CC BY
32© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 Е.А.Селиванова, М.Е.Игнатенко, Н.В.Немцева
АНТАГОНИСТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НОВЫХ ШТАММОВ ЗЕЛЕНЫХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург
Цель. Скрининг новых штаммов микроводорослей на наличие выраженной антагонистической (антибактериальной) активности по отношению к условно патогенным бактериям. Материалы и методы. Исследовано 11 чистых культур зеленых одноклеточных водорослей, выделенных из пресных и соленых водоемов Оренбургской области, на наличие антагонистической активности по отношению к 4 тест-штаммам условно патогенных бактерий фотометрическим методом. Влияние водных экстрактов микроводоросли Astermonas gracilis Artari на скорость самоочищения рапы от Escherichia coli, а также антибактериальная активность пелоида оценены в условиях сокультивиро-вания. Результаты. Чистые культуры зеленых одноклеточных водорослей Scenedesmus obliquus (Turpin) Kutz, Scenedesmus magnus Meyen var. magnus, Pediastrum duplex Meyen var. duplex, Chlorella vulgaris Bory, Monoraphidium arcuatum (Korschikov) Hindak (=Ankistrodesmus arcuatus Korschikov), Dictyosphaerium sp. обладали наиболее выраженной антагонистической активностью по отношению к условно патогенным бактериям. Водный экстракт микроводоросли A. gracilis благодаря антибактериальному действию ускорял самоочищение рапы от E. coli. Пелоид, содержащий экстракты клеток микроорганизмов, оказывал выраженное антибактериальное действие по отношению к условно патогенным бактериям. Заключение. Внутриклеточно локализованные антагонистические вещества из микроводорослей повышают скорость элиминации аллохтонных микроорганизмов, что является одним из механизмов самоочищения водоема и антибактериального действия пелои-да. Исследованные новые штаммы зеленых микроводорослей, благодаря наличию у них выраженной антагонистической активности, могут иметь широкое практическое применение.
Журн. микробиол. 2014, № 4, С. 72—76
Ключевые слова: зеленые одноклеточные микроводоросли, антагонизм, антибактериальное действие, самоочищение, водоем, пелоид
E.A.Selivanova, M.E.Ignatenko, N.V.Nemtseva
ANTAGONISTIC ACTIVITY OF NOVEL GREEN MICROALGAE STRAINS
Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia
Aim. Screening of novel microalgae strains for the presence of pronounced antagonistic (antibacterial) activity against opportunistic bacteria. Materials and methods. 11 pure cultures of green unicellular algae isolated from fresh and salt basins of Orenburg region were studied for the presence of antagonistic activity against 4 test-strains of opportunistic bacteria by a photometric method. The effect of water extracts of microalgae Astermonas gracilis on the speed of self-purification of brine from Escherichia coli as well as antibacterial activity of peloid were evaluated under co-cultivation conditions. Results. Pure cultures of green unicellular algae Scenedesmus obliquus (Turpin) Kutz, Scenedesmus magnus Meyen var. magnus, Pediastrum duplex Meyen var. duplex, Chlorella vulgaris Bory, Monoraphidium arcuatum (Korschikov) Hindak (=Ankistrodesmus arcuatus Korschikov), Dictyosphaerium sp. had the most pronounced antagonistic activity against opportunistic bacteria. Water extract of A. gracilis microalgae accelerated brine self-purification from E. coli due to antibacterial effect. Peloid containing extracts of microorganism cells had a pronounced antibacterial effect against opportunistic bacteria. Conclusion. Antagonistic substances localized inside cells of microalgae increased the speed of allochthonic microorganism elimination that is one of the mechanisms of self-purification of a basin and antibacterial effect of peloid. The novel green microalgae strains studied due to the presence of pronounced antagonistic activity may have a wide practical application.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 4, P. 72—76
Key words: green unicellular microalgae, antagonism, antibacterial effect, self-purification, basin, peloid
В настоящее время особое внимание уделяется изучению механизмов, лежащих в основе резистентности патогенных бактерий к антибактериальным препаратам, а также поиску новых природных соединений, обладающих антибактериальной активностью [14].
