CC BY
7
Результаты ПЦР учитывали при разделении продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза; при наличии полосы, соответствующей по электро-форетической подвижности положительному контролю, давали ответ о наличии данного возбудителя в клинической пробе.
С помощью тест-системы "Политуб" было исследовано 10 проб молока; результат отрицательный. При исследовании молока с помощью тест-системы "Амплитест" было получено 12 положительных результатов. При этом в одном случае он совпал с положительным результатом при люминесцентной микроскопии, т. е. положительный результат подтвержден двумя методами.
Выводы. 1. Сравнение стандартных методов бактериологических исследований при выявлении туберкулезных микобактерий в молоке и метода ПЦР показало большую чувствительность последней.
2. Целесообразно рекомендовать ПЦР в практику санитарных лабораторий для экспертизы молока на наличие туберкулезных микобактерий.
Литература
1. Голышевская В. И. и др. // ПЦР в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний. — М„ 1998.
2. Канраманов А. И. // Пробл. туб. — 1968. — № 2.
3. Карташова В. М. Индикация патогенных бактерий в молоке и молочных продуктах. — М., 1973.
4. Копылова И. Ф. и др. // Клин. лаб. диагн. — 1999. — № 11. - С. 5-6.
5. Кузин А. И. Туберкулез сельскохозяйственных животных и его профилактика. — М., 1992.
6. Овдиенко Н. И. // Ветеринария. — 1989. — № 8. — С. 62-65.
7. Пионтковский В. И. // Совершенствование систем и методов в борьбе с бруцеллезом и туберкулезом животных. — Новосибирск, 1987.
8. Стауфер Ф. и др. // ПЦР в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний. — М., 1998.
9. Суслов Л. С. и др. // Клин. лаб. диагн. — 1999. — № 11. - С. 25.
10. Шаров А. Н. и др. // ПЦР в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний. — M., 1998.
11. Шаров А. Н. и др. // Ветеринария. — 2000. — № 2. -С. 16-18.
12. Шишков Д. М. и др. // П ЦР в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний. — М., 1998.
13. Piesen Y. // Concours Méd. - 1998. - Vol. 120, N 23. - P. 1634.
Поступила 12.04.01
С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2002 УДК «14.7:615.917:547.3811.074:543:544
Н. В. Зайцева, Т. С. Уланова, Т. Д. Карнажицкая, А. М. Сыпачева
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЛЬДЕГИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Научно-исследовательский клинический институт детской экопатологии, Пермь
Содержание химических веществ в биологических средах является одним из важных диагностических показателей при оценке состояния здоровья населения, проживающего в условиях антропогенной нагрузки [2, 8].
Для получения достоверной информации о содержании химических соединений в организме необходимы высокочувствительные и селективные методы определения, позволяющие определять микроколичества веществ на фоне сложной многокомпонентной матрицы при проведении массовых анализов.
Среди органических соединений, поступающих в окружающую среду с выбросами химических, нефтехимических предприятий, тепловых электростанций, автотранспорта и представляющих опасность для здоровья человека, выделяется группа алифатических альдегидов (7].
Большинство существующих в настоящее время методик определения альдегидов в биологических средах касаются определения метаболита этилового спирта — уксусного альдегида при проведении токсикологических исследований [11, 12]. В литературе приводятся методики селективного определения альдегидов, требующие длительной пробоподготовки и очистки образца от матрицы или сложной аппаратуры [1, 9].
Разработана методика определения формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в моче и крови при их совместном присутствии методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Для определения микроколичеств альдегидов в биологических образцах на фоне большого числа примесей использовали селективное концентрирование, позволяющее выделить из биологической среды соединения одного класса.
В аналитической практике для открытия и изолирования альдегидов из сложной смеси широко используется фенилгидразин — селективный реагент на карбонильную группу, при контакте которого с альдегидами в кислой среде образуются соответствующие фенилгидразо-ны альдегидов [5]. Была исследована возможность ис-
пользования 2,4-динитрофенилгидразина (ДНФГидра-зина) солянокислого для определения формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в моче и крови. Экспериментально определены оптимальные условия проведения реакции образования гидразо-нов альдегидов в исследуемом биосубстрате.
