CC BY
173
УДК 579.222
Селиванова Е.А., Немцева Н.В.
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Оренбург E-mail: selivanova-81@mail.ru
АНТИОКСИДАНТНЫЕ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ЭКСТРЕМАЛЬНО ГАЛОФИЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
В статье приведены результаты исследования антиоксидантых и антибактериальных свойств галофильных микроорганизмов. Показано, что экстракты клеток экстремально галофильных архей обладают выраженными антиоксидантными свойствами. Обоснована ценность смеси экстрактов микроводоросли D. salina и экстремально галофильных архей Halorubrum tebenquichense для биотехнологии в качестве основы для создания фармацевтической композиции с антиокси-дантными свойствами.
Ключевые слова: галофильные микроорганизмы, антиоксидантная активность, Halorubrum tebenquichense.
Микроорганизмы, приспособленные к обитанию в экстремальных условиях континентальных гипергалинных водоемов, отличающихся непостоянством уровня солености и содержания биогенных элементов, широким диапазоном температурных колебаний и действием высокой инсоляции могут быть перспективными источниками биологически активных веществ [1]. Так галофильные микроводоросли привлекательны для биотехнологии благодаря высокой скорости наращивания биомассы, высокому содержанию биологически активных веществ, отсутствию токсичности [2].
Достаточно много данных есть в литературе по поводу действия биологически активных веществ из гидробионтов как на микроорганизмы, так и на макроорганизм [3], однако влияние БАВ из экстремально галофильных микроорганизмов менее изучено. Развиваясь в экстремальных условиях среды, организмы зачастую синтезируют в больших количествах уникальные субстанции. Так галофильная микроводоросль Dunaliella salina накапливает ß-каротин, оказывающий гепатопротекторное, антиоксидантное, противоопухолевое действие [4, 5]. Для экстремально галофильных архей показано, что в состав пигментов у некоторых видов входит ß-каротин, ликопин [6], продемонстрировано выраженное стимулирующее действие археосом из полярных липидов архей как на гуморальные, так и на клеточные механизмы иммунного ответа при парентеральном введении [7].
В связи с вышеизложенным, представляет несомненный интерес изучение антиоксидант-ных и антибактериальных свойств новых штаммов галофильных одноклеточных микроорганизмов, выделенных из гипергалинных водо-
емов Приэльтонья и Предуралья, с целью получения новых эффективных источников биологически активных веществ.
Материалы и методы
В экспериментах использовали чистые культуры прокариот, выделенные из континентального гипергалинного озера Развал (Оренбургская область, Соль-Илецкий район), минерализация рапы в котором достигает 350,0 г/л. Чистые культуры прокариот получали с помощью бактериологического метода с использованием среды для экстремальных галофилов (NaCl - 250 г/л, KCl - 2,0 г/л, MgSO4 х 7 H2O - 20,0 г/л, цитрат Na - 3,0 г/л, пептон - 5,0 г/л, дрожжевой автоли-зат - 3,0 г/л, глюкоза - 2,0 г/л, агар-агар - 20 г/ л). Идентификацию прокариот проводили на основании определения последовательности гена 16S рРНК. С использованием праймеров для бактерий 16SF190: ATTAGCTAGTAGGTGGGGTAA и 16SR1100: TTACTAGCGATTCCGACTTCA (НПО «СИНТОЛ», Москва), для архей: A109f: ACKGCTCAGTAACACGT и A934b: GTGCTCCCCCGCCAATTCCT [11] проведена ПЦР амплификация соответствующих участков геномной ДНК всех исследованных изолятов. Режим ПЦР: 5 минут - 95°, затем 35 циклов 95° - 20 секунд, 55° - 20 секунд, 72° - 60 секунд. После очистки, ампликоны секвенировали с помощью набора BigDye v3.1 (Applied Biosystem) на автоматическом секвенаторе ABI 3130xl по стандартным методикам. Для всех исследованных образцов получены последовательности нуклеотидов как смысловой, так и антисмысловой цепи ДНК. Поиск гомологичных последовательностей осуществляли в базе данных NCBI GeneBank при помощи программы BLAST. Филогенетические де-
Селиванова Е.А., Немцева Н.В.
