CC BY
224. Глушанова Н.А., Вербицкая Н.Б., Петров Л.Н. и др. Исследование ауто-, изо- и гомоантаго-низма пробиотических штаммов лактобацилл. Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. 2005, 6 (44): 138142.
5. Государственная фармакопея СССР. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. М., Медицина, 1989.
6. Грачева Н.М., Бондаренко В.М. Пробиотические препараты в терапии и профилактике дис-бактериоза кишечника. Инфекционные болезни. 2004, 2 (2): 53-58.
7. Куяров А.В., Воропаева Е.А., Алешкин В.А. и др. Способ определения гистидидекарбокси-лазной активности бактерий (варианты). Патент RU 2299440 C1, МПК G01N 33/68, опубликован 20.05.2007.
8. Онищенко Г.Г., Алешкин В.А., Афанасьев С.С., Поспелова В.В. Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфектологии. М., ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2002.
9. Поспелова В.В., Лахтин В.М., Криворучко Е.В. и др. Изучение вариантов пробиотика Ацилакт на живых моделях. Вестник РУДН. 2009, 1: 5-10.
10. Тутельян В.А., Шевелева С.А., Хотимченко С.А. и др. Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов. МУ 2.3.2. 2789-10. М., Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010.
11. Шендеров Б.А. Молекулярный язык пробиотических микроорганизмов. Пищевые ингредиенты. 2009, 1: 48-49.
12. Azcarate-Peril M.A., Altermann E., Hoover-Fitzula R.L. et al. Identification and inactivation of genetic loci involved with Lactobacillus acidophilus acid tolerance. Appl. Environment. МюгоЬю1. 2004, 70 (9): 5315-5322.
13. Garai G., Duenas M.T., Irastorza A., Moreno-Arribas M.V Biogenic amine production by lactic acid bacteria isolated from cider. Lett. Аppl. МюгоЬю1. 2007, 45 (5): 473-478.
Поступила 12.02.13
Контактная информация: Алешкин Андрей Владимирович, д.б.н,
125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10, р.т. (495)452-18-16
© Е.А.СЕЛИВАНОВА, Н.В.НЕМЦЕВА Е.А.Селиванова1,2, Н.В.Немцева12
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГАЛОФИЛЬНЫХ ПРОКАРИОТ И УСЛОВНО ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ В РАПЕ
1Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург; 2Оренбургская государственная медицинская академия
Цель. Изучить влияние экстремально галофильных архей и умеренно галофильных бактерий на сохранение условно патогенных бактерий в рапе. Материалы и методы. Из континентального гипергалинного озера Развал Соль-Илецкого района Оренбургской области были выделены 17 штаммов умеренно галофильных бактерий и 2 штамма экстремально галофильных архей. Идентификацию чистых культур прокариот проводили с учетом их фенотипических свойств и на основании определения последовательности гена 16S рРНК. Влияние галофильных прокариот на элиминацию Escherichia coli из рапы оценивали при сокультивировании. Антагонистическую активность экстрактов клеток исследуемых микроорганизмов оценивали фотометрическим методом. Результаты. Установлено более длительное сохранение штамма E. coli в рапе в присутствии живых клеток экстремально галофильных архей Halorubrum tebenquichense и умеренно галофильных бактерий Marinococcus halophilus. Экстракты клеток экстремально галофильных архей и умеренно галофильных бактерий, напротив, проявляли антагонистическую активность. Заключение. Протективное действие живых клеток галофильных прокариот и антагонистическая активность их клеточных экстрактов изменяют сроки сохранения условно патогенных бактерий в рапе, регулируя межмикробные взаимоотношения и изменяя сроки самоочищения, что отражается на санитарном состоянии гипергалинного водоема.
