CC BY
199
УДК 543.51+ 547.814.5
ГАЛОФИЛЬНЫЕ И ГАЛОТОЛЕРАНТНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ -
ПРОДУЦЕНТЫ ЭК30П0ЛИСАХАРИД0В, ВЫДЕЛЕННЫЕ
ИЗ СОЛЕНЫХ ОЗЕР КАРУН (ЕГИПЕТ) И ЭЛЬТОН (РОССИЯ) щЛ
И. М. Ибрахим, С. А. Коннова, Е. Н. Сигида, гШшт!
Ю. П. Федоненко, В. И. Сафронова, К. А. Е1Ьаппа
Ибрахим Мохаммед Ибрахим, аспирант кафедры биохимии и биофизики, Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н. Г Чернышевского; Assistant Lecturer of Department Agricultural Microbiology, Faculty of Agriculture Fayoum University (Fayoum, Egypt), ibrahim.egypt2016@ yandex.ru
Коннова Светлана Анатольевна, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой биохимии и биофизики, Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского; ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Konnovasa@ yandex.ru
Сигида Елена Николаевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории биохимии, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, si_elena@ mail.ru
Федоненко Юлия Петровна, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией биохимии, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, fedonenko_yu@ ibppm.ru
Сафронова Вера Игоревна, кандидат биологических наук, руководитель Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения, Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии, Санкт-Петербург, v.safronova@rambler.ru
Khaled Abdelrahman Youssef Elbanna, Professor of Department Agricultural Microbiology, Faculty of Agriculture Fayoum University (Fayoum, Egypt); Faculty of Applied Science, Biology Department, Umm Al Qura University (Makkah, KSA)
Микроорганизмы, способные к существованию в высоко засоленных средах, являются продуцентами уникальных по структуре и свойствам соединений, что обусловливает возросший в последнее время интерес исследователей к изучению их биотехнологического потенциала. Целью работы являлся скрининг экзополисахарид-продуцирующих галофильных и галотолерант-ных микроорганизмов из соленых озер в Египте и России. Для выделения и характеристики штаммов использованы микробиологические, физико-химические методы, световая и просвечивающая электронная микроскопия. Таксономические исследования изолятов проведены на основании анализа культурально-мор-фологических, биохимических свойств и данных секвенирова-ния 16S рДНК. Из выделенных 104 изолятов микроорганизмов охарактеризованы 49 штаммов-продуцентов экзополисахаридов. Содержание полисахаридов в культуральной жидкости исследуе-
мых микроорганизмов максимально достигало 13.7 мг/мл. Для 16 изолятов установлена видовая принадлежность. Ключевые слова: галофильные и галотолератные микроорганизмы, экзополисахариды, видовое разнообразие, филогенетические связи.
DOI: 10.18500/1816-9775-2018-18-3-345-353
Большая часть земной поверхности покрыта Мировым океаном, характеризующимся высоким разнообразием населяющей его биоты, что дает исследователям шанс обнаружить микроорганизмы, продуцирующие соединения с уникальными свойствами и химическим составом [1]. В то же время гиперсоленые среды, такие как естественные соленые и соляные озера, представляют экосистемы с меньшим разнообразием, но более высокой плотностью сообществ [2]. Эти относительно просто организованные экосистемы по сравнению с морскими или пресноводными представляют удобный объект исследования фундаментальных аспектов биоразнообразия, селекции, биогеографии и эволюции микроорганизмов. Среди входящих в их состав галотолерантных и галофильных микроорганизмов встречаются представители трех основных доменов - эука-риоты, археи и бактерии [3], причем среди последних представлены аэробы, факультативные и облигатные анаэробы, как грамотрицательные, так и грамположительные [4].
По способности обитать в средах с различными концентрациями хлорида натрия выделенные и охарактеризованные до настоящего времени галофильные микроорганизмы разделяют на четыре группы: слабые (2-5% КаС1), умеренные (5-15% КаС1), экстремальные (15-32%) и пограничные экстремальным галофилы (>15% КаС1). Галотолерантные (осмофильные) микробы не требуют хлорида натрия для своего роста, но могут адаптироваться к довольно высоким (до 15%) концентрациям соли [5-7].
Галофильные микроорганизмы представляют перспективный объект исследований с целью дальнейшего использования их биотехнологического потенциала. Среди галобактерий часто встречаются продуценты экстраклеточных
ферментов. Например, из различных образцов соли, собранных компанией «Emisai salt company» в озере Карун (Египет), были выделены 33 бактериальных изолята - продуценты протеаз и 16 изолятов, производящих целлюлазы [8, 9].