Исследование внеклеточных метаболитов и клеточных экстрактов морских и пресноводных микроводорослей как источника биологически активных веществ, используемых в терапевтических целях, были начаты в середине XX века и не утратили своей актуальности по сегодняшний день [2, 11]. В настоящее время доказана их антибактериальная, антипротозойная, антиплазмодиальная, противогрибковая, противовирусная активность [15, 16]. Исследуется биохимическая природа этих явлений. Так, первым биологически активным веществом с выраженной антибактериальной активностью в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, выделенным из культуры микроводорослей рода Chlorella, был хлореллин, представляющим собой смесь жирных кислот. В последующем было установлено, что антибактериальной активностью обладают также продуцируемые водорослями низкомолекулярные метаболиты (глицерогликолипиды, диацилглицерины, моногалактозилдиацилглицерины, дигалактозилдиацилглицерины, свободные стерины, сульфохиновозилдиацилглицерины, триацилглицерины и др.), фотосинтетические пигменты (а- и Р-каротиноиды, фукоксантин, астаксантин), фенольные соединения (полифенолы и их производные, тонины), свободные аминокислоты и др. [6, 13]. Кроме того, следует отметить, что использование микроводорослей как источника противомикробных соединений, обусловленное, прежде всего, их способностью синтезировать данные вещества в культуральных условиях, позволяет рассматривать их как перспективный объект управляемого биосинтеза [1, 4].
Проблема поиска новых штаммов и соединений, представляющих потенциальный интерес для медицины в качестве перспективных противомикробных агентов, является актуальной. Исходя из этого, целью настоящего исследования является скрининг новых штаммов микроводорослей на наличие выраженной антибактериальной активности.
Объектом исследования послужили чистые культуры пресноводных и галофильных микроводорослей отдела Chlorophyta, выделенные из природных водоемов Оренбургской области. Среди них: Chlorococcum infusionum (Schrank) Menegh., Chlamydomonas reinhar-dii P.A. Dang., Scenedesmus obliquus (Turpin) Ktitz, Pediastrum duplex Meyen var. duplex, Coelastrum microporum Nageli, Dictyosphaerium sp., Chlorella vulgaris Bory, Monoraphidium arcuatum (Korschikov) Hindak (=Ankistrodesmus arcuatus Korschikov), Scenedesmus magnus Meyen var. magnus (= S. quadricauda var. setosus Kirchn.), Dunaliella parva Lerche, Asteromonas gracilis Artari.
Культуры микроводорослей были выделены из поверхностных проб воды с помощью батометра Руттнера с глубины не более 50 см. Идентификацию водорослей проводили на основании их фенотипических свойств в соответствии с определителями серии [7, 10, 12]. Альгологически чистые культуры получали методом механического разобщения шпателем на соответствующих плотных питательных средах или отсаживанием единичных клеток с помощью микроманипулятора при микроскопии.
Экспериментальные исследования проводили с использованием аксенически чистых культур водорослей. Антагонистическую активность водных экстрактов исследуемых культур микроводорослей оценивали фотометрическим методом [1]. Клеточные экстракты получали путем центрифугирования жидкой культуры, ресуспендирования клеток в дистиллированной воде с последующим замораживанием-оттаиванием. Полученные экстракты в объеме 0,4 мл вносили в смесь 2,5 мл мясо-пептонного бульона с 0,1 мл (109/мл) взвеси условно патогенных бактерий. В качестве контрольных проб к 0,1 мл взвеси тест-штаммов добавляли 0,4 мл среды, используемой для приготовления экстрактов. Опытные и контрольные пробы культивировали в течение 24 часов при температуре 37°С, а затем определяли оптическую плотность образцов на фотометре ИФА-ОЭП при длине волны 492 нм. По подавлению роста в опытных пробах, по сравнению с контрольными, судили о наличии антагонистической активности. В качестве тест-объектов использовали штаммы грамотрицательных и грамположительных условно патогенных бактерий (Escherichia coli, Klebsiella ozaenae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus) из коллекции культур микроорганизмов лаборатории водной микробиологии Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН.
Экспериментальное сокультивирование осуществляли при температуре 25°С в безбактериальной воде с уровнем минерализации 120 г/л, полученной путем мембранной фильтрации и автоклавирования рапы соленого озера Тузлучное (Оренбургская область).