Журн. микробиол., 2013, № 5, С. 86—91
Ключевые слова: экстремально галофильные археи, умеренно галофильные бактерии, гипергалинные водоемы, самоочищение, протективное действие, антагонизм
E.A.Selivanova1,2, N.V.Nemtseva1,2
EXPERIMENTAL INTERACTION OF HALOPHILIC PROKARYOTES AND OPPORTUNISTIC BACTERIA IN BRINE
1Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg; 2Orenburg State Medical Academy, Russia
Aim. Study the effect of extremely halophilic archaea and moderately halophilic bacteria on preservation of opportunistic bacteria in brine. Materials and methods. 17 strains of moderately halophilic bacteria and 2 strains of extremely halophilic archaea were isolated from continental hypersaline lake Razval of Sol-Iletsk area of Orenburg Region. Identification of pure cultures of prokaryotes was carried out taking into account their phenotype properties and based on determination of16S RNA gene sequence. The effect ofhalophilic prokaryote on elimination of Escherichia coli from brine was evaluated during co-cultivation. Antagonistic activity of cell extracts of the studied microorganisms was evaluated by photometric method. Results. A more prolonged preservation of an E. coli strain in brine in the presence of live cells of extremely halophilic archaea Halorubrum tebenquichense and moderately halophilic bacteria Marinococcus halophilus was established. Extracts of cells of extremely halophilic archaea and moderately halophilic bacteria on the contrary displayed antagonistic activity. Conclusion. The protective effect of live cells of halophilic prokaryotes and antagonistic activity of their cell extracts change the period of conservation of opportunistic bacteria in brine that regulates inter-microbial interactions and changes the period of self-purification that reflects the sanitary condition of a hypersaline water body.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 5, P. 86-91
Key words: extremely halophilic archaea, moderately halophilic bacteria, hypersaline aquatic bodies, self-purification, protective effect, antagonism
ВВЕДЕНИЕ
Водоемы с минерализацией, превышающей 250 — 300 г/л и достигающей уровня насыщения, выделяются в особую группу среди гипергалинных водоемов, многие из которых используются в качестве курортной базы. Высокое осмотическое давление рапы является ведущим фактором, определяющим состав микробиоценоза и способность этих водоемов к самоочищению, что имеет значение для поддержания их санитарного состояния. Однако возможное влияние галофильного микробиоценоза на скорость самоочищения гипергалинных водоемов при этом не учитывается. Для них характерен ограниченный спектр устойчивых микроорганизмов, объединенных в короткие трофические цепи. Эукариоты, в основном, представлены зелеными одноклеточными водорослями рода Dunaliella, тогда как среди прокариот доминируют экстремально галофильные археи [13]. Доминирующие группы адаптированных к экстремальной солености микроорганизмов могут достигать высокой численности, вызывая бурое, красное или розовое «цветение» рапы. При этом численность прокариот в ряде случаев превышает 108 клеток в мл [14], а зеленых одноклеточных водорослей — 104 клеток в мл [6]. Высокая плотность галофильных микроорганизмов создает условия для их возможного влияния на скорость элиминации привнесенных аллохтонных бактерий. Поскольку гипергалинные водоемы часто используются в качестве курортной базы, необходимо исследовать возможность этого влияния на их санитарное состояние. Ранее была показана способность автотрофных и гетеротрофных эукариот изменять сроки сохранения условно патогенных бактерий в рапе [6, 9]. Однако о влиянии галофильных прокариот мало известно.
Исходя из этого, цель работы — изучить влияние экстремально галофильных архей и умеренно галофильных бактерий на сохранение условно патогенных бактерий в рапе.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для экспериментальных исследований использованы чистые культуры прокариот, выделенные из континентального гипергалинного озера Развал Соль-Илецкого района Оренбургской области. Минерализация рапы в озере колеблется в диапазоне от 157,4 г/л во время весеннего паводка до 350,0 г/л в летнее время, по составу солей относится к хлоридно-натриевому типу. Планктонные пробы объемом 2 л отбирали батометром Руттнера с глубины не более 50 см. Обработку проб проводили в день сбора, чтобы учесть численность и видовой состав до наступления необратимых изменений, вызванных хранением. Чистые культуры прокариот получали бактериологическим методом с использованием соответствующих питательных сред для выделения умеренно галофильных бактерий и экстремально галофильных архей. При этом по 0,1 мл концентрированной, а также разведенных в 10, 100 и 1000 раз проб рассева-ли с помощью шпателя на твердые питательные среды. В качестве питательных сред использовали жидкую среду для экстремально галофильных бактерий, разведенную жидкую и агаризированную среду: NaCl — 250 г/л, KCl — 2,0 г/л, MgSO4 х 7 H2O — 20,0 г/л, цитрат Na — 3,0 г/л, пептон — 5,0 г/л, дрожжевой автолизат — 3,0 г/л, глюкоза — 2,0 г/л, агар-агар — 20 г/л. Культивирование экстремальных галофилов проводили в условиях непрерывного освещения в течение 1 месяца. В дальнейшем чистые культуры отсевали на скошенный агар соответствующего состава для последующей идентификации.