Вызывают несомненный интерес и экзо-полисахариды (ЭПС) галобактерий. Сазерленд впервые использовал термин « экзополисахарид» для описания высокомолекулярных углеводных полимеров, производимых именно морскими бактериями [10]. В ходе адаптации к существованию в засоленных условиях обитания у многих микроорганизмов происходят модификации молекул, формирующих поверхность клетки, например, фосфолипидов [10]. Охарактеризованы ЭПС некоторых галофильных/галотолерантных микроорганизмов, среди которых преимущественно представлены археи и морские бактерии [11-14]. Микробиом соленых и соляных озер, проявляющих различия в химическом составе, уровне техногенного загрязнения и т.д., исследован недостаточно и, как следствие, ограничена информация о продуцируемых микроорганизмами ЭПС.
Благодаря уникальной структуре и проявляемым физико-химическим свойствам микробные полисахариды широко используются в пищевой, фармацевтической и других отраслях производства. Некоторые из них являются эмульгаторами, стабилизаторами, загустителями, желирующими агентами, коагулянтами, компонентами смазок, материалами для пленочных покрытий и пр. [15].
Целью настоящего исследования являлся скрининг галофильных микроорганизмов, изолированных из соленых озер Карун (мухафаза Эль-Файюм, Египет) и Эльтон (Волгоградская область, Россия), направленный на выявление наиболее перспективных штаммов в отношении продукции ЭПС, с дальнейшей их идентификацией на основании данных фенотипического исследования и анализа нуклеотидной последовательности генов 16S рДНК.
Материалы и методы
Галофильные изоляты выделяли с использованием модифицированной среды S-G (Sehgal and Gibbons, 1960). Отдельно подготавливали два раствора, содержащих в пересчете на конечный объем среды (1 л) следующие компоненты: А -200 мл раствора глюкозы (1%), сахарозы (1%), дрожжевого экстракта (1%), который трижды дробно пастеризовали (100°C, 15 мин); Б - 800 мл раствора, NaCl (в зависимости от варианта опыта: 0, 5, 10, 15 или 25%), MgSO4x7H2O (2%), KCl (0.2%), цитрат натрия Na3C6H5O7 (0.3%), который автоклавировали (121°С, 30 мин). После стерили-
зации растворы смешивали и титровали 1 н NaOH до конечного значения рН 7.5. Для культивирования микробных изолятов использовали жидкую и агаризованную (1.5% бактоагара) среду.
Для получения накопительной культуры в среду S-G (90 мл) добавляли образцы в жидкой (10 мл) либо твердой (10 г) форме, инкубировали при 30 и 37° С в течение 3 -7 суток на ротационном шейкере (200 об/мин). Затем из аликвот последовательных разведений каждой накопительной культуры делали высевы на твердую среду S-G и инкубировали при 30 и 37° С в течение 2 недель. ЭПС-продуцирующие изоляты отбирали по способности к образованию ослизненных колоний, которые рассевали на свежую среду для получения отдельных колоний. Чистоту культур контролировали с помощью световой микроскопии. Хранение отобранных микробных культур осуществляли при -70°С в среде S-G, содержащей 20% глицерина. Штаммы депонированы в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ).
Для каждой изолированной культуры микроорганизмов описывали морфологию колоний, осуществляли окрашивание по Граму согласно процедуре [16], также выполняли тесты с ги-дроксидом калия [17]. Окрашивание спор было выполнено по Шефферу-Фултону и др. в соответствии с [17]. Подвижность изолятов исследовали микроскопическими методами, морфология клеток оценивалась с использованием просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) на микроскопе Libra 120 («Carl Zeiss», Германия) в ЦКП «Симбиоз» ИБФРМ РАН.
Для отнесения галофильных микроорганизмов к одной из четырех групп изоляты тестировали на способность к росту на плотной S-G среде с различным содержанием NaCl (0, 5, 10, 15 и 25%) [18].
Из жидкой культуры на стационарной фазе роста клетки осаждали центрифугированием (4400 об/мин, 40 мин). Содержание ЭПС в куль-туральной жидкости определяли после осаждения двумя объемами охлажденного 96% этанола (4°С, 12 ч). Осадок ЭПС дважды промывали этанолом, а затем диализовали в течение 72 ч против дистиллированной воды через мембрану с пределом исключения 14 кДа («Росмедбио», Россия). Концентрацию углеводов в ЭПС определяли методом [19] с использованием глюкозы в качестве стандарта.
Идентификацию микроорганизмов осуществляли на основании данных анализа куль-турально-морфологических и биохимических свойств (GENIII MicroPlate BioLog, США),
а также последовательности гена 16S рРНК, амплификацию которого проводили с использованием пар универсальных праймеров: 5'GCCGGAGGTCATTGCTAGTGGAGTC3' и 5'AGGAGGTGATCCAGCCGCAGATTCC3' [20] и fD1 5'AGAGTTTGATCC-TGGCTCAG3' и rD1 5'CTTAAGGAGGTGATCCAGCC3' [21].
