CC BY
36
Экспериментальная медицина
Таблица 6
Содержание у-глобулинов (г/л)
Группы животных До операции 5-е сутки 10-е сутки 20-е сутки 30-е сутки 60-е сутки 180-е сутки
Сравнения 7,61±0,30 7,59±1,46 9,52±0,54 10,83±0,61 8,91±0,48+ 9,84±0,64 15,57±0,55***
Опытная 6,96±0,33 7,27±0,26 6,85±0,53 9,77±1,12 7,12±0,39 6,96±0,68 11,49±1,58*
Примечание. Статистическая значимость различий с дооперационными значениями: *р <0,05; **р <0,01; ***р <0,001.
мое различие между животными разных групп наблюдалось на 10-е (р=0,008), 30-е (р=0,02) и 60-е (р=0,015) сутки. Фракция у-глобулинов содержит преимущественно ^^ и её повышение отражает мобилизацию специфических иммунных защитных механизмов.
ВЫВОДЫ
1. На фоне неизменного уровня общего белка после перенесённой травмы и развития процесса регенерации мы наблюдали характерную для ответа острой фазы диспротеинемию — изменение соотношения белковых фракций крови. Выявлено две «волны» реакции. Первая развивалась к 5-м суткам и характеризовалась снижением уровня альбуминов и повышением содержания а- и Р2-глобулинов, эта реакция затухала в опытной группе раньше, чем в группе сравнения. Вторая развивалась к 180-м суткам и характеризовалась повышением концентрации Р2- и у-глобулинов.
2. Наблюдаемые сдвиги соответствовали фазам раннего неспецифического ответа, включающего усиление синтеза положительных и снижение образования отрицательных реактантов острой фазы воспаления печенью под влиянием цитокинов, а также более позднему специфическому адаптивному иммунному ответу.
3. В целом интенсивность реакций в опытной группе была меньше, чем в группе сравнения. Более продолжительное снижение уровня альбуминов и выраженный рост содержания у-глобулинов в группе сравнения свидетельствуют о меньшем повреждающем стимуле при использовании имплантатов с покрытием нитридами титана и гафния.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ключевский В.В. Хирургия повреждений. — Ярославль, Рыбинск, 2004. — 784 с.
2. Лазарев А.Ф., Солод Э.И, Ахтямов И.Ф. Рациональный остеосинтез. — Казань: Скрипта, 2010. — 256 с.
3. Anderson J.M., Rodriguez A, Chang D.T. Foreign body reaction to biomaterials // Semin. Immunol. — 2008. — Vol. 20, N 2. — Р. 86-100.
4. Gabay C, Kushner I. Acute phase proteins and other systemic responses to inflammation // NEJM. — 1999. — Vol. 340. — Р. 448-454.
5. Gruys E, ToussaintM.J.M., Niewold T.A., Koopmans S.J. Acute phase reaction and acute phase proteins // J. Zhejiang Univ. Sci. B. — 2005. — Vol. 6, N 11. — P. 1045-1056.
6. O'Connel T.X., Horita T.J, Kasravi B. Understanding and interpreting serum protein electrophoresis // Am. Fam. Physician. — 2005. — Vol. 71, N 1. — P. 105-112.
7. Toussaint M.J.M. Acute phase protein in different species measured as a tool to assess animal health // Eur. Coll. Report. — 2000. — Vol. 1. — P. 1-3.
УДК 612.017.1: 612.084: 616-053.3-053.1-022: 616.9-092.9 Е06
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ИММУННОГО СТАТУСА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ АНТИГЕНОВ TOXOPLASMA GONDII В ПРЕНАТАЛЬНОМ И РАННЕМ ПОСТНАТАЛЬНОМ ПЕРИОДАХ
Татьяна Фёдоровна Соколова, Дмитрий Георгиевич Новиков *, Антон Васильевич Индутный Омская государственная медицинская академия
Реферат
Цель. Определить особенности иммунного статуса в пренатальном и раннем постнатальном периодах при воздействии антигенов Toxoplasma Gondii (T gondii).
Методы. Исследование проводили на потомстве белых крыс линии Wistar, рождённых от самок, сенсибилизированных в Ш триместре беременности корпускулярным антигеном T. gondii, — первая группа (n=96), а также на особях, которым данный антиген вводили в возрасте 1 день, — вторая группа (n=103). Группу контроля составили интактные крысы. На 60-е сутки после рождения проводили гематологический анализ, оценивали количество антителообразующих клеток и клеток CD3+у исследуемых животных.
