CC BY
3
24. Re vie h B., Brodsky E., Solskov Y. // Dioxin'99. Organo-halogen. Compounds. - 1999. - Vol. 44. - P. 383.
25. Shertzer H. G., Nebert D. W., Puga A. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1998. - Vol. 253. - P. 44-48.
26. Stohs S. J. // Free Radie. Biol. Med. - 1990. - Vol. 9. - N 1. - P. 79-90.
27. Stohs S. J., Hassan M. Q., Murray W. J. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1983. - Vol. 111. - P. 854-859.
28. Thomas E. L., Jefferson M. M., Joyner R. E. et al. // J. Dent. Res. - 1994. - N 2. - P. 544-555.
29. Van den Berg M., De Jongh J, Poiger H. et al. I I Crit. Rev. Toxicol. - 1994. - Vol. 24. - P. 1-74.
30. Van den Berg M., Birnbaum L„ Bosveld А. Т. C. et al. // Environm. Hlth Perspect. - 1998. - Vol. 106, N 12. -P. 775-792.
Поступила 10.01.01
С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2002 УДК 613.287:616-002.5-078
М. М. Додонов, Э. А. Федотов, И. X. Ягудина, Л. Ф. Зыкин, Ю. А. Попов
ЭКСПЕРТИЗА МОЛОКА НА СОДЕРЖАНИЕ ТУБЕРКУЛЕЗНЫХ МИКОБАКТЕРИЙ С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
Саратовский государственный аграрный университет им. Н. И. Вавилова; Государственное медицинское учреждение "Центр-СПИД", Саратов: Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб", Саратов
В настоящее время повсеместно наблюдается рост заболеваемости туберкулезом. Заболеваемость людей увеличилась с 1993 по 1996 г. на 13%. Ежегодно в мире регистрируется 7—8 млн свежих случаев туберкулеза, погибают 2—3 млн человек, из них 100 тыс. детей [13]. Туберкулезом заболевают ежегодно более 6 млн сельскохозяйственных животных |6|.
По данным Департамента ветеринарии Саратовской обл. МСХ и П на 1998 г., туберкулез распространен в 15 районах области и охватывает 130 неблагополучных пунктов, особенно в Аткарском, Базарно-Карабулак-ском, Екатерининском, Калининском, Петровском, Ртищевском и Энгельсском районах.
При туберкулезе крупного рогатого скота хозяйства несут экономические потери от снижения продуктивности или преждевременного убоя животных, утилизации туш, а также затрат на оздоровление ферм (пастеризация молока, дезинфекция, санитарный ремонт помещений, туберкулинизации).
Очень важную роль играет оздоровление хозяйств от туберкулеза в эпидемиологическом отношении, поскольку больные животные нередко являются источником возбудителя инфекции у людей [7). Примерно 25% случаев туберкулеза у людей вызывают М. bovis [2, 4| и связаны они с заражением через продукты питания или с контактом с инфицированными животными, поэтому экспертиза продуктов на присутствие микобактерий туберкулеза важна в практическом плане.
Современная лабораторная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота основана на бактериоскопии патологического материала, его бактериологическом исследовании и постановке биопроб.
При бактериоскопии (окраска мазков по методу Ци-ля—Нильсена) положительный результат удается получить при наличии в 1 г (мл) исследуемого материала более 100 тыс. микобактерий, т. е. этот метод малочувствителен. Бактериологические посевы на питательные среды позволяют получить положительный результат при наличии нескольких десятков микобактерий в 1 г (мл) исследуемого материала [5]. Этот метод выявляет мико-бактерии лишь у 50% больных животных, т. е. также недостаточно чувствителен. К тому же он занимает в среднем до 1,5—2 мес, что значительно его обесценивает, особенно в эпизоотологическом плане. Постановка биопроб является дорогостоящим методом и также занимает около месяца.
Появившиеся в 80-х годах методы генодиагностики (ДНК-зонды и полимеразная цепная реакция — ПЦР) значительно повысили качество лабораторной диагностики туберкулеза и имеют явное преимущество перед традиционными методами лабораторной диагностики. ПЦР обладает высокой разрешающей способностью, выявляет единичные клетки микроорганизмов, ее проведение занимает не более 5—6 ч. Кроме того, ПЦР основана
на другом принципе — выявляется геном клетки, а не ее антигены.