ПЦР выполняли в течение 30 циклов: денатурация 30 с при 95°С, отжиг 1 мин при 40°С и полимеризация в течение 2 мин при 72°С. Продукты ПЦР (~1540 п. н.) разделяли электрофорезом в агарозном геле и извлекали с помощью набора Nucleotrap («Macherey-Nagel», Германия). Секвенирование осуществляли на коммерческой основе в компании «Синтол» (г. Москва), а также в рамках договора о научном сотрудничестве с ФГБНУ ВНИИСХМ (г. Санкт-Петербург).
Сравнение полученных последовательностей 16S рДНК с таковыми в базе данных GenBank осуществляли с использованием онлайн сервиса Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Построение филогенетических дендрограмм методом присоединения соседей осуществляли с использованием программного пакета FASTMe (https:// galaxy.pasteur.fr). Статистическую достоверность
дендрограмм рассчитывали с помощью «boot-strap» анализа с использованием построения 1000 альтернативных деревьев. Micrococcus luteus АТСС 4698 (NR114673) был использован в качестве референтного штамма - представителя неродственной группы.
Результаты и их обсуждение
Из восьми образцов соли оз. Карун (Египет, 29°27'13»с.ш. 30°34'51» в.д.), полученных в 2015-2016 гг. из различных источников, включающих природный неокрашенный соляной раствор, окрашенные соляные растворы из искусственных солнечных соляных прудов, прибрежную и донную почвы солнечных соляных прудов, а также необработанную соль («Emisal Salt Company», Египет), было выделено 78 изолятов, из которых 39 оказались продуцентами ЭПС. Из 26 изолятов, выделенных в 2016 г. из трех различных соляных проб оз. Эльтон (Россия, 49°08'с.ш. и 46°42' в.д.), ЭПС продуцировали 10 изолятов.
ЭПС-продуцирующие изоляты характеризовались способностью к образованию на агаризованной среде S-G, содержащей разные концентрации NaCl, мукоидных колоний (рис. 1).
0% NaCl
5% NaCl
Рис. 1. Рост колоний галофильных и галотолерантных изолятов на средах с различным содержанием соли: 1 - EG1QL3; 2 - EG 9S8QL; 3 - EG1QL30; 4 - EG3QL57; 5 - RU5S2EL
При исследовании отобранных культур методом ПЭМ наблюдали микробные клетки, окруженные слоем слизи (рис. 2).
По устойчивости к различному содержанию КаС1 в среде культивирования исследуемые
микроорганизмы были условно разделены на четыре группы (табл. 1), причем основным критерием при отнесении каждого изолята к определенной группе являлась оптимальная для роста бактериальной культуры концентрация КаС1.
1 2 3
Рис. 2. Морфология клеток изолятов, продуцирующих ЭПС, визуализованная методом ПЭМ: 1 - EG1QL3; 2 - EG3QL57;
3 -EG1QL30
Исследования показали, что в составе первой группы только четыре изолята не демонстрировали рост при концентрациях соли ниже 25%, в то время как изоляты EG4QL54 и БО10Ь53 были способны расти в диапазоне 15-25% №С1, а изо-лят RU2EL38 - 10-25% ШС1. Таким образом, все семь изолятов первой группы можно рассматривать как экстремальные галофилы. Микроорганизмы, отнесенные ко второй группе, демонстрировали активный рост при 15% КаС1, за исключением EG1QL3, который способен расти в широком диапазоне концентраций КаС1 (0-15%). Часть изолятов третьей (EGP5QL1, RU2EL5. EGP2QL34, EGP6QL35, EGP5QL12) и четвертой групп (EGP6QL14, RU2EL4, EGP3QL11: RU2EL1) обнаружили способность к росту как в среде с соответствующей концентрацией №С1 (10 и 5%), так и в среде, не содержащей соли, а часть изолятов этих групп (EG24S8QL, EG18S7QL. EGP1QL18, EG27S8QL, EG1HP4QL.EG33S7QL, EGP3QL10, EG26S8QL) демонстрировала слабый рост при 15% №С1.
Следует отметить, что среди выделенных культур грамположительных бактерий было приблизительно в два раза больше, чем грамотрица-тельных. Только семь изолятов характеризовались отсутствием подвижности и все они относились к грамположительным бактериям. Соотношение споро- и неспорообразующих микроорганизмов было примерно одинаковым.
При микроскопическом исследовании было выявлено, что большинство изолятов представляли собой короткие либо длинные палочки, Исключение составили три штамма микроорганизмов первой группы, которые были плей-оморфными (EG4QL54, EG3QL57) и кокками (RU2EL38), а также три штамма бактерий третьей группы, которые были кокками (EGP5QL1. RU1EL6) и диплококками (EGP1QL18). Сведения о культуральных свойствах исследуемых изолятов на твердой питательной среде представлены в табл. 1.