Результаты. Количество нейтрофилов в крови крыс первой группы было в 1,9 раза выше, чем у особей второй группы. Содержание эозинофилов было в 1,4 раза ниже в первой группе (р=0,01) и в 2 раза ниже во второй группе (по сравнению с группой контроля, р=0,002). Одновременно количество лимфоцитов у животных из первой группы было сопоставимо со значениями в группе контроля, а во второй группе значение этого показателя оказалось в 1,4 раза ниже контроля (р=0,04). Вместе с тем в обеих группах было отмечено снижение уровня лимфоцитов CD3+
Адрес для переписки: [email protected] 398
и антителообразующих клеток в крови и селезёнке, носившее более выраженный характер во второй группе. У потомства крыс, рождённого от самок, сенсибилизированных корпускулярным антигеном T. gondii в Ш триместре беременности, отмечены лимфаденопатия, дисплазия вилочковой железы, уменьшение количества Т-лимфоцитов в селезёнке и крови, снижение показателей гуморального иммунитета.
Вывод. Последствия действия корпускулярного антигена T. gondii на крыс в перинатальном периоде проявляются вторичным иммунодефицитным состоянием, сохраняющимся на 60-е сутки онтогенеза.
Ключевые слова: Toxoplasma gondii, иммунный ответ, пренатальный период, ранний постнатальный период, эксперименты на живых организмах.
INFLUENCE OF TOXOPLASMA GONDII ANTIGENS ON FEATURES OF IMMUNE STATUS AT PRENATAL AND EARLY POSTNATAL PERIODS: EXPERIMENTAL STUDY T.F. Sokolova, D.G. Novikov, A.V. Indutny. Omsk State Medical Academy, Omsk, Russia. Aim. To detect the features of immune status at prenatal and early postnatal periods under the influence of Toxoplasma gondii antigens. Methods. The experimental study was performed on Wistar white rats, who were the offspring of the female rats who were sensitized by T. gondii corpuscular antigen during the Ш trimester of pregnancy — group 1 (n=96) and on animals who were administered T. gondii corpuscular antigen at firs day of life — group 2 (n=103). Control group consisted of intact rats. Common blood test, levels of antibody-forming cells and CD3+ cells were assessed at 60 day after birth. Results. Neutrophil blood count was 1.9 times higher in the group 1 rats compared to group 2. Eosinophil blood count was 1.4 times lower in the group 1 compared to control group (р=0.01), and 2 times lower in the group 2 compared to control group (р=0.002). At the same time, lymphocyte count was comparable in the group 1 rats and control group, while it was 1.4 times lower in the group 2 compared to control group (р=0.04). Together with that, there was a reduction of CD3+ cells and antibody-forming cells in blood and spleen, which was more marked in the 2nd group. Lymphoadenopathy, thymus dysgenesia, reduced blood and spleen T-cells levels, low humeral immunity were found in Wi-star white rats, who were the offspring of the female rats who were sensitized by T. gondii corpuscular antigen during the Ш trimester of pregnancy. Conclusion. The influence T. gondii corpuscular antigen on rats during perinatal period results in secondary immunodeficiency, persisting at 60 day of life.
Keywords: Toxoplasma gondii, immune response, prenatal period, early postnatal period, animal experiments.
Токсоплазмоз — одна из причин врождённых пороков развития, формирования иммунологической патологии в раннем и отдалённом периодах детства [4]. Развитие токсоплазмоза чаще всего происходит на фоне иммуносупрес-сии и определяется состоянием Т-клеточного звена иммунитета [1]. К настоящему времени существуют данные о преобладании типа Th1 иммунного ответа при развитии токсоплазмоза [7]. Механизм такой поляризации тесно связан с синтезом интерлейкина-12, обусловленным активацией эндосомальных рецепторов TLR-11 и -12 в дендритных клетках [9]. Подобный процесс обеспечивает активацию клеток CD4+ и продукцию ими интерферона у, необходимого для NO-зависимого киллинга Toxop.asma Gondii (T. gondii) в паразитофорных везикулах макрофагов [9]. Важная роль в синтезе интерферона у принадлежит также нейтрофильным лейкоцитам, однако механизм стимуляции его образования до сих пор остаётся невыясненным [8, 9]. У детей, рождённых от женщин с токсоплазмозом, регистрируют сочетанные иммунные нарушения в виде снижения количества фагоцитирующих клеток, уменьшения показателей Т-клеточного звена иммунитета с недостаточностью абсолютного содержания клеток CD3+ и CD4+[1]. Однако связь между пренатальным и ранним постнатальным воздействием антигенов (АГ) T. gondii на органы иммунной системы плода и новорождённого и их функционированием в постнатальном периоде изучены недостаточно хорошо.