ПЦР широко используется в нашей стране для диагностики туберкулеза у людей |1, 4, 8, 9, 12]. Но в ветеринарии этот метод только начинает применяться |10, 11 ] для обнаружения туберкулезных микобактерий в кормах и продуктах животноводства.
Цель нашей работы — исследование молока крупного рогатого скота на наличие микобактерий туберкулеза. Молоко отбирали из неблагополучного по туберкулезу хозяйства — АО "Энгельсское" от положительно реагирующих на туберкулин коров. У крупного рогатого скота не наблюдалось выраженных клинических признаков заболевания или отставания в росте и снижения продуктивности.
Всего было исследовано 64 пробы молока с помощью бактериоскопии, посевов на среды Левенштейна— Йен-сена и Школьниковой с последующей прямой люминесцентной микроскопией после окраски аурамином-рода-мином по методике Прайса (3) и ПЦР (использовали тест-системы "Политуб" производства НПФ "Литех", Москва и "Амплитест" производства ЦНИИ эпидемиологии, Москва).
Перед микроскопией и посевом на питательные среды молоко центрифугировали 20 мин при 3000 об/мин, осадок обрабатывали 4% серной кислотой и промывали физиологическим раствором. Перед постановкой ПЦР образцы молока обрабатывали согласно инструкции по применению набора реагентов для обнаружения ДНК микобактерий туберкулезного комплекса М. tuberculosis и М. bovis методом ПЦР.
Каждый цикл ПЦР состоит из 3 стадий с различными температурными режимами. Для обнаружения микобактерий туберкулеза с помощью тест-системы "Политуб" эти циклы амплификации проводили следующим образом: 5 циклов при условии: — 93°С — 30 с, 93"С — 10 с, 64°С - 10 с, ITC - 20 с и 40 циклов при условии: 93°С -10 с, 62°С - 10 с, 72'С - 20 с, ITC - I мин.
Для тест-системы "Амплитест" эти режимы несколько другие: 10 циклов при условии: 95*С — 2 мин, 95°С — 1 мин, 60"С — 1 мин, 72°С — 1 мин и 35 циклов при условии: 95'С - 30 с, 60'С - 30 с, 72'С - 30 с.
В тест-системе "Политуб" для диагностики микобактерий туберкулеза подобрана система праймеров, комплементарных участку гена МРВ 64, позволяющая ам-плифицировать фрагмент, специфичный только для микобактерий туберкулезного комплекса, и не выявляющая атипичные виды микобактерий.
При бактериоскопии и посевах на среду Левенштейна—Иенсена положительных результатов зафиксировано не было. При люминесцентной микроскопии в одной пробе были обнаружены палочки золотисто-оранжевого цвета, что характерно для туберкулезных микобактерий.
Результаты ПЦР учитывали при разделении продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза; при наличии полосы, соответствующей по электро-форетической подвижности положительному контролю, давали ответ о наличии данного возбудителя в клинической пробе.
С помощью тест-системы "Политуб" было исследовано 10 проб молока; результат отрицательный. При исследовании молока с помощью тест-системы "Амплитест" было получено 12 положительных результатов. При этом в одном случае он совпал с положительным результатом при люминесцентной микроскопии, т. е. положительный результат подтвержден двумя методами.
Выводы. 1. Сравнение стандартных методов бактериологических исследований при выявлении туберкулезных микобактерий в молоке и метода ПЦР показало большую чувствительность последней.
2. Целесообразно рекомендовать ПЦР в практику санитарных лабораторий для экспертизы молока на наличие туберкулезных микобактерий.
Литература
1. Голышевская В. И. и др. // ПЦР в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний. — М„ 1998.
2. Канраманов А. И. // Пробл. туб. — 1968. — № 2.
3. Карташова В. М. Индикация патогенных бактерий в молоке и молочных продуктах. — М., 1973.
4. Копылова И. Ф. и др. // Клин. лаб. диагн. — 1999. — № 11. - С. 5-6.
5. Кузин А. И. Туберкулез сельскохозяйственных животных и его профилактика. — М., 1992.