Все изоляты охарактеризованы по продукции ЭПС, которая достаточно сильно отличалась у разных штаммов (от 0.1 до 13.7 мг в мл культу-ральной среды (см. табл. 1)). Следует отметить, что проведенный скрининг характеризует способность к продукции ЭПС у выделенных штаммов только в общих чертах, поскольку потенциал этих микроорганизмов может быть более высоким при оптимизации условий их культивирования. Тем не менее уровень синтезированных исследуемыми микроорганизмами ЭПС согласуется с таковым для других галофильных бактерий [22].
Отбор штаммов для проведения дальнейших исследований осуществляли, учитывая их способность к продукции ЭПС (мг/мл) в пределах каждой группы (см. табл. 1). Поскольку группы различались количеством отнесенных к ним штаммов, то из первой и второй групп было отобрано по три изолята - EG3QL57, EG3QL50, RU2EL38 и EG1QL3, EG9S8QL, EGP4QL47 соответственно. Из третьей группы были отобраны шесть изолятов - EG1QL30, EGP5QL12, EG24S8QL, EG18S7QL, EGT5QL15 и EG2QL8, а из четвертой - двенадцать изолятов: EG1HP4QL, RU2EL4, EGP5QL39, RU3EL3, RU5S2EL, EG6S8QL, RU2EL1, EG19S7QL, EG27S8QL, EG30S8QL, EG33S7QL и EG26S8QL.
По результатам исследования последовательности нуклеотидов генов 16S рДНК для шестнадцати из отобранных изолятов установлена принадлежность к десяти родам, восемь из которых - представители бактерий: Bacillus, Salinibacillus, Virgibacillus, Piscibacillus, Halobacillus, Marinococcus, Chromohalobacter, Halomonas, а два - архей: Haloterrigena и Halobacterium. Как следует из приведенных данных, на рис. 3 и в табл. 2 гомология нуклео-тидной последовательности генов 16S рДНК исследуемых изолятов с таковой наиболее близких видов (база данных GenBank) для большинства штаммов составляла от 98.5 до 99%, в некоторых случаях - 100%.
Таблица 1
Характеристика морфологии колоний и клеток, продуцирующих ЭПС галофильных и галотолерантных микроорганизмов
№ Изолят Морфология колоний ЭПС, мг/мл Окраска по Граму Подвижность Спорообразование
Группа 1: экстремальные галофилы (25% №С!)
1 Б02дЬ55 Круглые розовые ослизненные 0.4 - + -
2 Б03дЬ50 Точечные розовые ослизненные 1.5 - + -
3 Ш1ЕЬ16 Круглые ярко-красные ослизненные 0.5 + + -
4 Ш2ЕЬ38 Точечные розовые ослизненные 0.9 + - -
5 Е04дЬ54 Круглые оранжевые ослизненные 0.3 + + -
6 Е03дЬ57 Круглые красные ослизненные 2.3 - + -
7 ЕО^Ь53 Круглые розовые ослизненные 0.2 - + -
Группа 2: пограничные экстремальным галофилы (15% №СГ)
8 ЕОР3дЬ23 Круглые желтые маслянистые 0.4 + + +
9 Е09Б8дЬ Круглые бежевые ослизненные 1.5 - + -
10 ЕОТ2дЬ27 Точечные кремовые ослизненные 0.4 + + +
11 ЕОР5дЬ24 Круглые белые маслянистые 0.1 + + -
12 Ш1ЕЬ3 Неправ. бежевые маслянистые 0.9 + + +
13 ЕОР3дЬ2 Круглые белые ослизненные 0.6 + - +
14 ЕОР4дЬ47 Круглые кремовые маслянистые 1.1 + + +
15 ео^Ь3 Круглые кремовые ослизненные 13.7 - + -
Группа 3: умеренные галофилы 10% №С!
16 ЕОТ5дЬ15 Круглые светло-серые маслянистые 2.0 + + +
17 ЕОР5дЬ1 Точечные белые ослизненные 0.3 + - -
18 Ш2ЕЬ5 Круглые оранжевые маслянистые 1.1 + + +
19 ЕОТ2дЬ37 Точечные кремовые маслянистые 0.6 - + -
20 Е024Б8дЬ Круглые бежевые ослизненные 2.7 - + -
21 Е02дЬ8 Точечные желтые ослизненные 1.8 + + +
22 ЕОР2дЬ34 Круглые белые маслянистые 0.9 + + +
23 Е0^Ь30 Неправильные белые ослизненные 9.3 + + +
24 Е018Б7дЬ Круглые кремовые ослизненные 2.5 - + -
25 ЕОР6дЬ35 Точечные кремовые маслянистые 0.2 + + -
26 Ш1ЕЬ6 Неправильн. бежев. ослизненные 0.8 + - -
27 ЕОТ2дЬ36 Круглые бежевые ослизненные 0.9 + + +
28 ЕОР^Ы8 Точечные белые маслянистые 0.4 + - -
29 ЕОР5дЬ12 Круглые белые ослизненные 5.7 + + +
30 Ш3ЕЬ7 Круглые белые ослизненные 1.2 + + +
Группа 4: слабые галофилы (5% КаС!)