Исходная концентрация условно патогенных бактерий составила 105 КОЕ/мл. В качестве контроля использовали тест-штамм в безбактериальной рапе, не содержащей микроводоросли. Учет вели по количеству выросших колоний E. coli на среде Эндо. В первые 4 часа высевы делали через каждый час, а в последующем с периодичностью в 2 ч. Для определения антимикробной активности грязи использовали разведенную 0,9% раствором NaCl (в соотношении 1:1) и профильтрованную через крупнопористый фильтр нативную грязь озера Тузлучное.
Экспериментально исследована антагонистическая (антибактериальная) активность по отношению к условно патогенным бактериям E. coli, K. ozaenae, P. aeruginosa, S. aureus у клеточных экстрактов 11 культур водорослей, принадлежащих к отделу Chlorophyta, 9 из которых являются пресноводными (S. obliquus, S. magnus var. magnus, C. microporum, P. duplex var. duplex, C. infusionum, C. vulgaris, M. arcuatum, Dictyosphaerium sp., C. reinhar-dii), а 2 культуры: A. gracilis, D. parva — галофильными.
В результате выявлено, что антагонистическое действие на отдельных представителей условно патогенных бактерий оказывали 100% изученных культур. Однако спектр антибактериальной активности клеточных экстрактов разных видов, а также чувствительность условно патогенных бактерий отличались. Установлено, что клеточные экстракты всех исследуемых штаммов водорослей оказывали высокое ингибирующее воздействие на E. coli, подавляя рост на 60 — 95%. Под влиянием экстрактов Dictyosphaerium sp., C. vulgaris, M. arcuatum отмечали максимальную задержку роста кишечной палочки (более 90%). Также среди изученных культур зеленых водорослей, за исключением D. parva, была отмечена широкая распространенность антагонистической активности по отношению к S. aureus (38,5 — 94,5%). По отношению к K. ozaenae антагонистическую активность проявляли 73% штаммов, максимальная активность была зарегистрирована у клеточных экстрактов культур P. duplex var. duplex, Dictyosphaerium sp., C. vulgaris (ингибирование роста бактерий свыше 90%). Клеточные экстракты культур S. obliquus, S. magnus var. magnus и M. arcuatum ингибировали рост K. ozaenae в среднем на 50%. Экстракты C. microporum, C. infusionum, C. reinhardii, A. gracilis, D. parva не обладали антагонистической активностью (снижение роста менее чем на 20%). Клеточные экстракты этих же культур водорослей обладали столь же низкой антагонистической активностью и по отношению к P. aeruginosa, тогда как экстракты S. obliquus, S. magnus var. magnus, P. duplex var. duplex, C. vulgaris, M. arcuatum, Dictyosphaerium sp. подавляли рост псевдомонад на 81,2 — 96,7%. В целом, хлорококковые водоросли S. obliquus, S. magnus var. magnus, P. duplex var. duplex, C. vulgaris, M. arcuatum, Dictyosphaerium sp. обладали более выраженной антагонистической активностью по отношению к условно патогенным бактериям, по сравнению с вольвоксовыми — C. reinhardii, A. gracilis, D. parva.
Антагонистическая активность микроводорослей имеет значение в самоочищении водоемов от фекального загрязнения, поскольку водоросли, обладающие данным признаком, способны подавлять развитие условно патогенных и энтеропатогенных сани-тарно-показательных бактерий, что обусловливает их активное участие в поддержании санитарно-гигиенических характеристик природных водоемов. Ранее на примере гало-фильной водоросли D.salina нами было показано ускорение элиминации E. coli из рапы [8], аналогичный эффект был отмечен и для экстракта клеток другой галофильной микроводоросли A. gracilis. Губительный эффект экстракта клеток A. gracilis на аллохтонную микрофлору укорачивал сроки сохранения E. coli в рапе, способствуя более быстрой элиминации, что, вероятно, происходило за счет высвобождения внутриклеточных антагонистических веществ при разрушении водорослевых клеток, о чем свидетельствует отсутствие антагонистического действия под влиянием живой культуры A. gracilis. Более выраженный эффект действия клеточных экстрактов по сравнению с супернатантами отмечали и ранее у водорослей Microcystis aeruginosa, Platimonas viridis, Nephrochloris salina
[3].