6. Овдиенко Н. И. // Ветеринария. — 1989. — № 8. — С. 62-65.
7. Пионтковский В. И. // Совершенствование систем и методов в борьбе с бруцеллезом и туберкулезом животных. — Новосибирск, 1987.
8. Стауфер Ф. и др. // ПЦР в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний. — М., 1998.
9. Суслов Л. С. и др. // Клин. лаб. диагн. — 1999. — № 11. - С. 25.
10. Шаров А. Н. и др. // ПЦР в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний. — M., 1998.
11. Шаров А. Н. и др. // Ветеринария. — 2000. — № 2. -С. 16-18.
12. Шишков Д. М. и др. // П ЦР в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний. — М., 1998.
13. Piesen Y. // Concours Méd. - 1998. - Vol. 120, N 23. - P. 1634.
Поступила 12.04.01
С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2002 УДК «14.7:615.917:547.3811.074:543:544
Н. В. Зайцева, Т. С. Уланова, Т. Д. Карнажицкая, А. М. Сыпачева
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЛЬДЕГИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Научно-исследовательский клинический институт детской экопатологии, Пермь
Содержание химических веществ в биологических средах является одним из важных диагностических показателей при оценке состояния здоровья населения, проживающего в условиях антропогенной нагрузки [2, 8].
Для получения достоверной информации о содержании химических соединений в организме необходимы высокочувствительные и селективные методы определения, позволяющие определять микроколичества веществ на фоне сложной многокомпонентной матрицы при проведении массовых анализов.
Среди органических соединений, поступающих в окружающую среду с выбросами химических, нефтехимических предприятий, тепловых электростанций, автотранспорта и представляющих опасность для здоровья человека, выделяется группа алифатических альдегидов (7].
Большинство существующих в настоящее время методик определения альдегидов в биологических средах касаются определения метаболита этилового спирта — уксусного альдегида при проведении токсикологических исследований [11, 12]. В литературе приводятся методики селективного определения альдегидов, требующие длительной пробоподготовки и очистки образца от матрицы или сложной аппаратуры [1, 9].
Разработана методика определения формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в моче и крови при их совместном присутствии методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Для определения микроколичеств альдегидов в биологических образцах на фоне большого числа примесей использовали селективное концентрирование, позволяющее выделить из биологической среды соединения одного класса.
В аналитической практике для открытия и изолирования альдегидов из сложной смеси широко используется фенилгидразин — селективный реагент на карбонильную группу, при контакте которого с альдегидами в кислой среде образуются соответствующие фенилгидразо-ны альдегидов [5]. Была исследована возможность ис-
пользования 2,4-динитрофенилгидразина (ДНФГидра-зина) солянокислого для определения формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в моче и крови. Экспериментально определены оптимальные условия проведения реакции образования гидразо-нов альдегидов в исследуемом биосубстрате.
В литературе приводятся различные рекомендации по условиям образования 2,4-динитрофенилгидразонов (ДНФГидразона) альдегидов [3]. Вместе с тем проведенные рядом авторов исследования показывают, что максимальная скорость реакции образования 2,4-ДНФГид-
Таблииа 1
Эффективность экстракции 2,4-ДНФГидраэонов альдегидов из биологических сред различными растворителями
Степень экстракиии, %
Экстра гс нт 2,4-ДНФГнл-разин 2,4-ДНФГид-разон формальдегида 2,4-ДНФГид-разон ацетальдегида 2.4-ДНФГил-разон пропионового альдегида 2.4-ДНФГид-разон масляного альдегида
Бензол 76,0 98,3 89,3 91,45 95,0
Толуол 87,0 96,5 95,3 92,5 97,3
О-ксилол 77,7 95,0 98,7 78,2 84,3
Гексан 1,0 63,8 88,5 75,6 68,3
Этилаце-
тат 10,9 55,0 25,4 54,2 47,6
Хлоро-
форм 97,0 97,2 89,5 95,0 90,1
Метилен
хлори-
стый 96,0 88,5 85,0 84,9 92,0
Углерод
четырех-
хлори-
стый 14,1 88,0 76.2 84,3 68,3