31 Е027Б8дЬ Круглые белые ослизненные 1.8 - + -
32 Ш3ЕЬ3 Круглые белые ослизненные 2.9 + + +
33 ЕОР6дЬ14 Круглые белые ослизненные 0.7 + + +
34 ЕОТ4дЬ13 Неправильн. кремов. маслянистые 1.1 + - +
35 Е06Б8дЬ Неправильные белые ослизненные 2.3 - + -
36 Е01ИР4дЬ Круглые желтые маслянистые 5.2 + + +
37 Ш2ЕЬ4 Круглые белые ослизненные 4.6 + + +
38 ЕОР3дь11 Круглые кремовые маслянистые 0.4 + + -
39 ЕОР5дЬ39 Неправильные белые ослизненные 4.2 + + +
40 Е033Б7дЬ Круглые белые ослизненные 1.5 - + -
41 ЕОР3дью Неправильн. кремов. ослизненные 0.8 - + -
42 ЕОТ2дЬ9 Круглые белые ослизненные 1.3 + - +
43 Е030Б8дЬ Круглые белые ослизненные 1.7 - + -
44 Ш2ЕЬ1 Неправильные белые ослизненные 2.1 + + +
45 ЕОТ4дЬ42 Круглые кремовые маслянистые 0.5 + + +
46 Е026Б8дЬ Круглые бежевые маслянистые 1.5 - + -
47 ЕОТ4дЬ43 Неправильные белые ослизненные 0.2 + + +
48 Е019Б7дЬ Круглые белые маслянистые 1.8 - + -
49 Ш582ЕЬ Круглые коричневые слизистые 2.8 - + -
Рис. 3. Дендрограмма филогенетического сходства, построенная на основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рДНК выделенных изолятов и других близкородственных микроорганизмов. Для построения использован метод присоединения соседей («neighbor-joining»). Слева внизу дан масштаб эволюционных расстояний. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью «Ьоо181гар»-анализа
1000 альтернативных деревьев
67
56 RU2EL
44bBacillus aerophilusHQB244 (KT758443) 4 Bacillus sonorensis BKGN007 (KY287930) " Bacillus licheniformis (JN166722) 81EG1QL30
65Bacillus amyloliquefaciens20-6 (KY072769) RU3EL3
100Bacillus velezensis AB24-SW1(MG890226) 70 EGP5QL12
\83Bacillus halotolerans a2 (MG839270)
99 RU2EL4
r Bacillus paralicheniformis FJAT-47765.1 (MG651169) 1 EGP5QL39
EG2QL8
100
Salinibacillus aidingensis 25-7 (NR042839)
EGT5QL15
,nn 100 ^
100 Virgibacillus massiliensis Vm-5 (NR144700) 6EGP4QL47
"Piscibacillus halophilus H16 (KX068641)
Piscibacilluss alipiscariusZSTC202 (JQ068937) EGT2QL36
93 83Halobacillus trueperi KGW-1(KJ563233)
Halobacillus dabanensis FJAT-46911 (MG651523) EG1HP4QL
RU2EL3
100
L Marinococcus halophilus DSM 20408 NR026268
RU5S2EL
100
Haloterrigena saccharevitans AB12 (AY820136)
-100
100 Natrinema pellirubrum DSM15624(NR102444 EG3QL57 EG3QL50
^ Halobacteriumsalinarum 403 (KY099609) _100, QL31EG
^Chromohalobacter salexigens DSM 3043(NR074225) Halomonas ventosae Al12(NR042812)
Micrococcus luteus ATCC 4698 (NR114673)
71
100
100
95
100
В составе галофильных микроорганизмов, изолированных из образцов соли озер Карун и Эльтон, выявлено присутствие представителей семейств На1оЬас1епасеае, Halomonadaceae и БасШасеае (см. табл. 2). В группе экстремальных галофилов были выявлены представители семейства р. Halobacterium и Haloterrigena (На1оЬас1епасеае) и Marinococcus (БасШасеае). Во второй группе удалось установить видовую принадлежность двух изолятов - представителей р. PiscibaciПш (БасШасеае) и Chromohalobacter
(Halobacteriaceae). Среди умеренных и слабых галофилов преобладали представители сем. Bacillaceae: Bacillus, Salinibacillus, Virgibacillus, Piscibacillus и Halobacillus. Единственный представитель сем. Halomonadaceae - Halomonas ventosae был идентифицирован в составе четвертой группы.