Антиоксидантные и антибактериальные свойства...
ревья построены с помощью программы СЫа^.
Антагонистическую активность экстрактов и супернатантов исследуемых микроорганизмов оценивали фотометрическим методом [8]. Определение антиоксидантной активности клеточных экстрактов исследуемых культур проводили с помощью хемилюминомера ХЛ-003, оценивая степень подавления интенсивности хемилюминес-ценции, свидетельствующей о скорости перекис-ного окисления липидов [9, 10]. Учитывали снижение всех параметров хемилюминесценции (спонтанной светимости, максимальной светимости, светосуммы медленной вспышки, высоты быстрой вспышки) относительно контрольной стандартной хемилюминесцентной системы, не содержащей экстракта клеток микроорганизмов.
Результаты и обсуждение
Видовая принадлежность исследуемых культур галофильных микроорганизмов. НаЬгиЬгиш 1еЬеэдшеЬеше штамм КР5 (ИКВС), по данным анализа нуклеотидной последовательности гена
16S РНК наиболее близок (99 % сходства) к H. tebenquichense штамм ALT-6 (номер последовательности в NCBI - NR_028232.1) (рис. 1).
Marinococcus halophilus штамм Ж14 (ИКВС) по данным анализа нуклеотидной последовательности гена 16S РНК наиболее близок (99 % сходства) к M. halophilus штамм DSM 20408 (номер последовательности в NCBI -NR_026268.1) (рис. 2).
Антагонистическая активность исследуемых культур галофильных микроорганизмов. В настоящее время особое внимание уделяется поиску новых природных соединений, обладающих антибактериальной активностью [11]. В качестве источника подобных веществ рассматриваются внеклеточных метаболиты и клеточные экстракты морских и пресноводных микроорганизмов [12]. В связи с этим были проведены эксперименты по определению влияния экстрактов клеток гало-фильных микроорганизмов на ростовые характеристики и свойства условно-патогенных бактерий (таб. 1).
Рисунок 1. Филогенетическое дерево, демонстрирующее положение выделенной культуры Н. 1еЬепдшсЬеп8е штамм КР5 (ИКВС), выделенной из озера Развал, среди представителей рода НаЬгаЬгаш. Известные нуклеотидные последовательности получены из базы данных ОепБапк NCBI
5.9 _
Alkalibaclllus silvisoli strain BM2.seq Thalasscbaclllus dewans G-191 sei Bacillusiiemicellulosilyticus C-1 l.seq Bacillus pseudDlirmLH slrain DSM 6715.5 Bacillus aldlngensis strain 17-5. ssq Bacjiius salarius BHi69.seq
_i— Marinococcus haraphiius DSM 2Q4Q9 seq
rj MarinocDccus halophilus strain C22-3.se
^--магщппит..* уцц 7|j| eq
^^arinococcus halophilus ICIS.seq
4 2
Nudeotide Subsiitutions (x1 OD)
Рисунок 2. Филогенетическое дерево, демонстрирующее положение выделенной культуры М. Ьа1орЫ1и8 штамм Ж14 (ИКВС), выделенной из озера Развал, среди бактерий. Известные нуклеотидные последовательности
получены из базы данных ОепБапк NCBI
Естественные науки
Таблица 1. Антагонистическое действие клеточных экстрактов галофильных микроорганизмов
на условно-патогенные бактерии
Тест-штаммы Галофильные микроорганизмы —_ Снижение интенсивности роста тест-штамма по сравнению с контролем (% OD)