Цель исследования — определить особенности иммунного статуса в пренатальном и раннем постнатальном периодах при воздействии АГ T. gondii.
Экспериментальное исследование проведено на потомстве белых крыс линии Wistar, составившем две исследуемые и одну контрольную
группы. В каждой группе было проведено две серии эксперимента. В исследуемую первую группу были включены крысята (n=52), рождённые от самок, которым в III триместре беременности был введён корпускулярный АГ T. gondii (ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, Москва) в дозе 1х 107 клеток внутрибрю-шинно (в/б). Во второй группе АГ T. gondii в дозе 1х 105 клеток был введён новорождённым крысятам в возрасте 1 день (n=55). В группу контроля были включены интактные животные, сопоставимые по полу и возрасту (n=62).
Во второй серии эксперимента за 5 сут до эвтаназии животным из исследуемых и контрольной групп были введены эритроциты барана в количестве 3х 109 клеток (количество животных в первой, второй и контрольной группах составило 44, 48 и 55 соответственно).
Эксперимент выполняли с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС). Взятие биологического материала (кровь, вилоч-ковая железа, селезёнка, брыжеечные лимфатические узлы) проводили на 60-е сутки после рождения животных. Гематологический анализ выполняли с использованием анализатора Ex-cell-22 (США). Число клеток CD3+в крови и стандартной взвеси спленоцитов подсчитывали на проточном цитометре (Cytomics FC500, Beckman Coulter, США). Количество антителообразующих клеток, секретирующих иммуноглобулин М к эритроцитам барана, в селезёнке определяли на пике иммунного ответа через 5 дней после иммунизации крыс при помощи прямого метода локального гемолиза по Cunningham [2].
Статистическую оценку осуществляли с помощью параметрических и непараметрических методов. Различия оценивали как значимые при p <0,05.
| Экспериментальная медицина_
Таблица 1
Показатели системы крови и иммунитета у потомства крыс после ведения антигена T. gondii в пренатальном и
раннем постнатальном периодах онтогенеза
Показатель Группа контроля Экспериментальные группы
Первая группа Вторая группа
Лейкоциты, х109/л 5,3±0,4 7,5±0,3* 7,7±0,4*
Нейтрофилы, % 19,7±1,4 22,8±3,3 42,9±3,3*,**
Моноциты, % 6,2 (4,2; 7,2) 5,4 (5,1; 7,2) 5,6 (5,2; 7,4)
Эозинофилы, % 2,4±0,2 1,7±0,1* 1,2±0,1*,**
Базофилы, % 1,7±0,2 2,3±0,8 2,2±0,4
Лимфоциты, % 68,9±1,8 65,3±2,0 49,7±2,4*,**
Т-лимфоциты (CD3+) в крови, % 95,9±0,8 76,6±2,0* 83,1±0,6*,**
Т-лимфоциты (CD3+) в селезёнке, % 81,3±1,9 62,9±2,9* 69,3±0,9*,**
Антителообразующие клетки, х103 58,1±3,2 41,9±2,9* 46,7±2,3*
Примечание: М±т — для нормального распределения; Ме (1-й; 3-й квартили) — для распределения, отличающегося от нормального; статистическая значимость различий ф <0,05): *по отношению к группе контроля, **между экспериментальными группами.
В первой серии эксперимента было показано, что потомство крыс, перинатальное развитие которых происходило в условиях введения АГ T. gondii, оказалось менее жизнеспособным, чем в группе контроля: в течение 3 сут после рождения в первой и второй группах погибли 5 и 6 животных соответственно.
Во второй серии эксперимента также наблюдалась гибель части потомства: 3 животных в первой группе и 1 животное во второй группе погибли на 1-3-и сутки. Вероятно, гибель животных связана со срывом функциональных возможностей незрелой иммунной системы в результате воздействия высоких доз АГ.