Полученные в нашей работе данные о видовом составе засоленных водоемов коррелируют с результатами подобных исследований. Так, Hedi et al. [23] проводили скрининг бактери-
Таблица 2
Определение видовой принадлежности микроорганизмов по анализу нуклеотидных последовательностей гена 168 рДНК
№ Изоляты Наиболее близкие виды (ID GenBank) Идентичность, %
Группа 1
1 EG3QL57 Haloterrigena saccharevitans* (AY820136) 98.9
2 EG3QL50 Halobacterium salinarum *(KY099609) 100.0
3 RU2EL38 Marinococcus halophilus (NR026268) 98.7
Группа 2
4 EGP4QL47 Piscibacillus halophilus (KX068641) 100.0
5 EG1QL3 Chromohalobacter salexigens (NR074225) 100.0
Группа 3
6 EG2QL8 Salinibacillus aidingensis (NR042839) 98.8
7 EG1QL30 Bacillus licheniformis (JN166722) 98.9
8 EGT2QL36 Piscibacillus salipiscarius (JQ068937) 98.8
9 EGT5QL15 Virgibacillus massiliensis (NR144700) 100.0
10 EGP5QL12 Bacillus velezensis (MG890226) 98.9
Группа 4
11 EGP5QL39 Bacillus paralicheniformis (MG651169) 98.7
12 RU2EL1 Bacillus aerophilus (KT758443) 100.1
13 RU3EL3 Bacillus amyloliquefaciens (KY072769) 98.9
14 EG1HP4QL Halobacillus dabanensis (MG651523) 100.0
15 RU2EL4 Bacillus halotolerans (MG839270) 98.9
16 RU5S2EL Halomonas ventosae (NR042812) 98.7
Примечание. * - представители Archaea.
альных и архейных сообществ в отложениях Эль-Джеридского соленого озера в Тунисе с использованием фенотипических и филогенетических подходов и обнаружили, что члены домена Bacteria принадлежат к родам Salicola, Pontiba-cillus, Halomonas, Marinococcus и Halobacillus, тогда как единственный член домена Archaea был представлен родом Halorubrum. Исследования разнообразия галофильных бактерий вдоль прибрежных районов Карнатака (Индия) показали преобладание родов Virgibacillus, Halobacil-lus, Salinibacillus, Nesterenkonia, Pontibacillus и Staphylococcus [24]. Аналогично умеренно гало-фильные аэробные бактерии, принадлежащие к родам Halomonas, Bacillus и Chromohalobacter, были выделены из многослойных солнечных сателлитов вдоль побережья Гуджарата, Ориссы и Западной Бенгалии, Индия [13].
Таким образом, по результатам исследования показано, что среди изолятов микроорганизмов, адаптированных к существованию в засоленных средах, 47% являются продуцентами полисахари-
дов ЭПС, т.е. для них, очевидно, продукция глико-полимеров является стратегией выживания в экстремальных средах. Слой ЭПС защищает клетки от экстремальных условий окружающей среды и часто используется бактериями как источник углерода и энергии во время голодания. Учитывая, что адаптация к различной засоленности, техногенному загрязнению и другим негативным факторам путем изменения состава и продукции ЭПС исследована недостаточно, выделенные штаммы являются весьма перспективными объектами, как для изучения фундаментальных основ процесса адаптации с использованием ЭПС, так и для биотехнологических целей как продуценты полисахаридов.
Благодарности
Авторы выражают благодарность ведущему инженеру ЦКП «Симбиоз» кандидату химических наук А. М. Бурову за получение микрофотографий ПЭМ, а также доктору биологических наук, профессору А. С. Кашину за
помощь в получении образцов из Озера Эльтон (Волгоградская область, Россия). Депонирование штаммов в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ) было выполнено в рамках Программы ФАНО России по развитию и инвентаризации биоресурсных коллекций научными организациями.
Список литературы
1. Aneiros A., Garatei A. Bioactive peptides from marine sources. Pharmacological properties and isolation procedures // J. Chromatogr. B. Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 2004. Vol. 15. P. 41-53.
2. Ma Y., Galinski E. A., Grant W. D, Oren A., Ventosa A. Halophiles 2010 : life in saline environments // Appl. Environ. Microbiol. 2010. Vol. 76(21). P. 6971-6981.