В литературе приводятся различные рекомендации по условиям образования 2,4-динитрофенилгидразонов (ДНФГидразона) альдегидов [3]. Вместе с тем проведенные рядом авторов исследования показывают, что максимальная скорость реакции образования 2,4-ДНФГид-
Таблииа 1
Эффективность экстракции 2,4-ДНФГидраэонов альдегидов из биологических сред различными растворителями
Степень экстракиии, %
Экстра гс нт 2,4-ДНФГнл-разин 2,4-ДНФГид-разон формальдегида 2,4-ДНФГид-разон ацетальдегида 2.4-ДНФГил-разон пропионового альдегида 2.4-ДНФГид-разон масляного альдегида
Бензол 76,0 98,3 89,3 91,45 95,0
Толуол 87,0 96,5 95,3 92,5 97,3
О-ксилол 77,7 95,0 98,7 78,2 84,3
Гексан 1,0 63,8 88,5 75,6 68,3
Этилаце-
тат 10,9 55,0 25,4 54,2 47,6
Хлоро-
форм 97,0 97,2 89,5 95,0 90,1
Метилен
хлори-
стый 96,0 88,5 85,0 84,9 92,0
Углерод
четырех-
хлори-
стый 14,1 88,0 76.2 84,3 68,3
т-■-г
а,о ю,о
Рис. 1. Хроматограмма 2,4-ДНФГидразонов альдегидов, полученная при анализе стандартной смеси формальдегида, аиетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в моче.
Здесь и на рис. 2: по оси абсцисс — время выхода (в мин); по оси ординат — оптическая плотность (в усл. ед.). / — 2,4-ДНФГидразонов формальдегида, 2— 2,4-ДНФГилразонов аиетальдегида, 3— 2,4-ДНФГилразонов ацетона, 4 — 2,4-ДНФГидразонов пропионового альдегида, 5 — 2,4-ДНФГидраюнов метилэтнлкетона. 6 — 2,4-ДНФГидразонов масляного альдегида.
разонов наблюдается при одновременном прибавлении в анализируемую пробу раствора 2,4-ДНФГидразина и экстрагента, в который переходят образующиеся 2,4-ДНФГидразоны альдегидов [4, 10]. При выборе экстрагента была изучена степень экстракции 2,4-ДНФГидразонов альдегидов различными органическими растворителями: бензолом, толуолом, ксилолом, гексаном, хлороформом, хлористым метиленом, четыреххлори-стым углеродом (табл. I).
Максимальная степень экстракции 2,4-ДНФГидразо-нов исследуемых альдегидов была достигнута при использовании в качестве экстрагента ароматических углеводородов. Однако в этом случае наряду с 2,4-ДНФГид-разонами альдегидов наблюдалась экстракция реагента 2,4-ДНФГидразина, что нежелательно при проведении реакции дериватизации (см. табл. 1). В этом отношении более подходящими растворителями оказались четырех-хлористый углерод и гексан. Эффективность экстракции 2,4-ДНФГидразина гексаном составляет менее 1%, четы-реххлористым углеродом — 14,1%. Исходя из оценки эффективности экстракции и токсичности используемых растворителей, гексан относится к 4-му, четыреххлори-стый углерод — ко 2-му классу опасности, в качестве экстрагента рекомендован гексан.
Экспериментальным путем было определено время образования 2,4-ДНФГидразонов альдегидов в моче и крови при экстракции гексаном. Степень превращения формальдегида, аиетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в соответствующие гидразоны оценивали сравнением полученных данных с результатами анализа стандартных образцов гидразонов анализируемых альдегидов. Оптимальное время одновременного проведения дериватизации и экстракции составило 10 мин.
В процессе пробоподготовки к 50 мл мочи добавляли 2,5 мл 0,2% раствора 2,4-ДНФГидразина в 2М хлористоводородной кислоте, 2 капли концентрированной хлористоводородной кислоты и 5 мл гексана. При определении альдегидов в крови к 2 мл цельной крови добавляли 40 мл дистиллированной воды, 2 мл 0,2% раствора 2,4-ДНФГидразина в 2М хлористоводородной кислоте, 2 капли хлористоводородной кислоты и 5 мл гексана. Экстрагировали в течение 10 мин. После расслоения жидкостей переносили гексан в центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой и центрифугировали 10 мин со скоростью 1500 об/мин для более полного разделения фаз. 2 см' гексана (верхний слой) переносили в бюкс и выпаривали досуха под ИК-лампой. Высушенный остаток растворяли в 0,5 см3 ацетонитрила и анализировали апиквоту в количестве 5 мкл на жидкостном хроматографе "Миллихром-4" с ультрафиолетовым детектором при длине волны 360 нм.