Как у животных, рождённых от сенсибилизированных АГ T. gondii самок, так и у крысят, которым вводили АГ после рождения, в 2-месячном возрасте при ревизии брюшной полости было выявлено увеличение брыжеечных лимфатических узлов, образующих конгломераты в виде тяжей, расположенных вдоль кишечника. Селезёнка животных в первой и второй сериях экспериментов имела зернистую структуру, визуализировались фолликулы. Масса вилочковой железы у потомства сенотбилизированных самок была снижена (173,9±9,8 против 244,3±11,7 мг в группе контроля, р=0,002), а у крысят, которым АГ T. gondii был введён после рождения, не разнилась с контролем.
Введение АГ T. gondii экспериментальным животным как в пренатальном, так и в раннем постнатальном периодах сопровождалось отсроченными изменениями показателей системы иммунитета 2-месячных крыс (табл. 1).
Количество лейкоцитов у потомства крыс, развитие которых происходило в условиях внутриутробного действия АГ T. gondii, было в 1,4 раза выше, чем в группе контроля (р=0,009).
Аналогичные отсроченные изменения зарегистрированы и у крысят, которым вводили АГ T. gondii после рождения. Количество лейкоцитов у них превышало значения в группе контроля в
1,5 раза (р=0,04), что было обусловлено 2,2-кратным увеличением количества нейтрофилов (р=0,001). Количество последних в крови крысят из второй группы было в 1,9 раза выше, чем в первой группе. При этом число моноцитов и базофилов в обеих экспериментальных группах соответствовало значениям в группе контроля, количество эозинофилов было в 1,4 раза (первая группа, р=0,01) и 2 раза (вторая группа, р=0,002) ниже в сравнении с группой контроля.
Уменьшение содержания эозинофилов в крови отражает снижение резистентности организма к воздействию факторов внешней среды, что в сочетании с лейкоцитозом, обусловленным повышением количества нейтрофилов, является важным признаком активного воспаления. Полученные результаты согласуются с данными недавних исследований, показавших значительную роль нейтрофилов в синтезе интерферона у, необходимого для реализации врождённого иммунитета к T. gondii [9].
Количество лимфоцитов в первой группе было сопоставимо со значениями, полученными в группе контроля. В отличие от этого при введении АГ T. gondii после рождения во второй группе регистрировалась относительная лимфопения с уменьшением показателей в 1,4 раза (р=0,04) по сравнению с группой контроля и в 1,3 раза (р=0,04) по сравнению с первой группой.
При оценке популяции Т-клеток в крови и селезёнке у крыс из первой группы было выявлено уменьшение количества лимфоцитов CD3+ в крови на 20,1% (р=0,003) и в селезёнке на 22,6% (р=0,0004, см. табл. 1) в сравнении с группой контроля. При исследовании иммунологических показателей у животных второй группы отмечено уменьшение количества Т-лимфоцитов крови на 13,3% (р=0,01) и числа Т-лимфоцитов селезёнки на 14,8% (р=0,043) по сравнению с контрольными величинами. Следует отметить, что снижение количества лимфоцитов CD3+ в крови и селезёнке было более значимо в первой группе — при внут-
риутробном действии АГ T. gondii, составляя в крови 92,2%, в селезёнке — 90,8% показателей во второй группе.
При оценке влияния АГ T. gondii, введённого в пренатальном и раннем постнатальном периодах, на гуморальный иммунный ответ к эритроцитам барана обнаружена депрессия специфического антителообразования, что проявлялось снижением числа антителообразующих клеток на пике первичного иммунного ответа у крысят первой группы на 27,9% (р=0,03). Количество ан-тителообразующих клеток у крысят второй группы было снижено на 19,6% (р=0,04).
Последствия действия АГ T. gondii на иммунную систему плода и новорождённого зарегистрированы у крысят на 60-е сутки постнатального онтогенеза. Они проявлялись лимфаденопатией, дисплазией вилочковой железы, структурными нарушениями селезёнки и уменьшением количества Т-лимфоцитов в ней, Т-лимфопенией, дисфункцией гуморального звена иммунитета с недостаточной генерацией антителообразующих клеток в ответ на тимусзависимые АГ. Аналогичные изменения иммунного гомеостаза (атрофия вилочковой железы, сочетанные иммунные нарушения в виде снижения количества фагоцитирующих клеток, уменьшения показателей Т-клеточного звена иммунитета с недостаточностью абсолютного содержания клеток CD3+ и CD4+) выявлены у детей, рождённых от женщин с токсоплазменной инфекцией [1].