3. Gontia-Mishra I., Sapre S., Tiwari S. Diversiy of halophilic bacteria and actinobacteria from India and their biotech-nological applications // Ind. J. Geo Marine Sci. 2017. Vol. 46 (8). P. 1575-1587.
4. Johnson A., Thurlow L., Zwenger R., Gillock E. Partial characterization of two moderately halophilic bacteria from a Kansas salt marsh // Prairie Nat. 2007. Vol. 39. P. 29-39.
5. Rodriguez-Valera F., Ruiz-Berraquero F., Ramos-Cor-menzana A. Characteristics of the heterotrophic bacterial populations in hypersaline environments of different salt concentrations // Microb. Ecol. 1981. Vol. 7 (3). P. 235-243.
6. Rodriguez-Valera F. Characteristics and microbial ecology of hypersaline environments // Halophilic Bacteria / ed. F. Rodriguez-Valera. CRC Press, Boca Raton, Fla, USA, 1988. Vol. 1. P. 3-30.
7. Kushner D. J., Kamekura M. Physiology of halophilic eubacteria // Halophilic Bacteria / ed. F. Rodriguez-Valera. CRC Press, Boca Raton, Fla, USA, 1988. Vol. 1. P. 109-138.
8. Elbanna K., Ibrahim I. M., Revol-Junelles A.-M. Purification and characterization of halo-alkali-thermophilic protease from Halobacterium sp. strain HP25 isolated from raw salt, Lake Qarun, Fayoum, Egypt // Extremophiles. 2015. Vol. 19 (4). P. 763-774.
9. KoranyA. H., AliA. E., Essam T. M., MegahedS. A. Optimization of cellulase production by Halobacillus sp. QLS 31 isolated from Lake Qarun, Egypt // Appl. Biochem. Biotechnol. 2017. Vol. 183 (1). P. 189-199.
10. Sutherland I. W. Bacterial exopolysaccharides // Adv. Microb. Physiol. 1972. Vol. 8. P. 143-213.
11. Ventosa A., Mellado E., Sánchez-Porro C., Márquez M. C. Halophilic and halotolerant microorganisms from soils // Microbiology of extreme soils / eds. P. Dion, C. S. Nau-tiyal. Heidelberg : Springer, 2008. P. 85-11.
12. Litchfield C. D. Potential for industrial products from the halophilic Archaea // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2012. Vol. 38. P. 1635-1647.
13. Biswas J., Paul A. K. Production of extracellular poly-
meric substances by halophilic bacterial diversity in multi-pond solar salterns // Chinese J. Biol. 2014. Vol. 12. DOI: 10.1155/2014/205731
14. Casillo A., Lanzetta R., Parrilli M., Corsaro M. M. Ex-opolysaccharides from marine and marine extremophilic bacteria: structures, properties, ecological roles and applications // Mar. Drugs. 2018. Vol. 16 (2). DOI: 10.3390/ md16020069
15. Sutherland I. W. Microbial exopolysaccharides-structural subtleties and their consequences // Pure Appl. Chem. 1997. Vol. 69 (9). P. 1911-1917.
16. DussaultH. P. An improved technique for staining halophilic bacteria // J. Bacteriol. 1955. Vol. 70. P. 484-485.
17. Gerhardt P., Murray R. G. E., Wood W. A., Krieg N. R. Methods for general and molecular bacteriology / American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1994. P. 607-654.
18. Nieto J., Fernandez-CastilloR., MarquezM., VentosaA., Quesada E., Ruiz Berraquero F. Survey of metal tolerance in moderately halophilic eubacteria // Appl. Environ. Microbiol. 1989. Vol. 55. P. 2385-2390.
19. DuBois M., Gilles K. A., Hamilton J. K., Rebers P. A., Smith F. Calorimetric method for determination of sugars and related substances // Anal. Chem. 1956. Vol. 28. P. 350-356.
20. Hezayen F. F., Tindall B. J., Steinbüchel A., Rehm B. Characterization of a novel halophilic archaeon, Halobiforma haloterrestris gen. nov., sp. nov., and transfer of Natrono-bacterium nitratireducens to Halobiforma nitratireducens comb. nov. // Intern. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. Vol. 52. P. 2272-2280.
21. Weisburg W. G., Barns S. M., Pelletier D. A., Lane D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study // J. Bacteriol. 1991. Vol. 173 (2). P. 697-703.
22. Fang Y., Ahmed S., Liu S., Wang S., Lu M., Jiao Y. Optimization of antioxidant exopolysaccharidess production by Bacillus licheniformis in solid state fermentation // Carbohydr. Polym. 2013. Vol. 98 (2). P. 1377-1382.