Идентификацию прокариот проводили с учетом их фенотипических свойств и на основании определения последовательности гена 16S рРНК. С использованием прай-меров для бактерий 16SF190 — ATTAGCTAGTAGGTGGGGTAA и 16SR1100: TTACTAGCGATTCCGACTTCA (НПО «СИНТОЛ», Москва), для архей — A109f: ACKGCTCAGTAACACGT и A934b: GTGCTCCCCCGCCAATTCCT [11] проведена ПЦР амплификация соответствующих участков геномной ДНК всех исследованных изолятов. Режим ПЦР: 5 минут — 95°C, затем 35 циклов 95°C — 20 секунд, 55°C — 20 секунд, 72°C — 60 секунд. После очистки ампликоны секвенировали с помощью набора «BigDye v3.1» (Applied Biosystem) на автоматическом секвенаторе ABI 3130xl по стандартным методикам. Для всех исследованных образцов получены последовательности нуклеотидов как смысловой, так и антисмысловой цепи ДНК. Поиск гомологичных последовательностей осуществляли в базе данных NCBI GenBank при помощи программы BLAST. Филогенетические деревья построены с помощью программы ClustalW2.
Антагонистическую активность экстрактов и супернатантов исследуемых микроорганизмов оценивали фотометрическим методом [3]. Клеточные экстракты гало-фильных микроорганизмов получали путем центрифугирования жидкой культуры, ресуспендирования клеток в дистиллированной воде с последующим замораживанием. Полученные экстракты в объеме 0,4 мл вносили в смесь 2,5 мл мясо-пептонного бульона с 0,1 мл (109/мл) взвеси условно патогенных бактерий. В качестве контрольных проб к 0,1 мл взвеси тест-штаммов добавляли 0,4 мл среды, используемой для приготовления экстрактов. Опытные и контрольные пробы культивировали в течение 24 часов при температуре 37°C, а затем определяли оптическую плотность образцов на фотометре ИФА-ОЭП при длине волны 492 нм. По подавлению роста в опытных пробах, по сравнению с контрольными, судили о наличии антагонистической активности. Антилизоцимную и антигистоновую активность микроорганизмов оценивали фотометрическим методом [1, 2].
Экспериментальное сокультивирование осуществляли при температуре 25°С в безбактериальной воде с уровнем минерализации 300 г/л, полученной путем мембранной фильтрации и автоклавирования рапы соленого озера Развал. Исходная концентрация условно патогенных бактерий составила 107 КОЕ/мл, а галофилов — 1010 КОЕ/мл. В качестве контроля использовали тест-штамм в безбактериальной рапе, не содержащей галофильные микроорганизмы. Учет вели по количеству выросших колоний E. coli на среде Эндо. В первые сутки высевы делали через каждые 4 ч, а в последующем с периодичностью в 12 ч. Биохимические свойства определяли
с помощью коммерческой тест-системы «ENTEROtest» (1 и 2) фирмы «LACHEMA» (Чехия).
Данные, полученные в результате проведенных исследований, были подвергнуты статистической обработке с помощью программы MS Excel 2007. Для определения достоверности различий между анализируемыми выборками определяли среднюю арифметическую ряда, среднее квадратичное отклонение, среднюю ошибку средней арифметической.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Прокариоты в гипергалинном озере Развал были представлены, в основном, экстремально галофильными археями и умеренно галофильными бактериями. Поэтому была предпринята попытка выделить их в чистой культуре и определить их родовую и видовую принадлежность. Среди экстремально галофильных культивируемых ар-хей наиболее распространенными были представители родов Halorubrum и Haloferax.