E. coli K. pneumoniae P. aeruginosa S. aureus Enterococcussp.
H. tebenquichense 29±1.03 10±0.81 0 8±0.23 0
M. halophilus 0 17±0.71 0 16±2.19 11 ±1.03
Таблица 2. Параметры хемилюминесценции стандартной хемилюминесцентной системы при добавлении галофильных микроорганизмов в сравнении с контролем
Объект Показатели интенсивности хемилюминесценции (% от контроля)
Светосумма Спонтанная светимость Вспышка Максимальная светимость
схс (контроль) 100 100 100 100
схс+H. tebenquichense 22,2 63,9 35,8 32,9
схс+M. halophilus 38,5 104,1 182,4 122,9
У изученных культур галофильных микроорганизмов антибактериальные свойства были менее выраженными, чем у зеленых галофильных микроводорослей [13].
Антиоксидантная активность исследуемых культур галофильных микроорганизмов. У экстрактов галофильных микроорганизмов была оценена антиоксидантная активность по способности подавлять интенсивность перекисно-го окисления липидов. Были определены наличие и уровень антиоксидантной активности клеточных экстрактов умеренно галофильных бактерий M. halophilus и экстремально галофильных архей H. tebenquichens. Наличие выраженной антиоксидантной активности было зарегистрировано у H. tebenquichens, добавление клеточных экстрактов которых к стандартной хемилюминесцентной системе (схс) приводило к снижению всех основных параметров же-лезоиндуцированной хемилюминесценции, что свидетельствовало о наличии антиоксидантной активности (таб. 2).
Наличие антиоксидантных свойств у экстремально галофильных архей H. tebenquichense описано впервые и открывает перспективу его использования в биотехнологии в качестве источника антиоксидантов наряду с зеленой га-лофильной микроводорослью Dunaliella salina,
шособность клеточных экстрактов которой подавлять перекисное окисление липидов известна и связана с накоплением в клетках водоросли каротиноидов, инактивирующих синглет-ный кислород [14].
Учитывая показанное ранее положительное влияние галофильных архей Halorubrum на рост и повышение антиоксидантных свойств D. salina [15], можно обосновать возможность их совместного культивирования при наращивании биомассы микроводоросли. Выявленное эффективное антиоксидантное действие смеси экстрактов галофильных микроорганизмов объясняется действием каротиноидов, прежде всего, бета-каротина, который в высокой концентрации содержится в клетках D. salina, а также каротиноидов H. tebenquichense. Как известно, сложный состав каротиноидов обуславливает более эффективное подавление процессов свободно-радикального окисления по сравнению с синтетическим бета-каротином [16].
Таким образом, полученные результаты демонстрируют высокую ценность смеси экстрактов микроводоросли D. salina и экстремально галофильных архей H. tebenquichense для биотехнологии в качестве основы для создания фармацевтической композиции с антиоксидантны-ми свойствами.
1.10.2014
Работа выполнена при поддержке грантов по программе фундаментальных исследований Президиума РАН «Живая природа: современное состояние и проблемы развития» проект № 12-П-4-1039, по Программе инициативных проектов фундаментальных исследований Уральского отделения РАН проект № 12-У-4-1031, грантов РФФИ № 13-04-00740-а, № 13-04-10119-к, молодежных инновационных проектов УрО РАН № 14-4-ИП-25, гранта Оренбургской области в сфере научной и научно-технической деятельности
(соглашение №38 от 30.06.2014)
Селиванова Е.А., Немцева Н.В.
Антиоксидантные и антибактериальные свойства..
Список литературы:
1. Неврова Е.Л., Шадрин Н.В. Донные диатомовые водоросли соленых озер Крыма // Морской экологический журнал. -2005. - Т. IV. - № 4. - С. 61-71.