Отсроченные нарушения неспецифических факторов защиты и адаптивного иммунитета у крысят при введении им АГ T. gondii в первые сутки после рождения реализовались нейтро-фильным лейкоцитозом, эозинопенией, лимфо-пенией, депрессией клеточного и гуморального звеньев иммунитета. Следует отметить отсутствие дисплазии вилочковой железы у крысят при воздействии АГ T. gondii в пренатальном периоде, а также менее выраженное, с различием 7-9%, снижение количества Т-лимфоцитов в крови и селезёнке.
Выявленные нарушения клеточного и гуморального звеньев иммунитета, сохраняющиеся длительное время после рождения, можно охарактеризовать как стадию декомпенсации адаптационных реакций иммунной системы и развитие вторичного иммунодефицитного состояния у крысят, подвергшихся действию АГ T. gondii как в пренатальном, так и в раннем постнатальном периодах. Подобные сдвиги в целом являются стереотипным ответом на введение АГ, проявляющимся поляризацией иммунного ответа по ТЫ-типу и завершающимся развитием иммунологической толерантности к АГ у плода [5] и новорождённого [6].
Обнаруженные нами отличия морфофунк-
циональных характеристик иммунной системы у потомства крыс при воздействии АГ T. gondii в пренатальном и раннем постнатальном периодах, вероятно, связаны как с разной степенью зрелости иммунитета плода и новорождённого, так и с особенностями влияния данного АГ [3].
ВЫВОДЫ
1. Последствия действия антигена T. gondii на плод и новорождённую крысу проявляются вторичным иммунодефицитным состоянием, сохраняющимся на 60-е сутки онтогенеза.
2. Нарушения иммунитета у потомства крыс, рождённого от сенсибилизированных антигеном T. gondii в III триместре беременности самок, характеризуются лимфаденопатией, дисплазией вилочковой железы, уменьшением количества Т-лимфоцитов в селезёнке и крови, снижением гуморального иммунитета.
3. При введении антигена T. gondii в раннем постнатальном периоде отдалённые последствия его действия проявляются нейтрофильным лейкоцитозом, эозинопенией, лимфопенией, а также менее выраженными, чем при введении антигена T. gondii в пренатальном периоде, проявлениями депрессии клеточного и гуморального звеньев иммунитета.
ЛИТЕРАТУРА
1. Барычева Л.Ю. Клинические и иммунологические особенности врождённого токсоплазмоза // Рос. вестн. перинатол. и педиатр. — 2004. — Т. 29, №2. — С. 55-59.
2. Лимфоциты: методы. Пер. с англ. / Под ред. Дж. Клауса. — М.: Мир, 1990. — 393 с.
3. Титов Л.П., Кирильчик ЕЮ., Канашкова Т.А. Особенности строения, развития и функционирования иммунной системы детского организма // Мед. новости. — 2009. — №5. — С. 7-16.
4. Chaudhry S.A., Gad N, Koren G. Toxoplasmosis and pregnancy // Can. Fam. Physician. — 2014. — Vol. 60, N 4. — Р. 334-336.
5. Dietert R.R., Piepenbrink M.S. The managed immune system: protecting the womb to delay the tomb // Hum. Exp. Toxicol. — 2008. — Vol. 27, N 2. — Р. 129-134.
6. Lisciandro J.G., van den Biggelaar A.H. Neonatal immune function and inflammatory illnesses in later life: lessons to be learnt from the developing world? // Clin. Exp. Allergy. — 2010. — Vol. 40, N 12. — Р. 1719-1731.
7. Raetz M, Hwang S.H., Wilhelm C.L. et al. Innate immunity to Toxoplasma gondii infection // Nat. Immunol. — 2013. — Vol. 14, N 2. — Р. 136-142.
8. Sturge C.R. TLR-independent neutrophil-derived IFNy is important for host resistance to intracellular pathogens // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2013. — Vol. 110. — Р. 10 711-10 716.
9. Yarovinsky F. Innate immunity to Toxoplasma gon-dii infection // Nat. Rev. Immunol. — 2014. Vol. 14, N 2. — Р. 109-121.
