12: 575-583.
Nessar R., Cambau E., Reyrat J.M., Murray A., Gicquel B. Mycobacterium abscessus: a new antibiotic nightmare. J An-timicrob Chemother 2012; 67(4): 810-818.
Rapid Choice of Antibiotic for Patients with Cystic Fibrosis
V.V. Tets, G.V. Tets, K.M. Kardava, E.I. Smirnova, and T.E. Gembitskaya
The article deals with evaluation of test system Antibiotic Choice for express diagnosis of infections in patients with cystic fibrosis. The results of comparative evaluation of new and conventional methods are provided. The study showed that antibiotics could be administered 6-20 hours after analysis of data using Antibiotic Choice. The authors investigated bacteria and microbial associations that have not been previously described in patients with cystic fib-rosis.
Key words: cystic fibrosis, microbiological diagnostics, Antibiotic Choice, previously unknown bacteria.
Журналы издательства "Атмосфера'
АТМОСФЕРА
НОВОСТИ КАРЛИОЛОПШ
Продолжается подписка на научно-практический журнал
"АтпосФЕРй. новости кардиологии"
Журнал выходит 4 раза в год. Стоимость подписки на полгода по каталогу агентства "Роспечать" - 760 руб., на один номер - 380 руб.
Подписной индекс 37211.
Продолжается подписка на научно-практический журнал
"НЕРВНЫЫЕ БоЛЕЗМи"
Журнал выходит 4 раза в год. Стоимость подписки на полгода по каталогу агентства "Роспечать" - 840 руб., на один номер - 420 руб.
Подписной индекс 81610.
J
ч
Подписку можно оформить в любом отделении связи России и СНГ. Редакционную подписку на любой журнал издательства "Атмосфера" можно оформить на сайте http://atm-press.ru или по телефону: (495) 730-63-51
Г
Практическая пульмонология | 2016 | № 2
http://atm-press.ru
60