Halorubrum tebenquichense штамм КР5 (ИКВС). Фенотипические свойства штамма КР5: клетки полиморфные неправильно-дисковидной формы (0,5 — 1,0 х 1,0 — 2,0 мкм) и палочковидные (0,5 — 1,0 х 2,0 — 5,0 мкм), располагающиеся одиночно, гра-мотрицательные, каталазоположительные, оксидазоотрицательные. При росте на агаризованной среде при непрерывном освещении образуют мелкие с ровным краем выпуклые блестящие ярко-красные колонии. Диапазон галотолерантности — 150 — 300 г/л. Устойчив к антибиотикам: пенициллину, тетрациклину, цефотаксиму, линко-мицину, левомицетину, полимиксину. По данным анализа нуклеотидной последовательности гена 16S РНК наиболее близок (99 % сходства) к H.tebenquichense штамм ALT-6 (номер последовательности в NCBI — NR_028232.1).
Среди выделенных умеренно галофильных бактерий были наиболее распространены представители родов Marinococcus и Halomonas.
Marinococcus halophilus штамм Ж14 (ИКВС). Фенотипические свойства: кокки диаметром 1-1,5 мкм одиночные в парах, но чаще всего образующие скопления неправильной формы, грамположительные каталазоположительные. При росте на агаризованной среде образуют средние с ровным краем выпуклые блестящие ярко-оранжевые колонии. Штамм не разрушается при суспендировании в дистиллированной воде. По данным анализа нуклеотидной последовательности гена 16S РНК наиболее близок (99% сходства) к M. halophilus штамм DSM 20408 (номер последовательности в NCBI — NR_026268.1).
Далее была предпринята попытка оценить влияние экстремально галофильных архей и умеренно-галофильных бактерий на сроки сохранения аллохтонных микроорганизмов в рапе. При сокультивировании с экстремально галофильными археями H. tebenquichense и умеренно галофильными бактериями M. halophilus отмечено, что за первые 2 суток в рапе численность кишечной палочки плавно снижалась на 2 порядка как в контрольной, так и опытных пробах. Начиная с 3 суток в случае M. halophilus и с 5— в случае H. tebenquichense появлялась разница в численности E. coli, по сравнению с контролем. Так, если в контроле количество эшерихий резко сокращалось, достигая к 7 суткам нулевой отметки, то в присутствии M. halophilus кривая численности кишечных палочек сохранялось практически на одном уровне до 8 суток с последующим снижением до нуля к 11 суткам. Присутствие H. tebenquichense также продлевало сроки выживания E. coli в рапе до 11 суток, хотя в начале сокультивиро-вания падение численности E. coli было более выраженным, чем при действии M. halophilus. Несмотря на то, что E. шИ переставали высеваться на среде Эндо, после пассажа изолятов через богатые питательные среды рост эшерихий возобновлялся и продолжался вплоть до конца эксперимента (36 дней). Подобное явление, возможно, связано с образованием в популяции кишечной палочки персистеров, что описано в литературе [4].
В процессе сокультивирования на 3 — 7 сутки была отмечена диссоциация E. coli по размеру колоний, а также по некоторым биохимическим свойствам (по расщепле-
нию лактозы и гидролизу эскулина): наряду с лактозопозитивными колониями средних размеров появлялись мелкие лактозонегативные.
Отмечено, что у E. coli в присутствии H. tebenquichense наблюдалось уменьшение антигистоновой активности до 8 — 9 мкг/мл по сравнению с исходным уровенем (12,8 мкг/мл), тогда как в контроле и при сокультивировании с M. halophilus антигистоно-вая активность сохранялась на исходном уровне. Антилизоцимная активность эше-рихий на протяжении всего эксперимента не изменялась и составляла 5 мкг/мл.