Качественное разделение 2,4-ДНФГидразонов альдегидов проводили на хроматографической колонке размером 80 х 3 мм, заполненной Диасорбом С16. Экспериментально были подобраны условия эффективного разделения смеси 2,4-ДНФГидразонов формальдегида, аце-тальдегида, пропионового и масляного альдегидов. При анализе сложных смесей веществ слабокислого и слабоосновного характера действенным регулятором селективности колонки является одновременное добавление в элюент небольших количеств уксусной кислоты и алифатического амина (диэтиламина, триэтиламина). При этом достигается высокая эффективность разделения и сокращается продолжительность анализа |6]. Оптимальные условия для разделения исследуемой смеси были достигнуты при использовании фазы ацетонитрил: вода в соотношении 50:50 + 2,5% раствор уксусной кислоты, 1% раствор диэтиламина при скорости движения элюен-та 150 мкл/мин.
При указанных условиях время удерживания 2,4-ДНФГидразона формальдегида составило 3 мин 25 с, 2,4-ДНФГидразона аиетальдегида — 4 мин 20 с, 2,4-ДНФГидразона пропионового альдегида — 6 мин 15 с, 2,4-ДНФГидразона масляного альдегида — 9 мин 25 с. Хроматограммы 2,4-ДНФГидразонов альдегидов, полученные в результате анализа стандартных смесей альдегидов в моче и крови, представлены на рис. I и 2.
Количественное определение формальдегида, аиетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в моче проводили методом абсолютной калибровки. Для построения градуировочного графика использовали свежеприготовленные стандартные растворы альдегидов в моче и крови, не содержащих эти альдегиды, с концентрациями в диапазоне 0,01 — 1 мг/л. Подготовку стандартных образцов к анализу проводили аналогично биологическим пробам, переводя альдегиды в 2,4-ДНФГидразоны. Каждую концентрацию хроматографировали не менее 5 раз и находили среднее значение площади пика соответствующего компонента. Строили график зависимости площади пиков 2,4-ДНФГидразонов альдегидов от концентрации соответствующих альдегидов в биологической среде.
В диапазоне заданных концентраций сохранялась линейная зависимость сигнала детектора от количества вещества в пробе.
Чувствительность определения формальдегида, аиетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в моче составила 0,005 мкг/мл, в крови — 0,01 мкг/мл.
Оценку воспроизводимости результатов проводили методом "задано—найдено". Погрешность метода определения формальдегида в моче составила 20,0%, аиетальдегида — 22,65%, пропионового альдегида — 22,43%, масляного альдегида — 21,04%. Погрешность метода оп-
/,г 1,0 О,в 0,6 0,4 о,г
2,0
I
4,0
/Уд А.
6,о
в, о
ю,о
Рис. 2. Хроматограмма 2,4-ДНФГидразонов альдегидов, полученная при анализе стандартной смеси формальдегида, аиетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в крови.
Таблица 2
Срсднсгрупповос содержание альдегидов в биосрсдах детей, проживающих на территории Пермской области
Количест-
Территория во проанализированных проб Формальдегид Ацетальдегнд Пропионовьж альдегид Масляный альдегид
моча кровь моча кровь моча кровь моча кровь моча кровь
п. Кусда 12 14 0,040 ± 0,010 0,040 ± 0,09 0.247 ± 0,034 0.020 ± 0.0046 0,0135 ± 0,0055 0 0,0152 ± 0.0047 0
г. Соли-
камск 39 41 0,031 ± 0.009 0,016 ± 0,004 0,072 ±0.015 0,023 ± 0,01 0 0 0,002 ± 0,001 0
г. Крас-
нокамск 8 8 0,031 ± 0.0078 0,025 ± 0,0023 0,175 ± 0,046 0,125 ± 0,028 0 0 0,032 ± 0,0035 0
с. Уинск 13 17 0,033 ± 0,0056 0,034 ± 0,0045 0,219 ± 0,120 0,164 ± 0,025 0 0 0,0056 ± 0,0025 0,003 ± 0,001
с. Кизел 20 24 0,058 ± 0,010 0,058 ± 0,0136 0,149 ± 0,054 0.068 ± 0,008 0,0055 ± 0,002 0 0,029 ± 0,0034 0
г. Губаха 18 15 0,052 ± 0,021 0,032 ± 0,0035 0,082 ± 0,025 0,047 ± 0,0056 0 0 0,027 ± 0,011 0,002 ±0,001
ределения формальдегида в крови равна 22,03%, ацеталь-дегида — 12,66%, пропионового альдегида — 16,37%, масляного альдегида — 21,9%. Разработанный метод определения альдегидов в моче и крови использован при обследовании детей, проживающих на территориях Пермской области с различной химической нагрузкой.
Установлено, что содержание альдегидов в биологических средах детей, проживающих на территориях Пермской области с различной антропогенной нагрузкой, определялось в диапазоне от 0 до 0,250 мкг/мл (табл. 2).