Внутриклеточно локализованные вещества, выделяющиеся при разрушении микроводорослей, могут также играть роль в обеспечении антибактериального действия пелои-да. Описана также способность пелоидов к самоочищению [9]. Исходя из этого, нами было оценено бактерицидное влияние пелоида по отношению к условно патогенным
бактериям на примере лечебной грязи оз. Тузлучное. Отмечено, что длительность сохранения E. coli уменьшалась до 24 часов в опытной пробе по сравнению с контролем (стерильная рапа), в котором кишечная палочка сохранялась 76 часов. Таким образом, грязь озера Тузлучное ускоряла элиминацию условно патогенных бактерий из рапы. Антибактериальное действие пелоида оз. Тузлучное по отношению к условно патогенным микроорганизмам, с одной стороны, объясняет лечебный эффект грязи, а с другой стороны, ее способность к самоочищению. Учитывая, что большая часть пелоида оз. Тузлучное представлена клеточными экстрактами гидробионтов, можно заключить, что его бактерицидные свойства связаны не только с высокой минерализацией среды, а также с биологически активными веществами организменного происхождения, обладающими антагонистическим влиянием на условно патогенные бактерии.
Согласно литературным данным, антибиотическая активность зеленых водорослей определяется пигментами, ненасыщенными жирными кислотами, входящими в состав липидов водорослевых клеток, фенольными соединениями, аминокислотами и др. [5]. В результате окисления хлорофилла и свободных жирных кислот синтезируются вещества, обладающие антибактериальным эффектом. Имеются сведения, что максимальное содержание свободных жирных кислот в культуральной жидкости водорослей достигается в стационарную фазу роста и напрямую связано с процессами автолиза [5]. Примером бактерицидного действия белково-хлорофилльного комплекса является ингибирование роста бактерий Pseudomonas saccharophila под действием водорослей D. maritima [5].
Исходя из выше сказанного, можно полагать, что подавление роста условно патогенных бактерий в эксперименте в присутствии водорослевых экстрактов происходит под действием внутриклеточно локализованных бактериостатических или бактерицидных веществ, выделяющихся в среду в результате разрушения клеток водорослей, что может происходить в естественных условиях водоема.
Учитывая, что в условиях борьбы за экологическую нишу на одну из ведущих позиций выходит антагонизм, обеспечивающий доминирование конкурентоспособных видов в сообществе, можно заключить, что вещества, выделяющиеся из разрушенных клеток автохтонных водорослей, обеспечивают резистентность биотопа к заселению аллохтон-ными микроорганизмами и стабильность структуры биоценоза. Скорость элиминации аллохтонных микроорганизмов может значительно повышаться при массовом отмирании микроводорослей, что является одним из механизмов самоочищения водоема.
Таким образом, исследованные новые штаммы зеленых микроводорослей, благодаря наличию у них выраженной антагонистической активности, могут иметь широкое практическое применение, связанное с доочисткой сточных вод в системах очистных сооружений.
Работа выполнена при поддержке грантов по программе фундаментальных исследований Президиума РАН «Живая природа: современное состояние и проблемы развития» проект № 12-П-4-1039, по Программе инициативных проектов фундаментальных исследований Уральского отделения РАН проект № 12-У-4-1031, инновационного проекта для молодых ученых УрО РАН № 14-4-ИП-25.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бухарин О.В., Черкасов С.В., Сгибнев А.В. и др. Влияние микробных метаболитов на активность каталазы и рост Staphylococcus aureus 6538 P. Бюлл. эксп. биол. мед. 2000, 130 (7): 80-82.
2. Волошко Л.Н., Плющ А.В., Титова Н.Н. Токсины цианобактерий (Cyanobacteria, Cyanophyta). Альгология. 2008, 18 (1): 3-20.
3. Гольдин Е.Б., Гольдина В.Г. Антибактериальные свойства метаболитов водорослей в модельных экспериментах. Альгология. 1999, 9 (2): 34.
4. Макарова Е.И., Отурина И.П., Сидякин А.И. Прикладные аспекты применения микроводорослей — обитателей водных экосистем. Экосистемы, их оптимизация и охрана. 2009, 20: 120-133.
5. Максимова И.В., Сидорова О.А. Светозависимый антибактериальный эффект водорослей и его экологическое значение (обзор). Гидробиологический журнал. 1986, 22 (6): 3-11.
6. Мартыяс Е.А. Биологическая активность липидов и фотосинтетических пигментов водорослей дальневосточных морей. Автореф. дис. канд. биол. наук. Владивосток, 2012.