23. Hedi A., Sadfi N., Fardeau M. L., Rebib H., Cayol J. L. Ollivier B., Boudabous A. Studies on the biodiversity of halophilic microorganisms isolated from El-Djerid salt lake (Tunisia) under aerobic conditions // Intern. J. Microbiol. 2009. DOI: 10.1155/2009/731786
24. Jayachandra S. Y., Kumar S. A., Merley D. P., Sulocha-na M. B. Isolation and characterization of extreme halo-philic bacterium Salinicoccus spp. JAS4 producing extracellular hydrolytic enzymes // Rec. Res. Sci. Technol. 2012. Vol. 4 (4). P. 46-49.
Exopolysaccharide-Producing Halophilic
and Halotolerant Microorganisms Isolated
from the Saline Lakes Qarun (Egypt) and Elton (Russia)
I. M. Ibrahim, S. A. Konnova, E. N. Sigida, Yu. P. Fedonenko, V. I. Safronova, ^ A. Elbanna
Ibrahim M. Ibrahim, ORCID 0000-0002-5374-3508, Saratov State University, 83, Astrakhanskaya Str., Saratov, 410012, Russia; Fayoum University, Egypt, Fayoum, POBox: 63514 (Egypt), ibrahim. egypt2016@yandex.ru
Svetlana A. Konnova, ORCID 0000-0002-9607-8173, Saratov State University, 83, Astrakhanskaya Str., Saratov, 410012, Russia; Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Saratov, 13, Entuziastov Pr., Saratov, 410049, Russia, konnovasa@ yandex.ru
Elena N. Sigida, ORCID 0000-0002-9223-4589, Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Saratov, 13, Entuziastov Pr., Saratov, 410049, Russia, si_elena@mail.ru
Yulia P. Fedonenko, ORCID 0000-0003-0255-8190, Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Saratov, 13, Entuziastov Pr., Saratov, 410049, Russia, fedonenko_yu@ibppm.ru
Vera I. Safronova, ORCID 0000-0003-4510-1772, All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology, Saint Petersburg; 8, Pushkin, Saint Petersburg, 196608, Russia, v.safronova@rambler.ru
Khaled A. Elbanna, ORCID 0000-0001-6499-9261, Faculty of Agriculture Fayoum University (Fayoum,. Postal Address: Fayoum - Fayoum University - Faculty of Agriculture - microbiology Department - POBox: 63514, Egypt; Faculty of Applied Science, Biology Department, Umm Al Qura University (Makkah, KSA). Postal Address: P.O. Box: 7067, Makkah (21955), Saudi Arabia, kab00@fayoum.edu.eg
Microorganisms inhabiting saline environments can produce compounds unique in structure and properties. This ability recently prompted researchers to study the biotechnological potential of
halophiles. This work aimed at screening the exopolysaccharide-producing halophilic and halotolerant microorganisms of two saline lakes, one in in Egypt and the other in Russia. For strain isolation and characterization, we used microbiological and physico-chemical methods, as well as light and transmission electron microscopy. Taxonomy studies of the isolates was studied on the basis of analyses of cultural and morphological characteristics, biochemical properties and 16S rDNA sequencing data. Of 104 isolates adapted to saline environments we selected 49 exopolysaccharide-producing strains. The content of polysaccharides in the culture liquids of the isolated microorganisms reached 13.7 mg/ml-1. Sixteen isolates were identified to species.
Key words: halophilic and halotolerant microorganisms, exopolysac-charides, species diversity, phylogenic relationships.
Acknowledgements: The authors are grateful to the leading engineer of the CCU "Symbiosis " Dr. A. M. Burov for obtaining TEM micrographs and to Professor Dr. Sc. A. S. Kashin for assistance in obtaining samples from the lake Elton (Volgograd Region, Russia). The deposition of strains in the Russian Collection of Agricultural Microorganisms was carried out as part of the FASO Russia program on the development and inventory of bioresource collections by scientific organizations.
Образец для цитирования:
Ибрахим И. М, Коннова С. А., Сигида Е. Н., Федоненко Ю. П., Сафронова В. И., Elbanna К. A. Галофильные и галотолерантные микроорганизмы - продуценты экзополисахаридов, выделенные из соленых озер Карун (Египет) и Эльтон (Россия) // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2018. Т. 18, вып. 3. С. 345-353. DOI: 10.18500/1816-9775-2018-18-3-345-353
Сite this article as:
Ibrahim I. M., Konnova S. A., Sigida E. N., Fedonenko Yu. P., Safronova V. I., Elbanna К. A. Exopolysaccharide-Producing Halophilic and Halotolerant Microorganisms Isolated from the Saline Lakes Qarun (Egypt) and Elton (Russia). Izv. Saratov Univ. (N. S.), Ser. Chemistry. Biology. Ecology, 2018, vol. 18, iss. 3, pp. 345-353 (in Russian). DOI: 10.18500/1816-97752018-18-3-345-353