Выводы. 1. В результате проведенных исследований подобраны условия подготовки биологической пробы (кровь, моча) к анализу методом дериватизации и экстракции: взаимодействие присутствующих в пробе альдегидов с 2,4-ДНФГидразином, экстракция образующихся 2,4-ДНФГидразонов альдегидов 5 мл гексана в течение 10 мин, разделение гексанового экстракта центрифугированием при скорости 1500 об/мин в течение 10 мин, упаривание 2 мл экстракта под ИК-лампой досуха, растворение упаренного остатка в 0,4 мл элюента.
2. В исследованиях по эффективному разделению низших предельных альдегидов на колонке размером 80 х 3 мм, заполненной Диасорбом С|6, подобраны оптимальные условия: элюент ацетонитрил:вода в соотношении 50:50 + 2,5% раствор уксусной кислоты + 1% раствор диэтиламина, скорость движения элюента 150 мкл/мин, длина волны УФ-детектора 360 нм.
4. Разработанный метод определения формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов способом высокоэффективной жидкостной хроматографии позволяет количественно определять изучаемые соединения с чувствительностью определения 0,005 мкг/мл в моче и 0,01 мкг/мл в крови с погрешностью определения не более 22,66% и может быть использован для проведения массовых анализов биологических сред, а также
при оценке элиминационных технологий в отношении
определяемых альдегидов.
Л итература
1. Дмитриев М. Т., Карташова А. В., Карташов В. С. // Гиг. и сан. - 1990. - № 9. - С. 83-84.
2. Зайцева Н. В., Аверьянова Н. И., Корюкина И. П. Экология и здоровье детей Пермского региона. — Пермь, 1997.
3. Король А. Н. // Журн. аналит. химии. — 1981. — Т. 36, вып. 4. - С. 763-775.
4. Перцовский А. Л., Кремко Л. М. // Там же. — 1985. — Т. 40, вып. 6. - С. 1115-1117.
5. Степаненко Б. Н. Курс органической химии. — М., 1966. - С. 137
6. Сычев С. Н. Методы совершенствования хромато-графических систем и механизмы удерживания в ВЭЖХ. - Орел, 2000. - С. 211.
7. Филов В. А., Тиунов Л. А. Вредные химические вещества. Галоген- и кислородсодержащие органические соединения. — СПб., 194.
8. Юдина Т. В. // Методологические и методические проблемы оценки состояния здоровья населения: Материалы Всесоюзной науч. конф.: Сб. науч. тр. — СПб., 1992. - С. 42-46.
9. Ray тег J., Holland М. L., Wiesler D. P., Notovny М. // J. Anal. Chem. - 1984. - N 6. - P. 962-966.
10. Kaminsky J., Afwal A. S., Mahadevan S. // J. Liquid Chromatogr. - 1993. - Vol. 16. - P. 521-526.
11. Lukas D. et al. // J. Chromatogr. - 1986. - Vol. 382. - P. 55-66.
12. Pezzoli С., Galli-Kienle M., Di Padova C. // J. Liquid Chromatogr. - 1984. - Vol. 7, N 4. - P. 765-778.
Поступила 11.04.01
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 2902 УДК 613.632:622.3«7.6|-074
С. В. Кашанский, Т. В. Слышкина, Г. Б. Богданов, |С. В. Щербаков
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭЛИМИНАЦИИ АСБЕСТА ЧЕРЕЗ ПОЧКИ
Екатеринбургский медицинский научный центр профилактики и охраны здоровья рабочих промпредприятий; ОАО "НИИпроектасбест", г. Асбест
Пути поступления, перемещения, выведения и отложения асбеста в органах дыхания и пищеварительном тракте изучены в многочисленных модельных экспериментах на животных и в натурных исследованиях на людях [7, 9]. Вместе с тем данные об элиминации асбеста с мочой малочисленны и противоречивы [8, 10], что побудило нас провести изучение указанного вопроса. В статье представлены предварительные результаты скрининго-вых исследований по определению волокон асбеста в моче.
Для исследований были выбраны рабочие основных массовых профессий, занятых на добыче (машинисты бурового оборудования и экскаватора) и обогащении хризотил-асбеста (дробильщик дробильносортировочно-го комплекса, машинист и регулировщик асбестообога-тительного оборудования цеха обогащения, а также машинист расфасовочно-упаковочных машин цеха готовой продукции). Пробы мочи для анализа были взяты у 6 рабочих без признаков профессиональной асбестобуслов-ленной патологии, на момент исследований проработав-