Представляла интерес оценка антагонистической активности галофильных микроорганизмов, выделенных из озера Развал, по отношению к условно патогенным бактериям: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, E. coli, Enterococcus spp., Klebsiella pneumoniae. В качестве аутохтонной микрофлоры исследовано 17 штаммов умеренно галофильных бактерий и 2 штамма экстремально галофильных архей.
Установлено, что условно патогенные бактерии проявляли различную чувствительность к антагонистическим веществам аутохтонных бактерий. Среди умеренных галофилов ингибирующее влияние на P. aeruginosa было отмечено у 17% штаммов, на S. aureus — у 25% штаммов, на E. coli — у 83%, на Enterococcus spp. — у 88%, тогда как 76% штаммов угнетали рост K. pneumoniae.
Обращает на себя внимание избирательное действие клеточных экстрактов галофильных микроорганизмов на рост условно патогенных бактерий. Так, клеточный экстракт M. halophilus угнетал развитие Enterococcus spp., S. aureus, K. pneumoniae в 11 — 17% случаев, однако не влиял на рост E. coli и P. aeruginosa. Напротив, штамм H. tebenquichense оказывал антагонистическое воздействие на E. coli (снижение роста на 29%) и в меньшей степени на K. pneumoniae и P. aeruginosa (10%).
ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ полученных данных позволил выявить два разнонаправленных эффекта влияния аутохтонной галофильной водной микрофлоры на аллохтонную: протектив-ное действие живых клеток микроорганизмов и антагонистическую активность их клеточных экстрактов. Ранее сходный результат был получен нами для других групп микроорганизмов: так, живая культура галофильной водоросли D. salina пролонгировала сохранение E. coli почти в два раза, а экстракт клеток оказывал противоположное действие, способствуя более быстрой элиминации эшерихий [5].
Известна способность галофильных и негалофильных бактерий к обмену осмо-протекторами за счет секреции галофилами в среду растворимых веществ, например, эктоина у Halomonas elongata, глицерола у дрожжей Debaryomyces hansenii и др. [15, 10]. В свете этого, находит объяснение наблюдаемый протективный эффект представителей аутохтонной микрофлоры по отношению к энтеробактериям. Также подтверждением этому служит наличие осморегуляторной транспортной системы, позволяющей негалофильным микроорганизмам получать извне необходимые осмопротекторы [15]. С помощью этого механизма условно патогенные микроорганизмы, не способные к достаточно эффективной осморегуляции, могут выживать в гиперосмотических условиях, как это показано на примере протективного влияния эктоина на энтеробактерии [12].
Представленные материалы демонстрируют эволюционно сложившийся механизм поддержания гомеостаза галофильного биоценоза, который условно патогенные бактерии могут активно использовать для сохранения в гипергалинных условиях.
Другим обнаруженным эффектом явилась антагонистическая активность аутохтонной микрофлоры (архей и бактерий) по отношению к аллохтонной. Широкая распространенность антагонистической активности по отношению к условно патогенным бактериям была обнаружена нами ранее у клеточных экстрактов представителей умеренно галофильных бактерий, водорослей и гетеротрофных жгутиконосцев [7]. Представленные материалы свидетельствуют, что антагонистическая активность аутохтонной микрофлоры по отношению к аллохтонной может способствовать устойчивости гипергалинного микробиоценоза, обеспечивая стабильный состав и ускоряя процессы самоочищения. Сравнение полученных результатов с сезонными изменениями численности микроорганизмов объясняет динамику количе-
ства эвтрофных негалофильных бактерий, которое нарастает во время цветения га-лофильных водорослей и бактерий и снижается при их массовом отмирании [8].