2. Kay R.A., Barton L.L. Microalgae as food and supplement // Food Sci. Nutrition. - 1991. - V. 30. - Р. 555-573.
3. Vetvicka V., Yvin J.C. Effects of marine p-glucan on immune reaction // Int Immunopharmacol. - 2004. № 4. Р. 721-730.
4. Hsu Y.-W., Tsai C.-F., Chang W.-H., Ho Y.-C., Chen W.-K., Lu F.-J. Protective effects of Dunaliella salina - а carotenoids-rich alga, against carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in mice // Food and Chemical Toxicology. - 2008. - V. 46. - Р. 3311-3317.
5. Werman M.J., Ben-Amotz A., Mokady S. Availability and antiperoxidative effects of p-carotene from Dunaliella bardawil in alcohol-drinking rats // The Journal of Nutritional Biochemistry. - 1999. - V. 10. - № 8. - P. 449-454.
6. Asker D., Ohta Y. Production of canthaxanthin by extremely halophilic bacteria // Journal of Bioscience and Bioengineering. -1999. - V. 88. № 6. - P. 617-621.
7. Gonzalez R.O., Higa L.H., Cutrullis R.A., Bilen M., Morelli I., Roncaglia D.I., Corral R.S., Morilla M.J., Petray P.B., Romero E.L. Archaeosomes made of Halorubrum tebenquichense total polar lipids: a new source of adjuvanticity // BMC Biotechnology. -2009. - № 9. - Р. 71-82.
8. Бухарин О.В., Черкасов С.В., Сгибнев А.В., Забирова Т.М., Иванов Ю.Б. Влияние микробных метаболитов на активность каталазы и рост Staphylococcus aureus 6538 Р. // Бюлл. эксп. биол. - 2000. - Т. 130. - № 7. - С. 80 - 82.
9. Владимиров Ю.А., Лопухин Ю.М., Молоденков М.Н., Клебанов Г.И. Регистрация хемилюминесценции составных частей сыворотки крови в присутствии двухвалентного железа // Бюл. экспер. биол. -1982. - № 4. - С. 101-102.
10. Фархутдинов Р.Р., Лиховских В.А. Хемилюминесцентные методы исследования свободно-радикального окисления в биологии и медицине. - Уфа. - 1995. 54 с.
11. Amaro H.M., Guedes A.C., Malcata F.X. Antimicrobial activities of microalgae: an invited review // Science against microbial pathogens: communicating current research and technological advances / Ed. Mйndez-Vilas A. - 2011. - Р. 1272-1280.
12. Волошко Л.Н., Плющ А.В., Титова Н.Н. Токсины цианобактерий (Cyanobacteria, Cyanophyta) // Альгология. - 2008. -Т. 18. - №1. - С. 3-20.
13. Селиванова Е.А., Игнатенко М.Е., Немцева Н.В. Антагонистическая активность новых штаммов зеленых микроводорослей // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2014. - № 4. - С. 72-76.
14. Ben-Amoz A. Dunaliella p-carotene from Science to Commerce // Enigmatic Microorganisms and Life in Extreme Environments / Ed. Seckbach J. Dordrecht/Boston/London: Kluwer Academic Publishers. - 1999. - P. 399 - 410.
15. Немцева Н.В., Селиванова Е.А., Игнатенко М.Е., Шарапова Н.В. Характеристика нового штамма Dunaliella salina (Chlorophyta) и оценка параметров его культивирования // Физиология растений. - 2013. - Т. 60. - № 4. - С. 561-568.
16. Galit L, Michal Y., Shoshana M. In vivo antiperoxidative effect of 9-cis p-carotene compared with that of the all-trans isomer. Nutrition and Cancer. - 1997. - V. 27. - № 3. - Р. 293-297.
Сведения об авторах:
Селиванова Елена Александровна, ведущий научный сотрудник лаборатории водной микробиологии Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, кандидат медицинских наук, доцент
Немцева Наталия Вячеславовна, заведующий лабораторией водной микробиологии
Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, доктор медицинских наук, профессор
460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11, тел. (3532) 775417, e-mail: selivanova-81@mail.ru