7. Масюк Н.П. Морфология, систематика, экология, географическое распространение рода Dunaliella Teod. и перспективы практического использования. Киев, Наукова думка, 1973.
8. Немцева Н.В., Селиванова Е.А., Плотников А.О. Роль симбиотических взаимодействий в выживании микроорганизмов в гипергалинных водоемах. Журн. микробиол. 2006, 4: 117-120.
9. Новожилова М.И., Фролова Л.Ф. Микрофлора лечебных грязей Казахстана. Алма-Ата, Наука, 1975.
10. Определитель пресноводных водорослей СССР. Под ред. М.М. Голлербаха. М.-Л., Изд-во АН СССР, 1951 — I986.
11. Пономаренко С.П., Паршикова ТВ. Экспресс-оценка эффективности биологически активных веществ на тест-культурах водорослей. Альгология. 2001, 1 1(4): 495-501.
12. Царенко П. М. Краткий определитель хлорококковых водорослей Украинской ССР. Киев, Наукова думка, 1990.
13. Alghazeer R., Whida F., Abduelrhman E. et al. Screening of antibacterial activity in marine green, red and brown macroalgae from the western coast of Libya. Natural Science. 2013, 5 (1): 7-14.
14. Amaro H.M., Guedes A.C., Malcata F.X. Antimicrobial activities ofmicroalgae: an invited review. Science against microbial pathogens: communicating current research and technological advances. A. Mйndez-Vilas (ed.), 2011.
15. Christobel G.J., Lipton A.P., Aishwarya M.S. et al. Antibacterial activity of aqueous extract from selected macroalgae of southwest coast of India. Seaweed Res. Utilization. 2011, 33: 67-75.
16. Ghasemi Y., Moradian A., Mohagheghzadeh A. et al. Antifungal and antibacterial activity ofthe micro-algae collected from paddy fields of Iran: characterization of antimicrobial activity of Chroococcus disperses. J. Biological Sciences. 2007, 7 (6): 904-910.
Поступила 20.01.14
Контактная информация: Немцева Наталия Вячеславовна, д.м.н., проф.,
460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11, р.т. (3532)77-54-17
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
Т.М.Уткина, Л.П.Потехина, О.Л.Карташова, А.С.Васильченко
ХАРАКТЕРИСТИКА МЕХАНИЗМОВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЦИКЛОФЕРОНА
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург
Цель. Изучение влияния циклоферона в экспериментальных и клинических условиях на перси-стентные свойства золотистых стафилококков, а также особенностей их морфофункциональной реакции методом атомно-силовой микроскопии. Материалы и методы. Исследования проведены на 12 клонах Staphylococcus aureus, выделенного со слизистой оболочки переднего отдела носа резидентного бактерионосителя. Влияние циклоферона in vivo оценено на 26 резидентных стафилококковых бактерионосителях под контролем антикарнозиновой активности стафилококков. Антикарнозиновую активность определяли по Бухарину О.В. и др. (1999), биопленкообразование — по O'Toole G.A. et al. (2000). Обработанные циклофероном стафилококки исследовали методом атомно-силовой микроскопии в контактном режиме с использованием сканирующего зондового микроскопа SMM-2000. Результаты. Снижение персистентных свойств стафилококков под воздействием циклоферона в условиях in vitro и in vivo может рассматриваться в качестве одного из механизмов биологической активности препарата. Выявлено значительное увеличение шероховатости поверхности S.aureus и изменение их морфологии под воздействием циклоферона, что позволяет констатировать нарушение барьерных функций клеточной стенки золотистых стафилококков. Заключение. Полученные данные расширяют представления о механизмах биологической активности циклоферона.
Журн. микробиол., 2014, № 4, С. 76—79
Ключевые слова: Staphylococcus aureus, циклоферон, факторы персистенции, атомно-силовая микроскопия
T.M.Utkina, L.P.Potekhina, O.L.Kartashova, A.S.Vasilchenko CYCLOFERON BIOLOGICAL ACTIVITY CHARACTERISTICS
Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia
Aim. Study the effect of cycloferon in experimental and clinical conditions on persistence properties of aurococci as well as features of their morpho-functional reaction by atomic force microscopy. Materials and methods. The study was carried out in 12 Staphylococcus aureus clones isolated from mucous membrane of