Таким образом, взаимодействие автохтонных и аллохтонных микроорганизмов, обусловленное протективным эффектом и антагонистическим действием, регулирует выживание микроорганизмов в гипергалинных водоемах и изменяет сроки их самоочищения. Полученные экспериментальные данные расширяют представление о механизмах выживания микроорганизмов в гиперосмотических условиях, реализующихся на биоценотическом уровне. Представленные материалы позволяют по-новому взглянуть на проблему определения санитарных показателей гипергалинных водоемов. По-видимому, не следует переоценивать роль высокой минерализации как фактора самоочищения соленых водоемов, поскольку симбиотическое взаимодействие галофильных микроорганизмов способно регулировать выживание условно патогенных бактерий. Это необходимо принимать во внимание при планирования природоохранных и санитарно-противоэпидемических мероприятий.
Работа выполнена при поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Живая природа» (проект № 12-П-4-1039) и Программы инициативных проектов фундаментальных исследований, выполняемых в УрО РАН (проект № 12-У-4-1031).
Л ИТЕРАТУРА
1. Бухарин О.В., Валышев А.В., Елагина Н.Н. и др. Способ определения антилизоцимной активности микроорганизмов. Патент РФ № 2126051, 1999.
2. Бухарин О.В., Плотников А.О., Немцева Н.В., Сгибнев А.В. Способ определения антиги-стоновой активности микроорганизмов. Патент РФ № 2065879, 1996.
3. Бухарин О.В., Черкасов С.В., Сгибнев А.В. и др. Влияние микробных метаболитов на активность каталазы и рост Staphylococcus aureus 6538 P. Бюлл. экспер. биол. и мед. 2000, 130 (7): 80-82.
4. Льюис К. Персистирующие клетки и загадка выживания биопленок. Биохимия. 2005, 70 (2): 327-336.
5. Немцева Н.В., Селиванова Е.А., Плотников А.О. Роль симбиотических взаимодействий в выживании микроорганизмов в гипергалинных водоемах. Журн. микробиол. 2006, 4: 117-120.
6. Немцева Н.В., Селиванова Е.А., Яценко-Степанова Т.Н., Игнатенко М.Е. Структура альго-планктона в Соль-Илецких озерах с различным уровнем солености. Известия ПГПУ им. В.Г. Белинского. 2011, 25: 531-537.
7. Селиванова Е.А. Симбиотические связи микроорганизмов в планктонных сообществах соленых водоемов. Автореф. дис. канд. мед. наук. Оренбург, 2007.
8. Селиванова Е.А. Структура и динамика бактериопланктона Соль-Илецких гипергалинных и мезогалинных озер. Вестник ОГУ. 2011, 4: 53-56.
9. Селиванова Е.А., Немцева Н.В. Персистентные свойства микроорганизмов, обитающих в высокоминерализованных водоемах. Журн. микробиол. 2012, 4: 62-66.
10. González-Hernández J.C, Jiménez-Estrada M., Реса A. et al. Comparative analysis of trehalose production by Debaryomyces hansenii and Saccharomyces cerevisiae under saline stress. Extremophiles. 2005, 9: 7-16.
11. Grosskopf R., Janssen P.H., Liesack W Diversity and structure of the methanogenic community in anoxic rice paddy soil microcosms as examined by cultivation and direct 16S rRNA gene sequence retrieval. Appl. Environ. Microbiol. 1998, 64: 960-969.
12. Jebbar M., Talibart R., Gloux K. et al. Osmoprotection of Escherichia coli by ectoin: uptake and accumulation characteristics. J. Bacteriol. 1992, 174: 5027-5035.
13. Leuko S., Goh F., Allen M.A. et al. Analysis of intergenic spacer region length polymorphisms to investigate the halophilic archaeal diversity of stromatolites and microbial mats. Extremophiles. 2007, 11: 203-210.
14. Oren A. The ecology of the extremely halophilic archaea. FEMS Microbiology Reviews. 1994, 13: 415-440.
15. Vermeulen V., Kunte H.J. Marinococcus halophilus DSM 20408T encodes two transporters for compatible solutes belonging to the betaine-carnitine-choline transporter family: identification and characterization of ectoine transporter EctM and glycine betaine transporter BetM. Extremophiles. 2004, 8: 175-184.
Поступила 12.02.13
Контактная информация: Немцева Наталия Вячеславовна, д.м.н., проф., 460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11, р.т. (3532)77-54-17
